Questo protocollo rileva accuratamente le caratteristiche di ripiegamento cromosomico su scale di lunghezza multipla con un segnale di fondo basso. Ad esempio, le interazioni del promotore enhancer possono essere analizzate nel contesto dei compartimenti cromosomici. L'uso di endonucleasi di restrizione aggira l'ottimizzazione del livello di digestione del materiale in ingresso.
Non è richiesta alcuna selezione mediante isolamento del gel per catturare i prodotti di legatura. Il problema più comune è la perdita di cellule dopo la fissazione del DSG e la cattura di abbastanza DNA per produrre librerie di alta qualità. Per iniziare, aspirare il mezzo con una pipetta Pasteur accoppiata a una trappola a vuoto dalla piastra da 150 millimetri contenente 5 per 10 alla sesta cella.
Lavare le celle due volte con 10 millilitri di HBSS. Per reticolare le cellule, versare 23,125 millilitri della soluzione di formaldeide all'1% nella piastra da 15 centimetri. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, dondolando delicatamente la piastra a mano ogni due minuti.
Quindi, aggiungere 1,25 millilitri di glicina 2,5 molare e ruotare delicatamente la piastra per estinguere la reazione di reticolazione, prima di incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Continuare l'incubazione sul ghiaccio per 15 minuti per interrompere la reticolazione. Raschiare le celle dalla piastra con un raschietto cellulare o un poliziotto di gomma e trasferire la sospensione della cella in un tubo conico da 50 millilitri con una pipetta.
Centrifugare la sospensione a 1.000 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante mediante aspirazione. Lavare il pellet una volta con 10 millilitri di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco, o DPBS. Quindi, centrifugare di nuovo prima di procedere alla reticolazione DSG.
Per la reticolazione con DSG, risospendere le celle pellettate in 9,9 millilitri di DPBS. Quindi, aggiungere 100 microlitri di DSG da 300 millimolari. Mescolare il tubo per inversione e reticolare le celle a temperatura ambiente per 40 minuti su un rotatore.
Dopo la reticolazione, aggiungere 1,925 millilitri di glicina 2,5 molare, invertire per mescolare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, centrifugare le cellule a 2.000 volte G per 15 minuti e risospendere il pellet in un millilitro di albumina sierica bovina allo 0,05% DPBS prima di trasferirlo in un tubo da 1,7 millilitri. Centrifugare le cellule a 2.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante.
Congelare il pellet in azoto liquido prima di procedere alla cattura della conferma cromosomica. Risospendere l'aliquota della cellula reticolata in un millilitro di tampone di lisi ghiacciato contenente 10 microlitri di cocktail inibitore della proteasi e trasferirlo in un omogeneizzatore Dounce per 15 minuti di incubazione su ghiaccio. Spostare lentamente il pestello A su e giù 30 volte per omogeneizzare le cellule e incubare per un minuto per consentire alle cellule di raffreddarsi prima di altri 30 colpi.
Dopo l'ultimo colpo, trasferire il lisato in un tubo da 1,7 millilitri. Centrifugare la sospensione lisata a 2.500 volte G per cinque minuti. Scartare il surnatante e scorrere o vortice per risospendere il pellet bagnato.
Rimuovere il più possibile il surnatante per ottenere una sostanza simile allo yogurt con grumi minimi. Risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone di restrizione ghiacciato prima della centrifugazione. Dopo il secondo lavaggio, risospendere il pellet in 360 microlitri di tampone di restrizione mediante pipettaggio dopo aver aggiunto circa 340 microlitri al volume di trascinamento del pellet, a seconda delle dimensioni della cella.
Mettere da parte 18 microlitri di lisato per testare l'integrità della cromatina, o CI.To il lisato rimanente, aggiungere 38 microlitri di 1% di sodio dodecilsolfato al tubo hi-C per ottenere un volume totale di 380 microlitri e mescolare accuratamente mediante pipettaggio senza introdurre bolle. Incubare i campioni a 65 gradi Celsius senza agitare per 10 minuti per aprire la cromatina. Quindi, posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio.
Dopo aver preparato la miscela di digestione con Triton X-100, aggiungere 107 microlitri di questa miscela al tubo hi-C per ottenere un volume totale di 487 microlitri e digerire la cromatina durante la notte a 37 gradi Celsius in un termomixer con agitazione a intervalli. Il giorno successivo, trasferire i campioni a 65 gradi Celsius per 20 minuti per disattivare l'attività endonucleasi rimanente. Dopo aver posizionato il campione sul ghiaccio, mettere da parte 10 microlitri di controllo della digestione, o DC, e conservarli a quattro gradi Celsius.
Rimuovere la condensa dal coperchio con una pipetta o ruotando. Quindi, aggiungere 58 microlitri di miscela di riempimento di biotina per ottenere un volume totale di 535 microlitri. Pipettare delicatamente senza formare bolle prima di incubare a 23 gradi Celsius per quattro ore in un termomiscelatore.
Dopo l'incubazione, aggiungere 665 microlitri di miscela di legatura, rendendo il volume del campione 1.200 microlitri. Mescolare il campione mediante pipettaggio e incubare a 16 gradi Celsius per quattro ore in un termomiscelatore. Quindi, aggiungere 50 microlitri di proteinasi-K in due frazioni alla provetta hi-C e incubare durante la notte a 65 gradi Celsius con agitazione a intervalli.
Per la purificazione del DNA, aggiungere etanolo ghiacciato al 100% e centrifugare i tubi a 18.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere completamente il surnatante dal lato non pellet e asciugare all'aria il campione per 10 minuti o fino a quando i pellet sono visibilmente asciutti. Una volta che i pellet sono asciutti, solubilizzarli in 450 microlitri di Tris a basso EDTA mediante pipettaggio o vortice.
Trasferire la sospensione solubilizzata in un'unità filtrante centrifuga da 0,5 millimetri, o CFU, con un limite di peso molecolare di tre kilodalton. Centrifugare il CFU alla massima velocità per 10 minuti ed eliminare il flusso passante. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 80 microlitri di Tris a basso contenuto di EDTA alla colonna.
Trasformare la colonna in un nuovo tubo di raccolta per due minuti di centrifugazione alla massima velocità. Infine, caricare i campioni su un gel di agarosio allo 0,8%. Il gel di agarosio con risultati di titolazione PCR ha dimostrato che la maggior parte delle librerie richiede da cinque a otto cicli di amplificazione finale della PCR.
La digestione cellulare della libreria finale di PCR amplificata, come osservato da frammenti più piccoli su un gel di agarosio, conferma la presenza di giunzioni di legatura corrette e serve come controllo di qualità prima del sequenziamento. Dopo il sequenziamento, i dati mappati hanno mostrato che la combinazione di DpnII e DdeI aumenta significativamente i contatti a corto raggio, aggiungendo DSG alla reticolazione convenzionale della formaldeide. Un segnale migliorato potrebbe anche essere osservato a lunghe e brevi distanze direttamente dalle matrici di interazione 2D.
I segnali compartimentali sono CRISPR a lunghe distanze e i punti formati dai loop della cromatina sono più prominenti a brevi distanze. Oltre alla formaldeide, il cross-linking con DSG diminuisce le legature casuali, migliorando la copertura relativa in cis. È importante non perdere cellule durante e dopo la reticolazione.
I pellet cellulari possono essere sciolti o invisibili e le cellule possono attaccarsi alle punte delle pipette in alcuni dei tamponi.
