Questo lavoro è stato supportato dal Wellcome Trust concessione 088.419 a MDB e la sponsorizzazione da parte di Smith &amp; Nephew UK Ltd.

1. Le superfici di rivestimento con Ligand Matrix <ol><li> Ultrasound sarà applicata alle cellule in 3,5-cm pozzi, sia come piatti individuali o come una piastra da 6 pozzetti. Per saggi biochimici, ligando strato direttamente sulla plastica. Per immunofluorescenza, vetro bollire coprioggetto tre volte in acqua MilliQ e 4 coprioggetti posto sul fondo di ciascun pozzetto. </li><li> Superfici di vetro deve essere derivatizzato per garantire rivestimento efficiente ligando. Sciogliere solfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide estere in PBS a 1 mM. Aggiungere 2 ml a ciascun pozzetto ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le superfici derivatizzati 3 volte con PBS. </li><li> Coat vetro oppure derivatizzato o plastica trattata con ligando integrina. Applicare 2 ml di 10 ug / ml integrina ligand9, disciolto in PBS contenente Ca 2 + e Mg 2 + a ciascun pozzetto ed incubare durante la notte a 4 ° C. </li><li> Preparare monoparticulate BSA riscaldando 1% BSA, disciolto in PBS, a 85 ° C per 13 minuti. Consentireraffreddare e poi passare attraverso un filtro da 0,45-um. </li><li> Lavare ligando superfici rivestite 3 volte con PBS e il blocco con BSA monoparticulate per 30 minuti. </li></ol> 2. Preparazione delle cellule <ol><li> Per controllare l&#39;ambiente di matrice durante l&#39;esperimento, la sintesi proteica deve essere bloccata mediante aggiunta di 25 pg / ml cicloeximide al 80% fibroblasti confluenti per 2 ore. </li><li> Risciacquare cicloeximide cellule trattate con PBS e staccare dal pallone di coltura utilizzando 0,5 mg / ml di tripsina / EDTA. </li><li> Cellule Harvest staccati di centrifugazione a 500x g per 5 minuti. </li><li> Risospendere le cellule in DMEM/25 HEPES mm, 25 mcg / ml cicloeximide. </li><li> Contare densità cellulare della sospensione utilizzando un emocitometro e diluire a 105 ml-1. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per 20 minuti per recuperare integrina superficie. </li><li> Risciacquare le ligando rivestita, BSA-bloccati pozzetti 3 volte con PBS. </li><li> Seme 2 ml della sospensione di cellule in ciascun pozzetto. </li><li> Allow celle a sviluppa per 2 ore a 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 3. Ultrasuoni Stimolazione <ol><li> Scaldare l&#39;array emettitore ultrasuoni e gel di accoppiamento a 37 ° C. </li><li> Applicare un pisello blob di gel ad ogni emettitore. </li><li> Verificare che ciascun emettitore è funzionale con un indicatore rivelatore ultrasuoni diodo. </li><li> Posizionare i pozzetti sulla matrice emettitore. Ritorna matrice a 37 ° C, 5% di CO 2 e temperatura consente di equilibrare per 10 minuti. </li><li> Accendere il segnale ad ultrasuoni. </li><li> Il segnale ad ultrasuoni si disattiva dopo 20 minuti, imitando il regime terapeutico. Se i tempi di stimolazione più brevi sono necessarie, le piastre devono essere rimossi dalla matrice al momento opportuno time-points. In tutti i casi non stimolate utilizzare piastre come controllo negativo. </li></ol> 4. Adesione Analisi focale mediante immunofluorescenza <ol><li> Per l&#39;analisi di formazione di adesione focale, applicare il 20-minuti segnale ultrasonicoe quindi consentire di sviluppare strutture per altri 40 minuti, mantenendo le cellule a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Aspirare media e fissare le cellule applicando 2 ml di paraformaldeide al 4% in PBS. Incubare per 14 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare paraformaldeide e sciacquare tre volte con PBS, applicando il PBS dolcemente lungo il bordo del pozzo per evitare la generazione di forze di taglio. </li><li> Trasferire ciascun coprioggetto da 3,5 cm e ad una piastra da 24 pozzetti per la successiva colorazione di immunofluorescenza. </li><li> Quench paraformaldeide residuo applicando 0,5 ml di 0,1 M glicina in PBS a ciascuno dei 24 pozzetti. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare glicina e sciacquare tre volte con PBS. </li><li> Permeabilise cellule applicando 0,5 ml 0,5% Triton X-100 (w / v) in PBS. Incubare per 4 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare Triton X-100 e sciacquare tre volte con PBS. </li><li> Bloccare applicando 0,5 ml 3% (w / v) BSA in PBS. Incubare per una notte a 4 &amp; deg; C. </li><li> Stain vinculin contenenti adesione focale con hVIN-1 anticorpo diluito 1:400 in blocco BSA. Incubare per un&#39;ora a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare tre volte con PBS. </li><li> Applicare fluoroforo (DyLight 488) coniugato anticorpo secondario (diluito 1:200) e actina macchia con TRITC coniugato phalloidin (diluito 1:200) nel blocco BSA. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare tre volte con PBS, e una volta con acqua. </li><li> Montare su un vetrino in posizione invertita utilizzando Prolungare mon-Gold. </li></ol> 5. Quantificazione di Rac1 Attivazione da Pull-down Assay <ol><li> Per l&#39;analisi di Rac1 attivazione, applicare il 20-minuti segnale ultrasonico a cellule a 37 ° C, 5% CO 2. Nel valutare tempi di reazione più lunghi di 20 minuti, applicare il segnale a ultrasuoni per 20 minuti e mantenere le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per il tempo rimanente per permettere la risposta di sviluppare. </li><li> Aspirare il terreno e luogo bens su ghiaccio. Sciacquare i pozzetti con 2 ml di PBS freddo e aspirato. Assicurarsi che ogni residuo PBS viene rimosso lasciando pozzi inclinati per 1 minuto seguito da aspirazione profonda. </li><li> Lisare le cellule su ghiaccio con 35 microlitri di tampone di lisi (10% glicerolo, 20 mM Hepes pH 7,4, 140 mM NaCl, 1% NP40, desossicolato di sodio allo 0,5%, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 × inibitore di proteasi completo) per pozzetto. In questo esempio, 6 pozzetti sono utilizzati per punto di tempo per generare 210 microlitri di lisato cellulare. Pozzi più o meno quelli che possono essere utilizzati, ma il volume totale di lisato dovrebbero ammontare a circa 200 microlitri. </li><li> Raschiare accuratamente le cellule con raschietto cella per assicurare completa lisi delle cellule e lasciare pozzi inclinato per 1 minuto per consentire lisato alla piscina. </li><li> Trasferire il lisato ad una ghiacciata 1,5 ml provetta per microcentrifuga (lisati pooling dal regime stesso trattamento) e centrifugare a 21000 × g per 2 minuti a 4 ° C a detriti pellet cellulare. </li><li> Trasferire 180 microlitri di lisato di ghiacciata 1,5 ml provette da microcentrifuga contenente 130 microlitri di tampone di lisi e 25 microlitri PAK-glutathione perline di agarosio 10. Mantenere rimanente lisato grezzo a -20 ° C per la successiva separazione gel. </li><li> Cattura Rac1 attivo sulle PAK perline di glutatione-agarosio ruotando provette per 40 minuti a 4 ° C. </li><li> Harvest agarosio tallone coniuga mediante centrifugazione a 2000 × g per 1 minuto a 4 ° C. </li><li> Wash tallone coniuga tre volte con 500 microlitri tampone di lisi, perline raccolta per centrifugazione a 2000x g e scartando supernatante dopo ogni lavaggio. Rimuovere con cautela qualsiasi residuo di lavaggio tampone di lisi con una pipetta 200 pl. </li><li> Eluire ciascun campione con l&#39;aggiunta di 35 microlitri SDS-PAGE di tampone di caricamento e incubare a 85 ° C su un blocco di calore agitazione per 5 minuti. Rimuovere perline per centrifugazione a 21.000 xg per 1 minuto. </li><li> Risolvere eluato tallone mediante SDS-PAGE, trasferimento in nitrocellulosa e sonda per Rac1. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi In questo protocollo si descrive l&#39;induzione di vinculin-macchiaEd adesioni focali e Rac1 attività con l&#39;ecografia. Per l&#39;esperimento adesione focale, la posizione di base è che i fibroblasti distribuite su un ligando di 5 α β 1-integrina non formano vinculina contenenti aderenze (Fig. 3A) a meno che un recettore secondo fibronectina, Syndecan-4, viene impegnato dalla aggiunta di ligando solubile (Fig. 3B) 3,4. Tuttavia, la stimolazione con ultrasuoni induce la formazione focale adesione nella stessa misura di impegno Syndecan-4 (Fig. 3C), che indica che la stimolazione ad ultrasuoni può sostituire alcuni componenti della fibronectina-dipendente via di segnalazione 5. L&#39;ostacolo chiave con questo protocollo si elimina la formazione di adesione focale in assenza di stimolante. Incompleta inibizione della sintesi proteica da parte cicloeximide permetterà di deposizione della matrice che è sufficiente per le cellule per l&#39;auto-stimolano. Il sovraffollamento delle cellule può portare anche a basso livello Formatio adesione focalen ed una scarsa risposta a ultrasuoni come diafonia tra cellula-cellula e cellula-matrice contatti complicare un esperimento che è progettata per isolare un singolo stimolo. Come sviluppo del saggio di base si mostra lo stesso esperimento, ripetuto con fibroblasti privi Syndecan-4 (Fig. 4). Questi fibroblasti di rispondere a ultrasuoni (Fig. 4C), ma non riescono a rispondere alle Syndecan-4 legante (Fig. 4B). L&#39;esperimento utilizzando Sdc4 - / - fibroblasti dimostra che gli ultrasuoni possono effettivamente bypassare la necessità di certi recettori fibronectina, e illustra come il protocollo semplice può essere sviluppato per ottenere informazioni aggiuntive sul percorso di segnalazione. Per l&#39;esperimento biochimico dimostriamo che gli ultrasuoni possono indurre l&#39;attivazione di Rac1, utilizzando un pull-down saggio che è un adattamento del metodo descritto da Del Pozo et al. 10. Precipitazione di attivo Rac1 0, 10, 30 e 60 minuti dopo iniziazione di stimolazione ultrasuoni rivela che RAC1 picchi di attività a 10-30 minuti, prima di tornare alla linea di base (Fig. 5). Blotting lisati greggio per vinculin assicura carico equivalente tra i punti temporali. Il risultato assomiglia attivazione di Rac1 da un blocco del Syndecan-4 3, ma è leggermente più lunga di attivazione da parte fibronectina. Pertanto 8-10 ripetizioni sono tipicamente necessari per ottenere dati significativi. Attivazione di Rac1 è responsabile per l&#39;impegno alla formazione delle cellule adesione focale e nascenti adesioni focali cominciano a formarsi a 10-30 minuti, in coincidenza con Rac1 attivazione. Una volta avviato, tali aderenze continuerà a maturare nelle placche di adesione grandi illustrate nelle figure 3 e 4. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig1.jpg" /> Figura 1. La forma d&#39;onda ad ultrasuoni. Ecografia comprende un segnale intermittente 1,5 MHz che, a causa di bassa ampiezza (30 mW / cm &lt;sup&gt; 2, media spaziale, media temporale) non ha alcun effetto di riscaldamento. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig2.jpg" /> Figura 2. Rappresentazione schematica del flusso di lavoro per la preparazione e la stimolazione delle cellule con ultrasuoni. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig3.jpg" /> Figura 3. Induzione Ecografia di formazione adesione focale nei fibroblasti. I fibroblasti sono stati sparsi sul integrina-binding frammento di fibronectina (A) prima della stimolazione con il Syndecan-4-binding frammento di fibronectina (B) o ultrasuoni (C). Dopo 60 minuti di stimolazione, le cellule sono state fissate, colorate per vinculina e actina, e ripreso da epifluorescenza. Bar = 10 micron. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig4.jpg" /> Figura 4. Induzione Ecografia di formazione adesione focale in fibroblasti carenti Syndecan-4. <em&gt; Sdc4 - / - fibroblasti sono stati sparsi sul integrina-binding frammento di fibronectina (A) prima della stimolazione con il Syndecan-4-binding frammento di fibronectina (B) o ultrasuoni (C). Dopo 60 minuti di stimolazione, le cellule sono state fissate, colorate per vinculina e actina, e ripreso da epifluorescenza. Anche se Sdc4 - / - fibroblasti erano fibronectina-insensitive, ecografia ancora indotto la formazione di focale adesione, indicando che l&#39;ecografia esclude l&#39;impegno matrice recettore. Bar = 10 micron. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig5.jpg" /> Figura 5. Attivazione di Rac1 da ultrasuoni. Le cellule sono state stimolate per minuto 0, 10, 30 e 60 con 6 pozzetti utilizzati per punto di tempo. La quantità di GTP-Rac1 presenti nei campioni da un pull-down Rac1 corso del test il tempo è stato visualizzato mediante incubazione con l&#39;anticorpo anti-Rac1 su un Western Blot (immagine in alto). Quantificazione dell&#39;intensità band (media di 8-10 replicati) rivela un aumento Rac1 unoettività risultante dal segnale ad ultrasuoni a 10 e 30 minuti, prima di tornare ai livelli basali a 60 minuti (grafico). Le barre di errore rappresentano sem

<ol>
	<li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syndecan-4+hair+trigger+initiates+wound+healing+through+caveolin-+and+RhoG-regulated+integrin+endocytosis.">A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis.</a> Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).</li><li>Echtermeyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+repair+and+impaired+angiogenesis+in+mice+lacking+syndecan-4.">Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4.</a> J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).</li><li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan-4-dependent+Rac1+regulation+determines+directional+migration+in+response+to+the+extracellular+matrix.">Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix.</a> J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).</li><li>Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+cytoskeletal+organisation+of+fibroblasts+in+response+to+fibronectin+fragments.">Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments.</a> Embo. J. 5, 665-670 (1986).</li><li>Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+ultrasound+bypasses+canonical+syndecan-4+signaling+to+activate+rac1.">Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1.</a> J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).</li><li>Claes, L., Willie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enhancement+of+bone+regeneration+by+ultrasound.">The enhancement of bone regeneration by ultrasound.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).</li><li>Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+tibial+fracture-healing+by+non-invasive,+low-intensity+pulsed+ultrasound.">Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).</li><li>Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+healing+of+distal+radial+fractures+with+the+use+of+specific,+low-intensity+ultrasound.+A+multicenter,+prospective,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study.">Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).</li><li>Danen, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+the+synergy+site+for+cell+adhesion+to+fibronectin+depends+on+the+activation+state+of+integrin+alpha+5+beta+1.">Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).</li><li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK.">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).</li><li>Makarem, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+binding+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+and+the+HepII/IIICS+domain+of+fibronectin+to+the+integrin+alpha+4+beta+1.">Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).</li></ol>

Andrew Harrison è un dipendente di Smith &amp; Nephew UK Limited.

In questo protocollo è descritto il metodo con cui un trattamento che viene normalmente applicato a pazienti umani possono essere utilizzati in esperimenti basati su celle. L&#39;obiettivo finale è quello di comprendere il meccanismo molecolare di azione degli ultrasuoni in modo che la terapia può essere raffinato. In questo protocollo, si usa fibroblasti embrionali di topo (MEF) come sistema modello di cella, ma ad ultrasuoni è stato anche stato trovato per essere efficace in fibroblasti primari umani prepuzio 5, cellule staminali mesenchimali, osteoblasti e condrociti 6. Usiamo Rac1 attivazione come un saggio biochimico esempio, ma il metodo può essere utilizzato anche per testare regolazione di fosforilazione proteica o la formazione di complessi proteici di immunoprecipitazione. Per l&#39;esempio immunofluorescenza si dimostra una ecografia effetto sulla formazione di adesione focale, ma la ridistribuzione di qualsiasi molecola potrebbe essere esaminato. Ad esempio, si potrebbe verificare assunzione di fattori citosolici alla membrana plasmatica, colocalisation di proteins in vescicole traffico o esaminare l&#39;effetto degli ultrasuoni sull&#39;organizzazione mitotico mandrino. Finora ci siamo limitati a noi stessi di test della fibronectina dipendenti percorsi, per effetto degli ultrasuoni sulle cellule sul collagene, o in presenza di fattori di crescita potrebbe essere testato per costruire un quadro di come gli ultrasuoni influenza il comportamento delle cellule in un ambiente complesso che più assomiglia una situazione in vivo. Una sfida maggiore sarà per testare l&#39;effetto di ultrasuoni utilizzando time-lapse imaging, dove la presenza di emettitore bloccare il percorso di luce e vibrazioni dagli attuali ultrasuoni ulteriori ostacoli tecnici. Tuttavia, il fatto che l&#39;applicazione terapeutica richiede solo 20 minuti di stimolazione al giorno suggerisce che l&#39;analisi del comportamento delle cellule dopo un burst di stimolazione può anche essere produttiva.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> solfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide estere </td><td> FisherPerbio </td><td> PN22312 </td><td> Stock 25 mM disciolti in acqua può essere conservato a -20 ° C </td></tr><tr><td> 6-ben piastra di coltura tissutale </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td> Plastica da altre società in grado di ricoprire poco </td></tr><tr><td> 13 mm di vetro coprioggetto </td><td> Scientifici materiale di laboratorio, Ltd.SLS </td><td> MIC3336 </td><td> Vetro da altre società in grado di ricoprire poco </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, Ca 2 + Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> 50K integrina ligando (frammento fibronectina) </td><td> Costruire descrizione e preparazione in 9, 11 </td><td></td><td> Alternative ligandi matrice potrebbe essere utilizzato per interrogare altri percorsi </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3059 </td><td></td></tr><tr><td> Cicloeximide </td><td> Sigma </td><td> C7698 </td><td> Può essere conservato come stock 10mg/ml in acqua </td></tr><tr><td> DMEM/25 HEPES </td><td> Sigma </td><td> D6171 </td><td></td></tr><tr><td> Esogene 4000 + </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultrasuoni accoppiamento gel </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SAFHS Indicatore </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hVIN-1 </td><td> Sigma </td><td> V9264 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488-coniugato anti-topo </td><td> Stratech Scientific </td><td> 715-485-150 </td><td></td></tr><tr><td> TRITC marcato phalloidin &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P1951 </td><td></td></tr><tr><td> Prolungare reagente oro antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> inibitore della proteasi completa (EDTA libero) </td><td> Roche </td><td> 056 489 001 </td><td> 100 × magazzino costituito da tablet conservati a -20 ° C </td></tr><tr><td> PAK glutatione-agarosio perline </td><td> Costruire descrizione e la preparazione in 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescatore </td><td> G/0650/17 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Apollo Scientific </td><td> BI8181 </td><td> Fai stock 1M e il pH a 7.4 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pescatore </td><td> S/0160/65 </td><td></td></tr><tr><td> NP40 </td><td> Sigma </td><td> I3021 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio desossicolato </td><td> Sigma </td><td> D6750 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of adhesion-dependent signals using low-intensity ultrasound

In organismi multicellulari, il comportamento cellulare è dettata dalle interazioni con la matrice extracellulare. Conseguenze della matrice impegno vanno dalla regolazione della migrazione e proliferazione cellulare, alla secrezione e anche la differenziazione. I segnali base di ciascuno di questi processi complessi derivano dalle interazioni molecolari di recettori della matrice extracellulare sulla superficie della cellula. Le integrine sono i recettori prototipici e fornire un collegamento meccanico tra la matrice extracellulare e il citoscheletro, nonché avviare alcune delle cascate di segnalazione adesione-dipendenti. Tuttavia, è sempre più evidente che recettori transmembrana aggiuntivi operato lungo le integrine di regolare sia la stessa integrina e segnali a valle. La più elegante di questi esempi è il proteoglicano transmembrana, Syndecan-4, che coopera con 5 α β 1-integrina durante l&#39;adesione alla fibronectina. Modelli in vivo demonstrmangiò l&#39;importanza della segnalazione Syndecan-4, come Syndecan-4-topi knockout presentano ritardo di guarigione a causa di 1,2 inefficiente la migrazione dei fibroblasti. In animali di tipo selvatico, la migrazione di fibroblasti verso una ferita viene attivato dalla comparsa di fibronectina che fuoriesce da danneggiato capillari e viene depositato mediante macrofagi nel tessuto danneggiato. Quindi c&#39;è grande interesse per scoprire le strategie che aumentano fibronectina-dipendenti di segnalazione e potrebbe accelerare i processi di riparazione. I componenti integrina-mediati e Syndecan-4-mediata di fibronectina-dipendenti segnalazione possono essere separate da stimolando le cellule con frammenti di fibronectina ricombinanti. Anche se l&#39;impegno integrina è essenziale per l&#39;adesione cellulare, fibronectina alcuni segnali dipendenti sono regolate da Syndecan-4. Syndecan-4 attiva il segnale di Rac1 protrusiva 3, provoca integrina redistribuzione 1, trigger reclutamento di molecole del citoscheletro, come vinculin, di focale4 adesioni, e induce così 3 direzionale di migrazione. Abbiamo cercato strategie alternative per l&#39;attivazione di tali segnali e ha scoperto che a bassa intensità ultrasuoni pulsato (LIPUS) in grado di simulare gli effetti di Syndecan-4 di fidanzamento 5. In questo protocollo si descrive il metodo di 30 mW / cm 2, 1,5 MHz ultrasuoni, impulsi a 1 kHz (Fig. 1) può essere applicato a fibroblasti in coltura (Fig. 2) per indurre Rac1 attivazione e la formazione di adesione focale. Stimolazione ad ultrasuoni viene applicato per un massimo di 20 minuti, in quanto questa combinazione dei parametri è stato trovato per essere più efficace per l&#39;accelerazione di riparazione delle fratture clinica 6. Il metodo utilizza frammenti di fibronectina ricombinanti per impegnare 5 α β 1-integrina, senza impegno di Syndecan-4, e richiede l&#39;inibizione della sintesi proteica cicloeximide per bloccare deposizione di matrice supplementare dai fibroblasti., L&#39;effetto positivo of ultrasuoni sui meccanismi di riparazione è ben documentata 7,8, e per comprendere l&#39;effetto molecolare degli ultrasuoni nella cultura dovremmo essere in grado di affinare la tecnica terapeutica per migliorare gli esiti clinici.

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Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Questo protocollo descrive la stimolazione dei fibroblasti in coltura a bassa intensità ultrasuoni pulsato, che guida la formazione di adesione focale e Rac1 attivazione imitando l&#39;impegno del recettore transmembrana matrice, Syndecan-4. Questo approccio consente di indagine di una tecnica di successo clinico a livello cellulare, fornendo così opportunità per la raffinazione della terapia.

L&#39;induzione di segnali di adesione-dipendenti utilizzando ultrasuoni a bassa intensità

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

induction-of-adhesion-dependent-signals-using-low-intensity-ultrasound

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K Views.  University of Bristol. Questo protocollo descrive la stimolazione dei fibroblasti in coltura a bassa intensità ultrasuoni pulsato, che guida la formazione di adesione focale e Rac1 attivazione imitando l'impegno del recettore transmembrana matrice, Syndecan-4. Questo approccio consente di indagine di una tecnica di successo clinico a livello cellulare, fornendo così opportunità per la raffinazione della terapia.

Video: Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

Mezzo di contrasto ecografico mirato trattamento dei gliomi nei topi tramite Drug-Bearing consegna delle nanoparticelle e ablazione microvascolari

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

Ricerca

Bioingegneria

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid microbubble contrast agents7-9. In mice these vector-carrying microbubbles can be administered intravenously or directly to the left ventricle of the heart. In larger animals they can also be infused through an intracoronary catheter. The subsequent delivery from the circulation to a target organ occurs by acoustic cavitation at a resonant frequency of the microbubbles. It seems likely that the mechanical energy generated by the microbubble destruction results in transient pore formation in or between the endothelial cells of the microvasculature of the targeted region10. As a result of this sonoporation effect, the transfection efficiency into and across the endothelial cells is enhanced, and transgene-encoding vectors are deposited into the surrounding tissue. Plasmid DNA remaining in the circulation is rapidly degraded by nucleases in the blood, which further reduces the likelihood of delivery to non-sonicated tissues and leads to highly specific target-organ transfection.

Ultrasound Targeted Microbubble Destruction (UTMD) can be used to direct site-specific delivery of bioactive molecules, including therapeutic genes, to target organs accessible to ultrasound, such as the heart and liver1-6.

Introduzione alla tecnica di distruzione mirata ad ultrasuoni microbolle

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband rivelatore ottico di ultrasuono per applicazioni Medical Imaging

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An oscillatory motion is generated at the focus of a 93-element and 4.5 MHz center frequency HIFU transducer by applying a 25 Hz amplitude-modulated signal using a function generator. A 64-element and 2.5 MHz imaging transducer with 68kPa peak pressure is confocally placed at the center of the HIFU transducer to acquire the radio-frequency (RF) channel data. In this protocol, real-time monitoring of thermal ablation using HIFU with an acoustic power of 7 W on canine livers in vitro is described. HIFU treatment is applied on the tissue during 2 min and the ablated region is imaged in real-time using diverging or plane wave imaging up to 1,000 frames/second. The matrix of RF channel data is multiplied by a sparse matrix for image reconstruction. The reconstructed field of view is of 90&#176; for diverging wave and 20 mm for plane wave imaging and the data are sampled at 80 MHz. The reconstruction is performed on a Graphical Processing Unit (GPU) in order to image in real-time at a 4.5 display frame rate. 1-D normalized cross-correlation of the reconstructed RF data is used to estimate axial displacements in the focal region. The magnitude of the peak-to-peak displacement at the focal depth decreases during the thermal ablation which denotes stiffening of the tissue due to the formation of a lesion. The displacement signal-to-noise ratio (SNRd) at the focal area for plane wave was 1.4 times higher than for diverging wave showing that plane wave imaging appears to produce better displacement maps quality for HMIFU than diverging wave imaging.

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

This article describes real-time monitoring of HIFU ablation in canine liver with high frame rate ultrasound imaging using diverging and plane wave imaging. Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound is used to image the decrease of acoustic radiation force induced displacement in the ablated region.

Monitoraggio in tempo reale di alta intensità ultrasuoni focalizzati (HIFU) Ablazione<em&gt; In Vitro</em&gt; Canine Livers Uso Harmonic Imaging Movimento per Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the light distortion during the propagation within the fiber. Our methodology is based on digital optical phase conjugation employing only a single spatial light modulator, where the optical wavefront is individually modulated at different regions of the modulator, one region per light signal. Digital optical phase conjugation approaches are considered to be faster than other wavefront shaping approaches, where (for example) a complete determination of the wave propagation behavior of the fiber is performed. In contrast, the presented approach is time-efficient since it only requires one calibration per light signal. The proposed method is potentially appropriate for spatial division multiplexing in communications engineering. Further application fields are endoscopic light delivery in biophotonics, especially in optogenetics, where single cells in biological tissue have to be selectively illuminated with high spatial and temporal resolution.

We demonstrate the transmission of multiple independent signals through a multimode fiber using wavefront shaping employing a single spatial light modulator. By modulating the wavefront for each signal individually, spatially separated foci are transmitted. Potential applications are multiplexed data transfer in communications engineering and endoscopic light delivery in biophotonics.

La trasmissione di segnali multipli attraverso una fibra ottica Utilizzando Wavefront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...

Manufacturing Abdominal Aorta Hydrogel Tissue-Mimicking Phantoms for Ultrasound Elastography Validation

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the tissue motion and infer or quantify the underlying biomechanical characteristics. For abdominal aortic aneurysms (AAA), biomechanical properties such as changes in the tissue's elastic modulus and estimates of the tissue stress may be essential for assessing the need for the surgical intervention. Abdominal aortic aneurysms US elastography could be a useful tool to monitor AAA progression and identify changes in biomechanical properties characteristic of high-risk patients.
A preliminary goal in the development of an AAA US elastography technique is the validation of the method using a physically relevant model with known material properties. Here we present a process for the production of AAA tissue-mimicking phantoms with physically relevant geometries and spatially modulated material properties. These tissue phantoms aim to mimic the US properties, material modulus, and geometry of the abdominal aortic aneurysms. Tissue phantoms are made using a polyvinyl alcohol cryogel (PVA-c) and molded using 3D printed parts created using computer aided design (CAD) software. The modulus of the phantoms is controlled by altering the concentration of PVA-c and by changing the number of freeze-thaw cycles used to polymerize the cryogel. The AAA phantoms are connected to a hemodynamic pump, designed to deform the phantoms with the physiologic cyclic pressure and flows. Ultra sound image sequences of the deforming phantoms allowed for the spatial calculation of the pressure normalized strain and the identification of mechanical properties of the vessel wall. Representative results of the pressure normalized strain are presented.

Here we describe a method to manufacture aneurysmal, aortic tissue-mimicking phantoms for the use in testing ultrasound elastography. The combined use of computer-aided design (CAD) and 3-dimensional (3D) printing techniques produce aortic phantoms with predictable, complex geometries to validate the elastographic imaging algorithms with controlled experiments.

Aorta addominale idrogel che imita tessuto di fabbricazione fantocci per convalida Elastografia ad ultrasuoni

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli such as physical movement, activation of tactile sensors in the skin, and viewing images. Neural activation is inferred from an increase in the cerebral blood flow velocity (CBFV) supplying the region of the brain involved in processing sensory input. For example, viewing bright light causes increased neural activity in the occipital lobe of the cerebral cortex, leading to increased blood flow in the posterior cerebral artery, which supplies the occipital lobe. In fTCD, changes in CBFV are used to estimate changes in cerebral blood flow (CBF).
With its high temporal resolution measurement of blood flow velocities in the major cerebral arteries, fTCD complements other established functional imaging techniques. The goal of this Methods paper is to give step-by-step instructions for using fTCD to perform a functional imaging experiment. First, the basic steps for identifying the middle cerebral artery (MCA) and optimizing the signal will be described. Next, placement of a fixation device for holding the TCD probe in place during the experiment will be described. Finally, the breath-holding experiment, which is a specific example of a functional imaging experiment using fTCD, will be demonstrated.

Functional transcranial Doppler ultrasound complements other functional imaging modalities, with its high temporal resolution measurement of stimulus-induced changes in cerebral blood flow within the basal cerebral arteries. This Methods paper gives step-by-step instructions for using functional transcranial Doppler ultrasound to perform a functional imaging experiment.&#160;

Ecografia doppler transcranici funzionale per il monitoraggio del flusso sanguigno cerebrale

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation (SHAPE) Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

Noninvasive, accurate measurement of pressures within the human body has long been an important but elusive clinical goal. Contrast agents for ultrasound imaging are gas-filled, encapsulated microbubbles (diameter &#60; 10 &#956;m) that traverse the entire vasculature and enhance signals by up to 30 dB. These microbubbles also produce nonlinear oscillations at frequencies ranging from the subharmonic (half of the transmit frequency) to higher harmonics. The subharmonic amplitude has an inverse linear relationship with the ambient hydrostatic pressure. Here an ultrasound system capable of performing real-time, subharmonic aided pressure estimation (SHAPE) is presented. During ultrasound contrast agent infusion, an algorithm for optimizing acoustic outputs is activated. Following this calibration, subharmonic microbubble signals (i.e., SHAPE) have the highest sensitivity to pressure changes and can be used to noninvasively quantify pressure. The utility of the SHAPE procedure for identifying portal hypertension in the liver is the emphasis here, but the technique has applicability across many clinical scenarios.

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation SHAPE Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

A protocol for noninvasively estimating ambient pressures utilizing subharmonic ultrasound imaging of infused contrast microbubbles (following appropriate calibration) is described with examples from human patients with chronic liver disease.

Stima della pressione subarmonica assistita da contrasto (SHAPE) utilizzando l'imaging a ultrasuoni con particolare attenzione all'identificazione dell'ipertensione portale

Noninvasive, accurate measurement of pressures within the human body has long been an important but elusive clinical goal. Contrast agents for ultrasound ...

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic toxicity and increases circulation time of the drugs. In a novel approach to microbubble-assisted drug delivery, nanoparticles are incorporated in or on microbubble shells, enabling local and triggered release of the nanoparticle payload with ultrasound. A thorough understanding of the release mechanisms within the vast ultrasound parameter space is crucial for efficient and controlled release. This set of presented protocols is applicable to microbubbles with a shell containing a fluorescent label. Here, the focus is on microbubbles loaded with poly(2-ethyl-butyl cyanoacrylate) polymeric nanoparticles, doped with a modified Nile Red dye. The particles are fixed within a denatured casein shell. The microbubbles are produced by vigorous stirring, forming a dispersion of perfluoropropane gas in the liquid phase containing casein and nanoparticles, after which the microbubble shell self-assembles. A variety of microscopy techniques are needed to characterize the nanoparticle-stabilized microbubbles at all relevant timescales of the nanoparticle release process. Fluorescence of the nanoparticles enables confocal imaging of single microbubbles, revealing the particle distribution within the shell. In vitro ultra-high-speed imaging using bright-field microscopy at 10 million frames per second provides insight into the bubble dynamics in response to ultrasound insonation. Finally, nanoparticle release from the bubble shell is best visualized by means of fluorescence microscopy, performed at 500,000 frames per second. To characterize drug delivery in vivo, the triggered release of nanoparticles within the vasculature and their extravasation beyond the endothelial layer is studied using intravital microscopy in tumors implanted in dorsal skinfold window chambers, over a timescale of several minutes. The combination of these complementary characterization techniques provides unique insight into the behavior of microbubbles and their payload release at a range of time and length scales, both in vitro and in vivo.

The presented protocols can be used to characterize the response of fluorescently-labeled microbubbles designed for ultrasound-triggered drug delivery applications, including their activation mechanisms as well as their bioeffects. This paper covers a range of in vitro and in vivo microscopy techniques performed to capture the relevant length and timescales.

Metodi di microscopia multi-timescale per la caratterizzazione di microbolle marcate fluorescenti per il rilascio di farmaci attivati da ultrasuoni

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

In vitro Induzione di cellule staminali della polpa dentale umana verso lignaggi pancreatici

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...