Questo protocollo è significativo in quanto mostra loop cromosomici ad alta risoluzione e altre caratteristiche di interazione a corto raggio. Il vantaggio principale di questa tecnica è la mappatura dell'organizzazione del genoma 3D con risoluzione nucleosomica con un elevato rapporto segnale/rumore. Per eseguire la titolazione MNasi, scongelare un pellet di una volta 10 alla sesta cellula su ghiaccio per 10 minuti, quindi risospendere le cellule in 500 microlitri di DPBS e incubare la sospensione cellulare su ghiaccio per 20 minuti.
Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 10.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. Risospendere le celle pellettate in 500 microlitri di tampone MB Numero uno. Scongelare un flaconcino da 20 unità per microlitro di MNasi e diluirlo con 10 millimolari di Tris per le condizioni di digestione descritte nel testo.
Con opportuni intervalli di tempo da 10 a 20 secondi, aggiungere un microlitro della prima soluzione di digestione MNase a una delle quattro provette, vorticare e incubare in un ThermoMixer a 37 gradi Celsius per 10 minuti a 800 giri/min. Continuare ad aggiungere un microlitro dalle rimanenti diluizioni MNase alle altre aliquote cellulari. Arrestare la digestione della MNasi aggiungendo 200 microlitri di tampone di arresto appena preparato a ciascuna provetta nello stesso ordine e nello stesso intervallo di tempo in cui è stata aggiunta la MNasi.
Incubare a 65 gradi Celsius per due ore. Aggiungere 500 microlitri di PCI a ciascun campione e mescolare accuratamente mediante vortice. Centrifugare a 19,800 G per cinque minuti a temperatura ambiente per separare le fasi.
E trasferire la fase acquosa in nuovi tubi. Purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione del DNA commerciale secondo le istruzioni del produttore ed eluire i campioni in 12 microlitri di tampone di eluizione. Aggiungere da due a cinque microlitri di colorante di carico al campione di DNA purificato.
Eseguire i campioni su un gel di agarosio all'1,5% e scegliere il miglior grado di digestione per l'esperimento. Un grado di digestione ottimale mostra pochi o nessun frammento subnucleosomiale e un rapporto tra mononucleosoma e dinucleosoma dal 70 al 90%. In questo campione rappresentativo, è stato selezionato un grado di digestione intermedio tra le corsie tre e quattro per gli esperimenti di follow-up.
In base alla titolazione MNasi, digerire la cromatina aggiungendo la quantità appropriata di MNasi a ciascuna aliquota del campione. Mescolare bene e incubare nel ThermoMixer a 37 gradi Celsius, 800 RPM per 10 minuti. Arrestare la digestione della MNasi aggiungendo 1,6 microlitri di EGTA molare 0,5 a ciascuna aliquota e incubare in un ThermoMixer a 65 gradi Celsius per 10 minuti con agitazione a 800 giri/min.
Raccogliere il campione mediante centrifugazione a 10.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone NEB 1X 2.1. Raggruppare campioni equivalenti a un input di cinque volte 10 alla sesta cella o meno per l'ulteriore elaborazione.
Prima di procedere alla legatura di prossimità, trasferire il 10% del campione come controllo in ingresso per monitorare il livello di digestione della MNasi. Aggiungere 150 microlitri di Tris 10 millimolari, 25 microlitri di SDS al 10% e 25 microlitri di proteinasi K da 20 milligrammi per millilitro al controllo della digestione e incubare per una notte a 65 gradi Celsius. Raccogliere il campione rimanente mediante centrifugazione a 10.000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante.
Risospendere il pellet in 90 microlitri di Micro-C master mix one appena preparato e incubare in un ThermoMixer a 37 gradi Celsius, 800 giri/min per 15 minuti. Aggiungere 10 microlitri di cinque unità per microlitro di frammento di Klenow e incubare in un ThermoMixer. Quindi aggiungere 100 microlitri di Micro-C master mix due appena preparato.
Incubare per 45 minuti a 25 gradi Celsius, 800 RPM, e spegnere la reazione enzimatica con EDTA come descritto nel testo. Incubare in un termomiscelatore per 20 minuti a 65 gradi Celsius, 800 giri/min. Raccogliere il campione mediante centrifugazione a 10.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante.
Risospendere il campione in 500 microlitri di Micro-C master mix tre appena preparato e incubare per 2,5 ore a temperatura ambiente a 15-20 giri/min. Ripetere la centrifugazione e rimuovere il surnatante. Quindi risospendere il campione in 200 microlitri di Micro-C master mix quattro appena preparato e incubare in un ThermoMixer impostato a 37 gradi Celsius per 15 minuti a 800 giri/min.
Per la reticolazione inversa e la deproteinazione, aggiungere 25 microlitri di proteinasi K da 20 milligrammi per microlitro e 25 microlitri di SDS al 10% e incubare a 65 gradi Celsius durante la notte con miscelazione intermittente. Aggiungere 500 microlitri di PCI ai campioni e al controllo dell'ingresso, quindi miscelare mediante vortice. Separare le fasi mediante centrifugazione a 19, 800 G per cinque minuti e trasferire la fase acquosa superiore in una provetta fresca.
Concentrare il DNA ed eluire i campioni in 30 microlitri e i controlli di ingresso in 15 microlitri. Eseguire un gel di agarosio all'1,5% per separare i mononucleosomi e i dinucleosomi. Asportare i frammenti di DNA che hanno una dimensione dinucleosomiale ed estrarre il DNA come descritto nel testo.
Aggiungere 150 microlitri di microsfere pre-preparate a 150 microlitri del campione e incubare a temperatura ambiente. Posizionare i tubi in un magnete appropriato e attendere che la soluzione si schiarisca. Rimuovere il surnatante e risospendere le perle in 300 microlitri di TBW 1X e ripetere questo passaggio.
Ripetere la separazione magnetica e, dopo che la soluzione si è eliminata, rimuovere il surnatante e risospendere le perle in 100 microlitri di 0,1X TE. Ripetere e risospendere in 50 microlitri di 0,1X TE. Trasferire la soluzione nelle provette PCR ed eseguire la manipolazione del DNA come descritto nel testo. Al termine della legatura dell'adattatore, lavare il campione in TBW 1X, scartare il surnatante e risospendere le perle in 20 microlitri di TE 0,1X. Ottimizzare il numero di cicli di PCR e amplificare le librerie di sequenze come descritto nel testo. La cromatina di 250.000 cellule per reazione è stata digerita con una diluizione quadruplicata di MNasi.
La concentrazione più alta, 10 unità, ha mostrato una cromatina sovradigerita costituita quasi esclusivamente da DNA mononucleosomiale. La digestione di 250.000 cellule ES di topo con 0,625 unità di MNasi ha offerto il punto di partenza più promettente per la digestione preparativa negli esperimenti Micro-C. Tuttavia, dovrebbe essere presa in considerazione una concentrazione intermedia di MNasi tra le condizioni mostrate nelle corsie tre e quattro, corrispondente a cinque unità per 1 milione di cellule.
La banda dei mononucleosomi legati di prossimità aveva una dimensione approssimativa di 300 coppie di basi, simile a quella dei dinucleosomi. Pertanto, il rapporto del segnale della banda mono-dinucleosomiale si è spostato dai mononucleosomi verso i dinucleosomi. La qualità e la quantità della libreria di sequenziamento preparata sono state valutate tramite PCR minima.
La visualizzazione ha mostrato una banda distinta a 420 coppie di basi e nessuna banda per i dimeri dell'adattatore. Mentre entrambi i campioni in questo studio hanno mostrato alti tassi di mappatura, il campione buono aveva una frazione più alta di letture cis. Un alto tasso di interazioni transcromosomiche indica eventi di legatura casuali, anche se alcune interazioni transcromosomiche potrebbero essere importanti.
Inoltre, il buon campione aveva un tasso moderato di coppie di lettura di mappatura avanti-indietro, con distanze inferiori a 500 coppie di basi. Ciò ha indicato un basso tasso di dinucleosomi non scissi dalla MNasi con dimensioni simili a due nucleosomi legati di prossimità. Un corretto grado di digestione della MNasi è fondamentale per questo esperimento.
I nucleosomi sovradigeriti sono legati in modo inefficiente e la cromatina sottodigerita ha una grande frazione di dinucleosomi non digeriti che possono contaminare la libreria di sequenziamento. Micro-C può essere combinato con un approccio di cattura per mappare l'organizzazione del genoma locus-specifica con una risoluzione enormemente elevata.
