Ringraziamo Deok Joong Lee per la lettura critica del manoscritto e per aver testato il codice Python. Questa ricerca è stata sponsorizzata dalla National Research Foundation of Korea 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) e 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).

1. Configurazione dell'apparato di imaging (Figura 1A-E)
<ol><li>Assicurati che sia disponibile una fotocamera per smartphone con i seguenti requisiti minimi: Fotocamera da 12 megapixel (MP) Video con risoluzione 1080p 5 GB di spazio di archiviazione (20 minuti di video sono 3-4 Gb) App video time-lapse dall'app store (applicazioni gratuite disponibili)</li>
	<li>Posizionare la scatola luminosa a LED sul rack inferiore dell'incubatore a 25 °C dove verrà eseguito il test.</li>
	<li>Per nascondere il motivo tratteggiato sulla superficie luminosa del LED, stendere due fogli di tessuto per coprire l'intera superficie della scatola LED.</li>
	<li>Creare uno stadio elevato per il campione (Figura 1A,D). Il palcoscenico sopraelevato è un foglio di plastica trasparente sostenuto da tunnel rettangolari cavi. I tunnel funzionano come un condensatore per focalizzare la luce, fornendo un migliore contrasto con il campione (Figura 1C). Assicurati che le pareti del tunnel siano un po 'scure per ridurre al minimo la dispersione della luce. Questo studio ha utilizzato scatole di carta marrone. La dimensione del tunnel è 5,5 cm x 17 cm x 4,5 cm (L x L x A). La scatola luminosa a LED può contenere fino a cinque tunnel.</li>
	<li>Posizionare un altro rack sopra il palco per posizionare i telefoni per la registrazione (Figura 1B,E). Ogni telefono registrerà da tre a sei piastre (da una a due file di tre piastre), quindi regola l'altezza del rack di conseguenza. Questo sarà circa 15 cm sopra il campione (Figura 1B).</li>
	<li>Inserire una ciabatta all'interno dell'incubatore per collegare i telefoni durante la registrazione notturna.</li>
</ol>2. Preparazione di buffer e supporti
<ol><li>Preparare il tampone M9 aggiungendo 3 g di KH 2 PO 4, 6 g di Na 2 HPO4 e 5 g di NaCl a 1 L di H2O distillato. Sterilizzare in autoclave a 121°C per 20 min. Raffreddare il tampone e quindi aggiungere 1 mL di 1 M MgSO4.</li>
	<li>Preparare 1 M tampone KPO 4 aggiungendo 108,3 g di KH 2 PO 4 e 35,6 g di K 2 HPO4 a 1 L di H 2O. Regolare il pH a 6,0 aggiungendo KOH. Sterilizzare in autoclave.</li>
	<li>Preparare la soluzione sbiancante per vermi mescolando 1 mL di candeggina, 0,4 mL di 1 M NaOH e 2,6 mL di H2O.</li>
	<li>Preparare le piastre di agar dei terreni di crescita dei nematodi (NGM).<ol><li>Aggiungere 3 g di NaCl, 2,5 g di bacto peptone e 17 g di bacto agar in un matraccio da 3 litri. Aggiungere 975 ml di acqua distillata e inserire un mescolatore.</li>
		<li>Sterilizzare in autoclave, quindi raffreddare a 55 °C e aggiungere 1 mL di colesterolo (5 mg/mL in etanolo), 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di 1 M MgSO 4 e 25 mL di tampone 1 M KPO4 (pH 6,0). Mescolare per amalgamare bene. Versare in piatti da 6 cm. Lasciare asciugare i piatti per almeno 2 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Seme NGM piastre di agar con OP50 E. coli mediante pipettaggio di circa 1 mL di una coltura notturna di OP50 per formare un prato di batteri. Lasciare a temperatura ambiente (RT) fino al momento dell'uso.</li>
</ol>3. Preparazione di piastre NGM ad alto peptone (per PA14)
NOTA: Queste piastre devono essere fatte almeno 5 giorni prima del test.
<ol><li>Produrre NGM contenente lo 0,35% di peptone. Mescolare 0,3 g di NaCl, 0,35 g di bacto peptone e 1,7 g di bacto agar in un matraccio Erlenmeyer da 250 ml. Aggiungere 97,5 ml di acqua distillata e inserire un agitatore.</li>
	<li>Coprire la bocca del matraccio con un foglio di alluminio e autoclave a 121 °C per 20 min.</li>
	<li>Raffreddare a 55 °C e aggiungere 0,1 mL di colesterolo (5 mg/mL in etanolo), 0,1 mL di 1 M CaCl 2, 0,1 mL di 1 M MgSO 4 e2,5 mL di tampone 1 M KPO4 (pH 6,0). Mescolare per amalgamare bene.</li>
	<li>Versare NGM ad alto peptone in piastre di Petri da 35 mm.</li>
	<li>Asciugare i piatti per almeno 2 giorni.</li>
</ol>4. Sincronizzazione dei vermi mediante sbiancamento
NOTA: iniziare questo passaggio 3 giorni prima del test.
<ol><li>Prendi le piastre con vermi adulti gravidi e raccoglile in un microtubo da 1,7 mL lavando le piastre con tampone M9.</li>
	<li>Rimuovere quanto più liquido possibile, quindi aggiungere 400 μL di soluzione sbiancante. Attendere circa 4-5 minuti con vortice intermittente, fino a quando i corpi dei vermi adulti si rompono, rilasciando le uova.</li>
	<li>Aggiungere tampone M9 per riempire il resto del microtubo per diluire la soluzione sbiancante. Girare alla massima velocità (da 12.000 a 13.000 x g) per 1-2 s. Rimuovere il surnatante e lavare altre tre volte con tampone M9.</li>
	<li>Trasferire le uova in una capsula di Petri vuota da 35 mm contenente tampone M9. Lasciare che le uova si schiudano per una notte a 20 °C. In assenza di cibo, i vermi nati si arresteranno allo stadio larvale L1, sincronizzando lo stadio di sviluppo di tutti i vermi. NOTA: Rivestire la capsula di Petri da 35 mm con una soluzione di gelatina (gelatina allo 0,05% in acqua autoclavata) può impedire alle uova di attaccarsi al fondo e ridurre al minimo la perdita di uova.</li>
	<li>Il giorno successivo, trasferire i vermi dello stadio L1 in piastre NGM seminate OP50.</li>
	<li>Incubare i vermi a 20 °C per 53-54 ore fino a quando i vermi raggiungono lo stadio larvale L4.</li>
</ol>5. Preparazione di batteri ( Pseudomonas aeruginosa, PA14)
NOTA: iniziare questo passaggio 4 giorni prima del test.
<ol><li>Striscia i batteri scongelati da -80 °C su una piastra di agar Luria Bertani (LB) senza alcun antibiotico e incubare per una notte a 37 °C. NOTA: Utilizzare sempre batteri freschi. Le piastre striate devono essere conservate a 4 °C per non più di 1 settimana.</li>
	<li>Inoculare una singola colonia in 3 ml di brodo del re e crescere per una notte in un'incubatrice a 37 °C.</li>
	<li>Il giorno successivo, seminare 7 μL della coltura notturna sulle piastre NGM ad alto peptone e incubare a 37 °C per 24 ore.</li>
	<li>Spostare le piastre seminate in RT e incubare per altre 24 ore prima dell'uso. Una volta pronto, utilizzare la piastra entro le successive 24 ore.</li>
</ol>6. Preparazione alla registrazione
NOTA: eseguire questa operazione subito prima del test.
<ol><li>Collegare lo smartphone alla ciabatta collegata a una presa di corrente. Assicurati di disabilitare l'impostazione di blocco automatico per evitare che il telefono ritorni alla schermata di blocco durante la registrazione.</li>
	<li>Apri l'app della fotocamera time-lapse e imposta l'intervallo time-lapse su 2 s. Imposta la qualità video su 1080p a 30 fps.</li>
	<li>Posizionare lo smartphone con lo schermo rivolto verso l'alto per registrare con la fotocamera posteriore. Controllare lo schermo per assicurarsi che i tunnel della scatola di carta si adattino al campo visivo.</li>
</ol>7. Saggio di evitamento del prato
<ol><li>Utilizzando un plettro di filo di platino, trasferire 30 vite senza fine sincronizzate L4 (53-54 h da L1) alla piastra PA14. Posiziona i vermi nel mezzo del prato dei batteri. Per ogni condizione in questo studio, sono state testate due piastre (cioè 60 vermi per condizione).</li>
	<li>Posizionare le due piastre sul palco sopraelevato dell'apparecchio di registrazione con il coperchio rivolto verso il basso. Il lato con l'agar sarà rivolto verso l'alto verso la fotocamera.</li>
	<li>Sullo schermo dello smartphone, toccare il punto in cui si trova la piastra, in modo che la fotocamera possa mettere a fuoco le lastre di analisi. È utile avere un'etichetta o una scritta sulla lastra in quanto la fotocamera può usarla per mettere a fuoco correttamente. NOTA: la scrittura sul fondo delle lastre non interferisce con l'imaging dei vermi purché sia verso il bordo. Fortunatamente, i vermi rimangono vicino al prato anche dopo che se ne sono andati, quindi è necessaria una vista libera solo dell'area circostante il prato.</li>
	<li>Avviare la registrazione.</li>
	<li>Una volta iniziata la registrazione, aggiungi altre lastre al palco. Potrebbe esserci un tempo di ritardo significativo tra le piastre a causa del tempo necessario per trasferire i vermi mediante prelievo. Notare il tempo di ritardo in seguito in modo che ogni condizione possa essere contata nel momento in cui è iniziata.</li>
	<li>Registra per 20 ore dall'ultima serie di piatti posizionati sul palco. Nel video time-lapse finale, 20 ore di registrazione si tradurranno in un video di 20 minuti. NOTA: Può essere utile contare i vermi direttamente dalle piastre dopo il test, almeno all'inizio per le prime occasioni. Questo può essere confrontato con i valori ottenuti attraverso l'imaging video per garantire che producano numeri simili.</li>
</ol>8. Elaborazione di video utilizzando script Python
<ol><li>Trasferire il file del filmato su un computer per l'elaborazione. L'estensione sarà un file MOV (iPhone) o MP4 (Android).</li>
	<li>Usa un codice Python per elaborare i video. Il codice può essere trovato su github.com/khyoon201/wormavoid.</li>
	<li>Per eseguire gli script Python, assicurarsi che sul computer siano preinstallati i seguenti: ffmpeg, uno strumento per la conversione di file video (le istruzioni per l'installazione possono essere trovate sul suo sito Web, ffmpeg.org/download) e i pacchetti Python os, pandas, tkinter e ffmpeg-python.</li>
	<li>Trova le dimensioni e le coordinate di ogni lastra usando il extract_frame.py script.<ol><li>Eseguire lo script extract_frame.py . Apparirà una finestra per selezionare il file video memorizzato sul computer. Al termine dell'esecuzione, nella stessa directory verrà visualizzato un file jpeg con lo stesso nome.</li>
		<li>Aprire il file jpeg in ImageJ (imagej.org).</li>
		<li>Dal menu, scegliere Analizza > Imposta misurazioni. Assicurarsi che la casella Visualizza etichetta sia selezionata (Figura 2A). Chiudere la finestra.</li>
		<li>Con lo strumento linea retta , misurate il diametro di una lastra disegnando una linea su di essa, quindi scegliete Analizza > Misura dal menu. Se il video è in 1080p, ogni piastra sarà larga circa 480 pixel. Annotare queste informazioni e chiudere la finestra Risultati .</li>
		<li>Con lo strumento Multipunto , contrassegnate i punti sul lato superiore sinistro di ogni piastra. Questi punti diventeranno l'angolo in alto a sinistra dei video ritagliati (Figura 2B). L'ordine è importante; segnare in ordine di quando sono state avviate le piastre. Dopo aver creato un punto per tutte le piastre, scegliete Analizza > misura (Analyze Measure ) dal menu. Le misurazioni, incluse le coordinate X e Y dei punti, verranno visualizzate nella finestra Risultati.</li>
		<li>Per elaborare più video, ripetete il processo in ImageJ con altri file jpeg. Tutte le coordinate X e Y verranno elencate nella stessa finestra Risultati .</li>
		<li>Salvare la finestra Risultati in un file CSV. Il file deve essere salvato nella stessa directory dei file del filmato.</li>
	</ol></li>
	<li>Trova l'ora di inizio per ogni piatto.<ol><li>Riproduci il filmato, sul computer o sul telefono, e prendi nota degli orari di inizio di ogni set di lastre posizionate sotto la fotocamera.</li>
		<li>Apri il file Results.csv con le coordinate e aggiungi una colonna "start". Per ogni riga corrispondente alle singole targhe, inserisci l'ora di inizio appropriata, in secondi, sotto la colonna "start" (ad esempio, se l'ora di inizio è 0:00:08, inserisci 8). Salvare. Nota : il nome della colonna deve essere "start" (in minuscolo, senza virgolette) per essere riconosciuto dallo script successivo per il ritaglio e il taglio.</li>
	</ol></li>
	<li>Ritaglia e taglia i video.<ol><li>Eseguire lo script crop_n_trim.py .</li>
		<li>Quando richiesto, scegliere il file Results.csv . NOTA: assicurarsi che il file Results.csv e tutti i file del filmato si trovino nella stessa directory.</li>
		<li>Immettete le quote della piastra. Immettete il valore in pixel indicato in precedenza. NOTA: lo script leggerà ora ogni riga del file Results.csv per trovare il file del filmato corretto leggendo il nome del file nella colonna "etichetta" e ritaglierà in base alle coordinate indicate nelle colonne "X" e "Y". L'ora di inizio di ogni piastra sarà determinata dall'ora indicata nella colonna "start". Al termine dell'esecuzione dello script, verrà visualizzata una cartella con lo stesso nome del filmato, seguita dall'ora di inizio (ad esempio, "Movie1_8"), in cui verranno salvati i video di 10 s corrispondenti a ciascun punto orario del test.</li>
	</ol></li>
</ol>9. Conteggio manuale con ImageJ
<ol><li>Aprire ogni file AVI in ImageJ.</li>
	<li>Conta i vermi visibili all'esterno del prato. I worm sovrapposti in un fotogramma di solito si allontanano in un altro fotogramma in modo che possano essere contati correttamente.</li>
	<li>Calcola il tasso di occupazione per ogni punto temporale: Tasso di occupazione = (vermi totali - numero di vermi al di fuori del prato)/vermi totali NOTA: i vermi si muoveranno dentro e fuori dal prato durante il video, ma ciò non altererà in modo significativo i risultati. Prova ad andare con il numero che sembra essere la media, o il numero di worm al punto orario esatto (5 s nel video).</li>
</ol>

Imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans

<ol>
	<li>Pradel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+avoidance+of+a+natural+product+from+the+pathogenic+bacterium+Serratia+marcescens+by+Caenorhabditis+elegans.">Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).</li><li>Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+NPR-1-mediated+behaviors+are+suppressed+in+the+presence+of+mucoid+bacteria.">Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).</li><li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+shapes+the+C.+elegans+sensory+response+to+Pseudomonas+produced+nitric+oxide.">Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide.</a> eLife. 7, 36833 (2018).</li><li>Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+pathways+that+surveil+and+defend+mitochondria.">Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria.</a> Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).</li><li>Melo, J. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+conserved+C.+elegans+genes+engages+pathogen-+and+xenobiotic-associated+defenses.">Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses.</a> Cell. 149 (2), 452-466 (2012).</li><li>Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+of+bacterial+secondary+metabolites+modulates+neuroendocrine+signaling+and+behavior+of+C.+elegans.">Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans.</a> Cell. 159 (2), 267-280 (2014).</li><li>Singh, J., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+infection+regulates+behavior+and+learning+via+neuroendocrine+signaling.">Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling.</a> eLife. 8, 50033 (2019).</li><li>Lee, K., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intestine-derived+neuropeptide+controls+avoidance+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).</li><li>Singh, J., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lawn+avoidance+and+bacterial+two+choice+preference+assays+in+Caenorhabditis+elegans.">Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-Protocol. 10 (10), 3623 (2020).</li><li>Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polymorphism+in+npr-1+is+a+behavioral+determinant+of+pathogen+susceptibility+in+C.+elegans.">A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans.</a> Science. 323 (5912), 382-384 (2009).</li><li>de Bono, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+a+neuropeptide+Y+receptor+homolog+modifies+social+behavior+and+food+response+in+C.+elegans.">Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans.</a> Cell. 94 (5), 679-689 (1998).</li><li>Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormScan:+a+technique+for+high-throughput+phenotypic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans.">WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).</li><li>Stroustrup, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+lifespan+machine.">The Caenorhabditis elegans lifespan machine.</a> Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Marquina-Solis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidergic+signaling+controls+the+dynamics+of+sickness+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Churgin, M. A., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+imaging+system+for+monitoring+C.+elegans+behavior+and+aging.">An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging.</a> Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).</li><li>Barlow, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megapixel+camera+arrays+enable+high-resolution+animal+tracking+in+multiwell+plates.">Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates.</a> Communications Biology. 5 (1), 253 (2022).</li><li>Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+optogenetic+system+for+behavioral+analysis+of+freely+moving+small+animals.">A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals.</a> Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Immaginare il comportamento animale, piuttosto che basarsi sull'osservazione diretta, non è solo conveniente, ma ha anche il vantaggio di lasciare documentazione visiva. Ciò consente l'analisi cieca da parte di una terza persona oggettiva o potrebbe anche essere utilizzato per l'analisi automatizzata utilizzando tecniche di riconoscimento delle immagini. Nonostante i vantaggi, l'attrezzatura standard solitamente offerta è ad alto costo, quindi ci si impegna nella configurazione una volta acquistata.
<p class="jove...

Tra i molti vantaggi dello studio di C. elegans, il suo semplice sistema nervoso offre l'opportunità di studiare come i cambiamenti a livello genetico e cellulare influenzano la funzione della rete e la produzione comportamentale. Nonostante abbia un numero limitato di neuroni, C. elegans mostra una vasta gamma di comportamenti complessi. Uno di questi è l'evitamento del prato, in cui il nematode batterivoro risponde a una fonte di cibo dannosa lasciando il prato batterico. C. elegans evita prati di batteri patogeni 1,2,3, prati di batteri che producono tossine o sono arricchiti con tossine1,4 e persino batteri che esprimono RNAi il cui knockdown del gene bersaglio è dannoso per la salute dei vermi 4,5. Gli studi hanno dimostrato che i vermi rispondono a segnali esterni come i metaboliti prodotti dai batteri patogeni1,6, o segnali interni che indicano che il cibo li sta facendo ammalare 4,7. Questi segnali vengono elaborati attraverso vie di segnalazione conservate, come la via della proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPK) e la via del fattore di crescita trasformante beta (TGFβ) e richiedono la comunicazione tra l'intestino e il sistema nervoso 4,6,7,8.
Sebbene il test sia semplice, il comportamento appreso si sviluppa nel corso di molte ore, spesso durante la notte. Mentre ci sono mutanti che non sono in grado di andarsene, nel qual caso l'evitamento del punteggio in un solo punto temporale è sufficiente per dimostrare il difetto, molti mutanti alla fine se ne vanno, ma sono più lenti a uscire. Per questi, il movimento dei vermi deve essere monitorato ogni poche ore, il che può essere difficile da fare durante la notte. Anche il conteggio richiede tempo, creando un tempo di ritardo tra le piastre, e quindi limita il numero di piastre che possono essere testate contemporaneamente. L'utilizzo di una configurazione di imaging per registrare molte lastre contemporaneamente per l'intera durata del test sarebbe molto utile, ma il costo della configurazione può essere proibitivo, a seconda della situazione di finanziamento del laboratorio di ricerca.
Per risolvere questo problema, abbiamo ideato un metodo molto semplice che utilizza gli smartphone per registrare i test di evitamento. Ogni telefono può registrare video time-lapse di un massimo di sei lastre di analisi. Per fornire luce trasmessa, utilizziamo una scatola luminosa a diodi emettitori di luce (LED) che può essere facilmente acquistata online. Le lastre di analisi sono posizionate su una piattaforma sopraelevata, sostenuta da tunnel rettangolari cavi, che focalizzano la luce in entrata, creando contrasto. Forniamo anche uno script Python che converte i video in file AVI (Audio Video Interleave) che mostrano clip di 10 s di ogni punto orario orario. I video vengono quindi ritagliati su singole lastre e salvati in file separati da utilizzare per il conteggio manuale.
Il metodo fornisce una procedura a basso costo che è anche estremamente facile da usare, utilizzando articoli che sono prontamente disponibili per la maggior parte delle persone. Qui, descriviamo il metodo utilizzando il ben noto saggio di prevenzione del prato contro il patogeno umano Pseudomonas aeruginosa (PA14), il cui protocollo è stato precedentemente descritto 2,9. Infine, esaminiamo anche le considerazioni e i limiti del metodo di imaging per coloro che vogliono applicarlo ad altri esperimenti comportamentali di C. elegans.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>#10035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>#214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>#211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>DAEJUNG</td>
			<td>2507-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>CD0122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>84120-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>King B Broth</td>
			<td>MB cell</td>
			<td>MB-K0827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light box multi-pad</td>
			<td>Artmate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for &#34;LED light box for tracing&#34; in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9&#34; x 12&#34; (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&#38;keywords= 
			LED%2Blight%2Bbox&#38;qid=1674183224&#38;sprefix 
			=led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&#38;sr=8-5&#38;th=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>DAEJUNG</td>
			<td>5514-4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic paper sleeve (clear)</td>
			<td>Smead</td>
			<td>#85753</td>
			<td>Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 
			8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>84185-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power strip&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartphone</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride(NaCl)</td>
			<td>DAEJUNG</td>
			<td>#7548-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>YAKURI</td>
			<td>#31727</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a smartphone-based imaging method for c. elegans lawn avoidance assay

Quando esposto a batteri tossici o patogeni, il nematode Caenorhabditis elegans mostra un comportamento appreso di evitare il prato, in cui i vermi lasciano gradualmente la loro fonte di cibo e preferiscono rimanere fuori dal prato batterico. Il test è un modo semplice per testare la capacità dei vermi di percepire segnali esterni o interni per rispondere correttamente a condizioni dannose. Sebbene si tratti di un test semplice, il conteggio richiede molto tempo, in particolare con campioni multipli, e le durate dei test che si estendono durante la notte sono scomode per i ricercatori. Un sistema di imaging in grado di visualizzare molte lastre per un lungo periodo è utile ma costoso. Qui, descriviamo un metodo di imaging basato su smartphone per registrare l'evitamento del prato in C. elegans. Il metodo richiede solo uno smartphone e una scatola luminosa a diodi emettitori di luce (LED), per fungere da sorgente luminosa trasmessa. Utilizzando applicazioni fotografiche time-lapse gratuite, ogni telefono può visualizzare fino a sei lastre, con nitidezza e contrasto sufficienti per contare manualmente i vermi al di fuori del prato. I filmati risultanti vengono elaborati in file AVI (Audio Video Interleave) di 10 s per ogni punto temporale orario, quindi ritagliati per mostrare ogni singola lastra per renderli più suscettibili di conteggio. Questo metodo è un modo economico per coloro che cercano di esaminare i difetti di evitamento e può potenzialmente essere esteso ad altri saggi di C. elegans.

Among the many advantages of studying C. elegans, its simple nervous system offers the opportunity to study how changes at the genetic and cellular level impact network function and behavioral output. Despite having a limited number of neurons, C. elegans display a wide range of complex behaviors. One of these is lawn avoidance, in which the bacterivorous nematode responds to a harmful food source by leaving the bacterial lawn. C. elegans avoid lawns of pathogenic bacteria1,2,3, lawns of bacteria that produce toxins or are spiked with toxins1,4, and even RNAi-expressing bacteria whose target gene knockdown is detrimental to the health of the worms4,5. Studies have shown that worms respond to external cues such as metabolites produced by the pathogenic bacteria1,6, or internal cues that indicate that the food is making them sick4,7. These cues are processed through conserved signaling pathways, such as the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and the transforming growth factor beta (TGF&#946;) pathway, and require communication between the gut and the nervous system4,6,7,8.
Although the assay is simple, the learned behavior develops over many hours, often overnight. While there are mutants that are incapable of leaving, in which case scoring avoidance at just one time point is sufficient to demonstrate the defect, many mutants do leave eventually but are slower to come out. For these, the movement of the worms needs to be tracked every few hours, which can be difficult to do overnight. Counting itself also takes time, creating a lag time between the plates, and thus limits the number of plates that can be tested at the same time. Using an imaging setup to record many plates simultaneously for the whole duration of the assay would be very useful, but the cost of setup can be prohibitive, depending on the funding situation of the research lab.
To address this, we devised a very simple method that uses smartphones to record avoidance assays. Each phone can record time-lapse videos of up to six assay plates. To provide transmitted light, we use a light emitting diode (LED) light box that can be easily purchased online. Assay plates are placed on an elevated platform, supported by hollow rectangular tunnels, that focus the incoming light, creating contrast. We also provide a Python script that converts the videos into audio video interleave (AVI) files showing 10 s clips of each hourly time point. The videos are then cropped to individual plates and saved in separate files to use for manual counting.
The method provides a low-cost procedure that is also extremely easy to use, using items that are readily available to most people. Here, we describe the method using the well-established lawn avoidance assay against the human pathogen Pseudomonas aeruginosa (PA14), whose protocol has been previously described2,9. Finally, we also review the considerations and limitations of the imaging method for those that want to apply it to other C. elegans behavior experiments.

Autore in primo piano: un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans  

Un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans

Among the many behaviors displayed by C-elegans, pathogenic lawn avoidance is the worm's defense strategy to minimize its exposure to harmful pathogens. In our lab, we use this behavior as a tool to identify genes involved in the proper functioning of the neurons that mediate this behavior. The lawn avoidance behavior is a simple assay, however it develops over many hours.Hence, it is convenient if the assay can be recorded to observe behavior over long time periods. Also, if multiple assays can be recorded at the same time, that's even better. Although there are many imaging solutions described in the literature, even a few modestly priced cameras may be out of reach for labs with limited resources.Also, some may want to try the assay, but do not plan on doing it long term. For such cases, short-term solutions such as this protocol might help. Our amazing protocol offers an easy, low cost way to record worm behavior.We use smartphones to record the assay, then process the video through a Python script that makes it suitable for counting.

Il primo video prodotto dalla sceneggiatura è di 1 ora dall'inizio del test. Il video per 0 h non viene salvato, poiché i vermi iniziano il test all'interno del prato, quindi il tasso di occupazione è sempre del 100%.
I vermi N2 wild-type sono confrontati con i mutanti npr-1, il cui difetto di prevenzione del prato è ben stabilito nella letteratura 6,10 (Figura 3A-E</s...

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Questo articolo descrive un metodo semplice e a basso costo per registrare il comportamento di evitamento del prato di Caenorhabditis elegans, utilizzando elementi prontamente disponibili come uno smartphone e una scatola luminosa a diodi emettitori di luce (LED). Forniamo anche uno script Python per elaborare il file video in un formato più adatto al conteggio.

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually ...

Tra i molti comportamenti mostrati dai C-elegans, l'evitamento patogeno del prato è la strategia di difesa del verme per ridurre al minimo la sua esposizione a patogeni dannosi. Nel nostro laboratorio, usiamo questo comportamento come strumento per identificare i geni coinvolti nel corretto funzionamento dei neuroni che mediano questo comportamento. Il comportamento di evitamento del prato è un semplice test, tuttavia si sviluppa nel corso di molte ore.Quindi, è conveniente se il test può essere registrato per osservare il comportamento per lunghi periodi di tempo. Inoltre, se è possibile registrare più test contemporaneamente, è ancora meglio. Sebbene ci siano molte soluzioni di imaging descritte in letteratura, anche alcune telecamere a prezzi modesti possono essere fuori dalla portata dei laboratori con risorse limitate.Inoltre, alcuni potrebbero voler provare il test, ma non hanno intenzione di farlo a lungo termine. In questi casi, soluzioni a breve termine come questo protocollo potrebbero aiutare. Il nostro straordinario protocollo offre un modo semplice e a basso costo per registrare il comportamento dei worm.Usiamo gli smartphone per registrare il test, quindi elaboriamo il video attraverso uno script Python che lo rende adatto al conteggio.

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Research

JoVE Journal

Behavior

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

4.5K Views.  Yonsei University Wonju College of Medicine. Tra i molti comportamenti mostrati dai C-elegans, l'evitamento patogeno del prato è la strategia di difesa del verme per ridurre al minimo la sua esposizione a patogeni dannosi. Nel nostro laboratorio, usiamo questo comportamento come strumento per identificare i geni coinvolti nel corretto funzionamento dei neuroni che mediano questo comportamento. Il comportamento di evitamento del prato è un semplice test, tuttavia si sviluppa nel corso di molte ore.Quindi, è conveniente se il te...

Video: Autore in primo piano: un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans  

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually leave their food source and prefer to remain outside the bacterial lawn. The assay is an easy way to test the worms' ability to sense external or internal cues to properly respond to harmful conditions. Though a simple assay, counting is time consuming, particularly with multiple samples, and assay durations that span overnight are inconvenient for researchers. An imaging system that can image many plates over a long period is useful but costly. Here, we describe a smartphone-based imaging method to record lawn avoidance in C. elegans. The method requires only a smartphone and a light emitting diode (LED) light box, to serve as a transmitted light source. Using free time-lapse camera applications, each phone can image up to six plates, with sufficient sharpness and contrast to manually count worms outside the lawn. The resulting movies are processed into 10 s audio video interleave (AVI) files for every hourly time point, then cropped to show each single plate to make them more amenable for counting. This method is a cost-effective way for those looking to examine avoidance defects and can potentially be extended to other C. elegans assays.

This article describes a simple, low-cost method of recording the lawn avoidance behavior of Caenorhabditis elegans, using readily available items such as a smartphone and a light emitting diode (LED) light box. We also provide a Python script to process the video file into a format more amenable for counting.

Ricerca

Comportamento

Setting up the Imaging Apparatus for C. elegans Lawn Avoidance Assay

Setting up the Imaging Apparatus for C. elegans Lawn Avoidance Assay  

To set up the imaging apparatus, use a smartphone with a minimum specification of 12 megapixel camera 1080 pixel resolution, five gigabyte storage space, in a timeLapse video app from the application store. Place the LED light box on the bottom rack of an incubator set at 25 degrees Celsius where the assay will take place. To hide the dotted pattern on the LED light surface, spread two sheets of tissues to cover the entire surface of the LED box.Make an elevated stage for the specimen comprising of a clear plastic sheet supported by hollow rectangular tunnels. Ensure that the tunnel's walls are somewhat dark to minimize light scatter. Place another rack above the stage to place the phones for recording.Each phone will record three to six plates, so adjust the rack height accordingly. Put a power strip inside the incubator to plug in the phones during overnight recording. To prepare for the recording, plug in the smartphone to the power strip connected to a power outlet.Ensure to disable the auto lock setting to prevent the phone from returning to the lock screen while recording. Open the timelapse camera app, and set the video quality to 1080 pixels at 30 frames per second. Set the timelapse interval to two seconds.Place the smartphone with the screen facing up to record with the back camera and ensure that the paper box tunnels fit within the field of view.

Messa a punto dell'apparato di imaging per il saggio di prevenzione del prato di C. elegans

C. elegans Lawn Avoidance Assay

C. elegans Lawn Avoidance Assay  

Using a platinum wire pick, transfer 30 synchronized L4 stage worms to the PA14 plate. Place the worms in the middle of the PA14 bacteria lawn. In this study, for each condition, two plates were tested.Place the two plates on the elevated stage of the recording apparatus with the lid facing down such that the agar side is facing up toward the camera. On the smartphone screen, tap where the plate is, so the camera can focus on the assay plates. Start the recording, then add more plates to the stage.Record for 20 hours from the last set of plates placed on the stage. In the final time-lapse video, 20 hours of recording will result in a 20-minute-long video. Wild-type N2 worms were compared against npr-1 mutants.The wild-type worms progressively left the bacterial lawn and stayed outside. Worms outside the thick bacterial lawn were clearly seen in the video, but worms inside the bacterial lawn were harder to distinguish.

C. elegans Saggio per evitare il prato

Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay

Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay  

Identify the dimensions of a PA14 plate containing the L4 stage worms by running the Python script extract_frame.py. Then open the JPEG file in ImageJ. From the menu, choose Analyze, then Set Measurements.Ensure that the display label box is checked and close the window. Using the straight line tool, measure the diameter of a plate by drawing a line across it. Then choose Analyze, then Measure from the menu.If the video is in 1080 pixels, each plate will be about 480 pixels wide. Enter this information in the notepad to be used later and close the results window. Using the multi-point tool, mark points on the upper left side of each plate which will become the upper left corner of the cropped videos.Mark it in order of when the plates were started. After creating a point for all the plates, choose Analyze, then Measure from the menu. Measurements including the X and Y coordinates of the points will appear in the results window.To process multiple videos, repeat the process in ImageJ with other JPEG files. All X and Y coordinates will be listed in the same results window. Save the results window into a CSV file.The file should be saved to the same directory as the movie files. To find the starting time for each plate, play the movie either on the computer or phone and take note of the starting times of each set of plates placed under the camera. Open the results.csv file with the coordinates and add a start column. For each row corresponding to individual plates, enter appropriate start time in seconds under the start column. Save the file.To crop and trim the videos, run the crop_n_trim. py script. Choose the results.csv file. Enter the plate dimensions and the pixel value noted earlier. The script will now read each row of the results.csv file to find the correct movie file after the script finishes running. A folder will appear with the same name as the movie, followed by the start time in which videos corresponding to the assay will be saved. For manual counting, open each AVI file in ImageJ.Count the worms that are visible outside the lawn and then calculate the occupancy rate for each time point. The wild type N2 worms progressively left the bacterial lawn and stayed outside as noted in the occupancy rate over time. The counts made directly from the plates were compared against counts from imaged worms.The counts made from imaged worms turned out to be highly accurate. When three trials for each strain were averaged together, the N2 and NPR1 strains yielded 99.5%and 96.2%accuracy respectively.