Finanziato dalla NSF (0.854.551).

1. Pre-sperimentale Preparazione <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni (cfr. tabella 1 per le composizioni): (a) 1 NFR litro (Ringer Rana normale), (b) soluzione fisiologica 100 ml al 10%, (c) 100 ml di CMF (Ca 2 + / Mg 2 + soluzione senza ), (d) 1 ml ITS (Insulin-transferrina-selenio, Sigma I1884), (e) 100 ml di mezzo L-15 cultura, (f) 10 ml HCG (gonadotropina corionica umana Sigma CG-10), (g) 100 ml K +-soluzione interna, (h) 100 ml K +-interna soluzione Amfotericina B. La forza osmotica della soluzione 1 dovrebbe essere controllata per assicurarsi che esso è di circa 260 mOsm osmometro utilizzando una pressione di vapore (ad esempio modello Wescor # 5100C) . </li><li> Filtrare sterilizzare soluzioni (b) e (c). Soluzioni (a) (b) e (c) possono essere memorizzati fino a tre mesi a 4 ° C. Preparare la soluzione (d) aggiungendo 1 ml H 2 O deionizzata al flaconcino contenente la polvere liofilizzata attraverso un ago calibro 25 e filtro siringa siringa. Questa soluzione finale cun essere conservato a 4 ° C per 30 giorni. </li><li> Preparare la soluzione (e) in una cappa a flusso laminare combinando tutti i componenti in un becher o beuta. Filtrare sterilizzare la soluzione finale e trasferire aliquote da 10 ml in provette per centrifuga sterili. Conservare a -20 ° C. </li><li> Preparare la HCG (soluzione (f)) aggiungendo 10 ml H 2 0 deionizzata al flaconcino contenente la polvere liofilizzata attraverso un ago calibro 25 e filtro siringa siringa. Questa soluzione finale può essere conservato a 4 ° C per 30 giorni. </li><li> Realizzare almeno due utensili microdissezione incollando un perno Minutien (26.002-10, Science Tools Belle) alla fine di una pipetta Pasteur di vetro con colla di cianoacrilato. Consentire la punta del perno di estendere oltre la fine della pipetta circa 0,5 cm. </li><li> Due giorni prima la preparazione culture, indurre l&#39;allevamento con la seguente procedura. Identificare un allevamento-ready paio di Xenopus osservando un importante, cloaca rossastro sulla pigmentazione scura femminile e sul do planarerfaccia delle zampe anteriori del maschio. Uno alla, tempo netto ogni rana e tenerlo lato ventrale verso il basso su un lavandino con la rete in modo che non può sfuggire. Iniettare 1 ml di soluzione di (f) attraverso la rete e per via sottocutanea in una delle sacche linfatici dorsali. </li><li> Posizionare la coppia di riproduttori insieme in una coperta dieci galloni di acqua. Per garantire che gli animali non possano calpestare le uova di recente e di cui fecondato, installare un pavimento schermato con maglie di dimensioni pari a circa ½ &quot;montati circa 1-2 centimetri sopra il fondo del serbatoio (Figura 1A). </li><li> Lasciare inalterate le rane per 12-48 ore fino a quando gli animali sono in amplexus e uova fecondate si osservano al piano di sotto dello schermo (Figura 1B). </li><li> Rimuovere gli animali dal serbatoio, ma lasciare le uova indisturbati per almeno 24 ore più a lungo. Questa coppia di rane possono essere fatte fecondare dopo sei settimane. </li><li> Allentare gli embrioni dal fondo del serbatoio e trasferirli a quattro o cinque millimetri culto 60x15piatti ure contenenti 10% salina (soluzione B). Ordina gli embrioni per fase secondo lo schema di Niewkoop e Faber (rif. 20). Embrioni utili saranno quelli in fase di 22-24. Figura 2A mostra un embrione allo stadio di circa 22 mentre 2B figura mostra un embrione che è troppo avanti in fase di sviluppo per essere utile (circa fase 28). E &#39;importante scegliere gli embrioni che sono sani: quelli che sono lisce in apparenza con chiazze marrone chiaro e bianco sono l&#39;ideale. Gli embrioni che hanno grandi macchie nere o bianche sono generalmente malsana e inutilizzabile. </li></ol> 2. Microdissezione di embrioni di Xenopus <ol><li> All&#39;interno di una cappa a flusso laminare, etichetta e riempire a metà strada circa tre piastre di coltura sterile 60x15 mm con 10% di soluzione salina, e uno con CMF. </li><li> Utilizzando una sterile, vetro trasferimento pipetta Pasteur 5-10 22-24 embrioni in stadio uno dei piatti contenenti 10% di soluzione salina. Con l&#39;aiuto di uno zoom stereo sezionaremicroscopio zione all&#39;interno della cappa (0,6-5x con oculari 10 x), rimuovere lo strato di gelatina e la membrana vitellina da ciascun embrione con due coppie di pinze sterili N ° 5 (11251-30, strumenti per le scienze Arti). (Vedi Figure 3A e 3B). </li><li> Lavare gli embrioni nudi facendoli passare, uno alla volta, attraverso i rimanenti due piatti di 10% soluzione salina ed infine nel piatto contenente CMF. Utilizza una nuova pipetta sterile per ogni trasferimento e ridurre al minimo il volume della soluzione è trasferito da piatto a piatto. </li><li> A sua volta, ciascun embrione tenere saldamente ma delicatamente con una pinza e, utilizzando lo strumento microdissezione modellato nel passo 1,5, rimuovere il tubo neurale e myotomes associati che si trovano al aspetto più dorsale dell&#39;animale. Farlo facendo tre sezioni, una a ciascuna estremità del percorso del tubo neurale e un terzo solo ventrale ad esso (Figura 4A). Spostare ogni tubo neurale sezionato / myotome ad una parte pulita del piatto dal Granul tuorloES e altri detriti (Figura 4B). Il dorso-ventrale asse, e le posizioni del tubo neurale e myotomes sono indicati in figura 4. </li><li> Dopo circa quindici minuti in questa soluzione (CMF) pinze uso per sollevare la pelle pigmentata libera del tessuto sezionato e scartare. Dopo un ulteriore 30-60 min, le cellule formano un &quot;mucchio di sabbia&quot; come si dissociano uno dall&#39;altro (Figura 4C). </li></ol> 3. Preparazione del nervo-muscolo co-colture <ol><li> Scongelare una provetta da 10 ml di terreno di coltura e in asepsi aggiungere 70 microlitri ITS e 35 ng / ml BDNF (Sigma B3795). </li><li> Etichetta e riempire 35 capsule di Petri sterili mm (FD35-100 Strumenti di precisione del mondo) circa a metà strada con L-15 terreno di coltura (soluzione (e)), uno per ogni embrione sezionato. </li><li> Fabbricare una pipetta placcatura afferrando ciascuna estremità di una pipetta Pasteur di vetro mentre si tiene la porzione rastremata sulla fiamma. Tirare le estremità a parte per circa 10 centimetri e poi si staccano alla fine per ottenere una punta di circa 0,2 mm. </li><li> Utilizzare la pipetta placcatura per aspirare la &quot;pila sabbia&quot; da un embrione minimizzare la quantità di soluzione disegnata. Espellere le cellule sul fondo di un piatto di coltura. Piastra le cellule in diverse righe. Osservare placcati cellule indifferenziate (Figura 5A e 5B). </li><li> Lasciare i piatti a base di cellule placcati indisturbati per almeno quindici minuti per lasciare il tempo alle cellule di attaccarsi al piatto. </li></ol> 4. Patch di serraggio nervo-muscolo Sinapsi <ol><li> Dopo 12-24 ore di coltura, le cellule placcati assumono distinte caratteristiche morfologiche: cellule muscolari diventano fusiforme e neuroni spinali estendere i processi lunghi (Figura 6). Funzionale contatto sinaptico tra varicosità dei neuriti e le cellule muscolari possono essere confermate con registrazioni simultanee coppie elettrofisiologiche. &quot;M&quot;, &quot;S&quot; e &quot;V&quot; si riferiscono rispettivamente alla cellula muscolare, neuronalesoma e varici presinaptica. </li><li> Preparare due elettrodi di patch per la registrazione: uno per il varici presinaptica e uno per la cellula muscolare. </li><li> Per l&#39;elettrodo presinaptica, preparare una soluzione contenente amfotericina come segue: Aggiungere 100 microlitri di DMSO in una provetta da 1,5 ml contiene 5 mg di amfotericina B (Sigma A4888). Vortex questa soluzione per 10 sec. Successivamente, aggiungere 10 ml di questa soluzione in una provetta da microcentrifuga seconda contiene 625 K + ul-interno soluzione per Amfotericina B (soluzione di (h)). Vortice come sopra. </li><li> Riempire il pre-sinaptica elettrodo con l&#39;amfotericina contenente K +-interna soluzione preparata nella fase 4.3 e il post-sinaptica elettrodo con K +-interna soluzione (soluzione (g)). </li><li> Sostituire i media nel piatto cultura con NFR e si stabilisce in un microscopio invertito dotato di ottica di contrasto di fase. </li><li> Posizionare entrambi gli elettrodi appena sopra i rispettivi obiettivi. Ottenere l&#39;intera co-cellnfiguration con l&#39;elettrodo cellula muscolare prima configurazione di patch perforato con l&#39;elettrodo varici. </li><li> Per confermare la funzionalità della sinapsi, depolarizzare il varici con un amplificatore patch clamp (es Axopatch 200B, Molecular Devices) sotto controllo software (ad esempio pClamp 9, Molecular Devices) sia per la corrente simultanee presinaptici e postsinaptici. Figura 7 mostra le correnti viste in risposta a depolarizzante fasi di tensione dati al varici presinaptico con incrementi di 10 mV da -30 mV a +40 mV. Le correnti attivo visti nella cellula presinaptica sono portati da Na + e Ca 2 + e le correnti esteriori di K +. Le correnti registrate nella cellula postsinaptica sono risposte a neurotrasmettitore rilasciato dal varici e si svolgono per lo più da Na + attraverso i canali recettore nicotinico dell&#39;acetilcolina. </li></ol>

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	<li>Augustine, G. J., Eckert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divalent+cations+differentially+support+transmitter+release+at+the+squid+giant+synapse.">Divalent cations differentially support transmitter release at the squid giant synapse.</a> J. Physiol. 346, 257-271 (1984).</li><li>Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+action+potential+mechanism+of+amphibian+neurons+isolated+in+culture.">The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641 (1976).</li><li>Weldon, P. R., Cohen, M. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+presynaptic+Ca2++dynamics+during+neurotransmitter+release+with+Ca2+-activated+K++channels.">Tracking presynaptic Ca2+ dynamics during neurotransmitter release with Ca2+-activated K+ channels.</a> Nat. Neurosci. 3, 566 (2000).</li><li>Sun, X. P., Chen, B. M., Sand, O., Kidokoro, Y., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-induced+Ca2++entry+preferentially+evokes+release+of+large+quanta+in+the+developing+Xenopus+neuromuscular+junction.">Depolarization-induced Ca2+ entry preferentially evokes release of large quanta in the developing Xenopus neuromuscular junction.</a> J. Neurophysiol. 104 (5), 2730-2740 (2010).</li><li>Xie, S. P., Poo, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+synaptotagmin+modulates+short-term+synaptic+plasticity+at+developing+neuromuscular+junctions.">Overexpression of synaptotagmin modulates short-term synaptic plasticity at developing neuromuscular junctions.</a> Neuroscience. 82 (4), 969-978 (1998).</li><li>Lu, B., Czernik, A. J., Popov, S., Wang, T., Poo, M. M., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+synapsin+I+correlates+with+maturation+of+the+neuromuscular+synapse.">Expression of synapsin I correlates with maturation of the neuromuscular synapse.</a> Neuroscience. 74 (4), 1087-1097 (1996).</li><li>Schaeffer, E., Alder, J., Greengard, P., Poo, M. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-dependent+regulation+of+neurotransmitter+specification+and+embryonic+neuronal+calcium+spike+activity.">Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity.</a> J. Neurosci. 30 (16), 5792-5801 (2010).</li><li>Niewkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1967).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Passaggi chiave nel successo di co-coltura dei motoneuroni e le cellule muscolari sono l&#39;uso di embrioni prodotti opportunamente messo in scena dalla riproduzione indotta delle rane Xenopus, e la dissezione attenta asettica dei neuroni spinali e mioblasti indifferenziati. Uova fecondate deve essere lasciato indisturbato fino a raggiungere circa il 10 o in scena in modo da farli muovere prima spesso si ferma il loro sviluppo. Embrioni sani sono identificati da un aspetto liscio e una colorazione marrone e bianco screziato. Fase 22-24 embrioni sono i più utili, perché questo è il punto durante lo sviluppo solo dopo la chiusura del tubo neurale e prima che i miociti sono differenziate in modo significativo. Inoltre, le cellule di embrioni anziani non dissociare bene in CMF. Si deve prestare attenzione durante la rimozione della membrana vitellina quanto aderisce fortemente l&#39;embrione. La membrana deve essere lacerato usando pinze taglienti modo che l&#39;embrione emerge intatto. Un altro importante precaution è quello di posizionare con cura le cellule sul fondo del piatto cultura (piuttosto che lasciare a sistemarsi lì). Questo metodo è preferito poiché ciò aumenta la probabilità che le cellule aderiscono al piatto di coltura. Neurotrasmissione funzionale tra nervo e muscolo può essere determinato con la registrazione solo postsinaptico e spesso può essere accertata con l&#39;osservazione di contrazione muscolare spontanea dopo innervazione. Un-cellule muscolari innervate non contorcersi nella cultura. Registrazione postsinaptico solo è utile per registrare correnti endplate in miniatura o potenziali, ma le misure di rilascio evocato richiede la stimolazione presinaptica, e la correlazione delle correnti pre-e postsinaptici richiede il doppio del patch-clamp. Oltre al paired-cerotto metodo di registrazione descritto qui, questa preparazione offre la possibilità di introdurre una pipetta terzo al neuronale soma 5 Questo consente la generazione di un potenziale d&#39;azione that può propagare al varici presinaptica e portare al rilascio di neurotrasmettitore. Inoltre, agenti putativi che si pensa di mediare o modulare la trasmissione sinaptica può essere introdotto per entrambi i lati della sinapsi: tramite la pipetta cellula muscolare o per diffusione da una pipetta terzo posto al soma.

<table border="1"><tbody><tr><td> Attrezzature / Forniture </td><td> Venditore </td><td> Catalogo / Numero di modello </td><td></td></tr><tr><td> Insulina-transferrina-selenio </td><td> Sigma </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> Gonadotropina corionica umana </td><td> Sigma </td><td> CG-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pressione di vapore osmometro </td><td> Wescor </td><td> 5100C </td><td></td></tr><tr><td> Minutien Pins </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 26002-10 </td><td></td></tr><tr><td> Amfotericina B </td><td> Sigma </td><td> A4888 </td><td></td></tr><tr><td> Forcipe </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11251-30 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Soluzione Nome </td><td> Ricetta </td></tr><tr><td> (A) NFR (Ringer rana normale (in mM) </td><td> 116 NaCl, KCl 2, CaCl 2 1,8, 5 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (B) soluzione salina al 10% </td><td> 10 ml NFR 90 ml di H 2 O deionizzata </td></tr><tr><td> (C) CMF (Ca 2 + / Mg 2 + senza soluzione) </td><td> 125 NaCl, 2 KCl, 1.2 EDTA, 5 Na +-HEPES, pH 7.35. </td></tr><tr><td> (E) Media L-15 Cultura </td><td> 50 ml L-15 supporti (Sigma L1518) + 50 NFR ml. </td></tr><tr><td> (G) + K-soluzione interna (in mM) </td><td> 116 KCl, NaCl 1, 1 MgCl 2, 10 EGTA, 5 HEPES, pH 7,3 </td></tr><tr><td> (H) K +-interna soluzione Amfotericina B (in mM) </td><td> 52 K 2 SO 4, 38 KCl, EGTA 1, 5 HEPES, pH 7,3 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table> Table 1.

simultaneous pre- and post-synaptic electrophysiological recording from xenopus nerve-muscle co-cultures

Molte informazioni circa l&#39;accoppiamento di presinaptici correnti ioniche, con il rilascio di neurotrasmettitore è stato ottenuto da preparati invertebrati, in particolare il calamaro gigante sinapsi 1. Tuttavia, fatta eccezione per la preparazione descritto qui, preparazioni vertebrati esistono pochi in cui è possibile effettuare misure simultanee di rilascio di neurotrasmettitore e presinaptici correnti ioniche. Embrionali motoneuroni Xenopus e cellule muscolari possono essere coltivate insieme in mezzo di coltura semplice a temperatura ambiente; formeranno sinapsi funzionali entro 12-24 ore, e può essere usato per studiare nervo e lo sviluppo delle cellule muscolari e interazioni sinaptiche per diversi giorni (fino crescita eccessiva si verifica). Alcuni vantaggi di questi co-colture oltre preparazioni vertebrati comprendono la semplicità di preparazione, la capacità di mantenere le culture e lavorare a temperatura ambiente, e la pronta accessibilità delle sinapsi formate 2-4. Il preparato è stato ampiamente utilizzato per studiare le proprietà biofisiche dei canali ionici presinaptici e la regolamentazione di rilascio del trasmettitore 5-8. Inoltre, la preparazione si è prestata ad altri usi compresi lo studio dei neuriti e sinaptogenesi 9-12, meccanismi molecolari di neurotrasmettitore rilascio 13-15, il ruolo di messaggeri diffusibili in neuromodulazione 16,17, e nella plasticità sinaptica vitro 18 - 19.

Figura 4B mostra la vista dorsale di un isolato midollo spinale / myotome immediatamente dopo la sua rimozione da uno stadio embrionale di Xenopus 22. Figura 4C mostra che, dopo la soluzione per la rimozione della pelle e incubazione in Ca 2 +-Mg 2 + senza soluzione (CMF, ( c)), le cellule si dissociano in un &quot;mucchio di sabbia&quot; e sono pronti per la placcatura. Subito dopo la placcatura in cellule terreno di coltura mostrano poca variabilità morfologica (Figura 5B), ma assumono forme distinte dopo ventiquattro ore di cultura. Cellule muscolari diventano fusiforme mentre neuroni rimangono sferica mentre neuriti che si estendono varicosites elaborati in sinapsi con cellule muscolari (Figura 6). Registrazione simultanea di patch accoppiato dal varici presinaptica e postsinaptica delle cellule muscolari (Figura 7) rivela le correnti presinaptici entrata e di uscita associati con il rilascio di neurotrasmettitore e il resultant eccitatori correnti postsinaptiche. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1 A:.. Paio Allevamento di rane nel secchio di accoppiamento in cima schermo B: Frogs in amplexus con le uova fecondate. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2:.. Fase di &quot;adatto&quot; 22 embrione B: fase di &quot;non idoneo&quot; 28 embrioni. Barra della scala corrisponde a 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3:. Tappa 22 embrione prima della rimozione della membrana vitellina e cappotto gelatina. La freccia indica il bordo esterno del mantello gelatina. La membrana vitellina aderisce strettamente alla Embranni ed è praticamente invisibile B:. embrione Bare. Barra della scala corrisponde a 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4 A: Fase 22 embrione con una linea tratteggiata che indica a essere sezionato parte B:.. Acuto isolato porzione dorsale dell&#39;embrione, &quot;d&quot; e &quot;v&quot; si riferiscono agli aspetti dorsale e ventrale degli embrioni, mentre &quot;m&quot; e &quot;n&quot; indica la posizione approssimativa dei mytomes e il tubo neurale C:. &quot;mucchio di sabbia&quot; di cellule dopo 60 min in CMF. Barra della scala rappresenta 1 mm per A, e 0,5 mm per B e C. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5 A:. Vista potenza 5x di cellule in coltura immediatamente dopo fasciame. B: la cultura stessa a 40x. Scalabarra rappresenta 40 pm per A, e 5 micron per la B. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Giunzione neuromuscolare in coltura con identificazione del soma neuronale (S), varici presinaptico (V), e la cellula muscolare postsinaptica (M). Scala bar: 5 micron. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7.jpg" alt="Figura 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7highres.jpg"/> Figura 7. Presinaptici (in alto) e postsinaptici (basso) correnti osservate in risposta all&#39;applicazione di tensione 10 mV incrementale passaggi presentati al varici presinaptica da -30 mV a +40 mV. Gradini di tensione sono indicati accanto ad alcune delle tracce presinaptici. Il potenziale di mantenimento per entrambe le celle era -70 mV.

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Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Questo video mostra le procedure utilizzate per coltivare colture primarie di embrionale<em&gt; Xenopus</em&gt; Cellule nervose e muscolari e l&#39;utilità di questo preparato per la realizzazione simultanea di pre-e post-sinaptica registrazioni patch clamp.

Simultanea di pre-e post-sinaptica registrazione elettrofisiologica da<em&gt; Xenopus</em&gt; Nervo-muscolo Co-colture

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

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Neuroscience

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

10.8K Views.  David Geffen School of Medicine at UCLA. Questo video mostra le procedure utilizzate per coltivare colture primarie di embrionale Xenopus Cellule nervose e muscolari e l'utilità di questo preparato per la realizzazione simultanea di pre-e post-sinaptica registrazioni patch clamp.

Video: Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

Derivazione di Arricchito Culture oligodendrociti e degli oligodendrociti / Neuron mielinizzanti co-culture di tessuti murini post-natale

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

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Neuroscienze

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Culture Explant neurali di<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Proencefalo registrazione elettrofisiologica in larvale Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Registrazione elettrofisiologica nel cervello di intatto Zebrafish adulti

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant characteristics.&#160;This precludes a rational selection of a particular implant as optimal for a particular application and the development of new materials based on the most critical performance parameters.&#160;This article develops a protocol for in vitro and in vivo testing of neural recording electrodes.&#160;Recommended parameters for electrochemical and electrophysiological testing are documented with the key steps and potential issues discussed.&#160;This method eliminates or reduces the impact of many systematic errors present in simpler in vivo testing paradigms, especially variations in electrode/neuron distance and between animal models.&#160;The result is a strong correlation between the critical in vitro and in vivo responses, such as impedance and signal-to-noise ratio.&#160;This protocol can easily be adapted to test other electrode materials and designs.&#160;The in vitro techniques can be expanded to any other nondestructive method to determine further important performance indicators.&#160;The principles used for the surgical approach in the auditory pathway can also be modified to other neural regions or tissue.

Different electrode coatings affect neural recording performance through changes to electrochemical, chemical and mechanical properties. Comparison of electrodes in vitro is relatively simple, however comparison of in vivo response is typically complicated by variations in electrode/neuron distance and between animals. This article provides a robust method to compare neural recording electrodes.

Un metodo per la sistematica elettrochimici ed elettrofisiologiche di valutazione dei neurali registrazione elettrodi

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

Elettrofisiologici Registrazione da<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

Registrazione simultanea elettrofisiologici e micro-iniezioni di agenti inibitori nel cervello del roditore

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the electrical responses of the retina to light stimulation, while the VEP measures the corresponding functional integrity of the visual pathways from the retina to the primary visual cortex following the same light event. The ERG waveform can be broken down into components that reflect responses from different retinal neuronal and glial cell classes. The early components of the VEP waveform represent the integrity of the optic nerve and higher cortical centers. These recordings can be conducted in isolation or together, depending on the application. The methodology described in this paper allows simultaneous assessment of retinal and cortical visual evoked electrophysiology from both eyes and both hemispheres. This is a useful way to more comprehensively assess retinal function and the upstream effects that changes in retinal function can have on visual evoked cortical function.

This protocol describes simultaneous measurement of electroretinogram and visual evoked potentials in anesthetized rats.

Registrazione simultanea di elettroretinografia e Potenziali evocati visivi nei ratti anestetizzati

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the ...