Abbiamo sviluppato un protocollo robusto in cui è possibile eseguire più cicli di ibridazione in situ sullo stesso cervello di drosophila, consentendo la visualizzazione dei modelli di espressione di molti geni diversi. L'inclusione del cervello del moscerino in un idrogel garantisce un'eccellente integrità dei tessuti e stabilità dell'mRNA in più cicli di ibridazione. Inoltre, migliora significativamente la chiarezza ottica durante l'imaging.
EASI-FISH può essere adottato da qualsiasi laboratorio con un microscopio confocale o a foglio ottico per definire i profili di espressione genica dei tipi di cellule nel cervello della mosca. Per iniziare, pulire un vetrino non carico con un reagente di decontaminazione dell'RNA. Rimuovere la pellicola opaca che protegge l'adesivo dalla guarnizione in silicone.
Successivamente far aderire alla slitta la guarnizione contenente fino a quattro camere. Utilizzare una pipetta P20 per rivestire la superficie di ogni camera con un microlitro di polilisina. Successivamente, trasferire fino a quattro cervelli di drosophila per provetta in una provetta PCR da 0,2 millilitri.
Reidratare il cervello in 150 microlitri di PBS contenente lo 0,1% di Triton X-100 seguito da PBS. Aggiungere 40 microlitri di PBS in ogni camera. Con un paio di pinzette sottili, posiziona delicatamente i cervelli in fila al centro della camera, lasciando un po' di spazio tra di loro.
Rimuovere il PBS dalla camera e aggiungere immediatamente 50 microlitri di tampone MOPS da 20 millimolari. Mentre i cervelli sono in equilibrio nel tampone MOPS, pipettare volumi uguali di Melphalan-X scongelato in una provetta con tampone MOPS di uguale volume. Quindi aggiungere la soluzione madre di Ac-X in un rapporto di uno a 100.
Agitare la soluzione e girarla brevemente per raccoglierla. Rimuovere tutto il tampone MOPS dalle camere e aggiungere 50 microlitri della soluzione Melphalan-X Ac-X. Posizionare un vetrino coprioggetto sopra ogni camera senza utilizzare l'adesivo per guarnizioni per la sigillatura.
Quindi posizionare la camera in una scatola umidificata. Il giorno successivo, rimuovere con cautela il vetrino coprioggetto e aspirare la soluzione di Melphalan-X Ac-X. Lavare due volte il cervello montato in 100 microlitri di PBT allo 0,1%, seguiti da 100 microlitri di PBS.
Porre le soluzioni scongelate di TREx-1000 4-idrossi-TEMPO, TEMED e persolfato di ammonio su ghiaccio. Agitare la soluzione TREx-1000 per assicurarsi che non vi siano precipitati. Mescolare le soluzioni per preparare una soluzione in gel e vorticare prima di glassare.
Con la punta di una pipetta, rimuovere il PBS dalla camera e rimuovere il liquido residuo con un panno privo di lanugine. Aggiungere immediatamente 40 microlitri di soluzione gel sul cervello in ogni camera. Incubare le camere a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Ora rimuovi la soluzione di gel dalla camera. Quindi staccare la pellicola protettiva trasparente dall'adesivo della superficie della guarnizione. Aggiungere gli ultimi 45 microlitri di soluzione di gel fresco.
Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetto sulla camera e premere il vetrino coprioggetto per sigillare la camera prima di incubare a quattro gradi Celsius per altri 10 minuti. Incubare la camera a 37 gradi Celsius per 1,5 ore per polimerizzare il gel. Dopo aver raffreddato i gel su una panca, utilizzare una lama di rasoio per rimuovere con cura il vetrino coprioggetto e la guarnizione in silicone.
Tagliare il gel in una forma rettangolare e tagliare l'angolo in alto a destra per indicare l'orientamento del campione. Quindi, usa un pennello fine inumidito con una piccola quantità di tampone Pro K per sollevare con cautela i gel dal vetrino. Trasferire ogni gel singolarmente in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.
Mescola 500 microlitri di tampone Pro K e cinque microlitri di enzima proteinasi K e aggiungi la miscela a ciascun gel. Incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere il tampone con una pipetta flessibile fine e quindi lavare i gel tre volte in PBS per 10 minuti ciascuno.
Incubare i gel per 30 minuti in un millilitro di tampone DNASE1 a 37 gradi Celsius. Mescolare 50 microlitri di enzima DNASE1 con 450 microlitri di tampone DNASE1. Mescolare delicatamente senza vortici.
Incubare ogni gel in 500 microlitri di soluzione di DNASE1 per due ore a 37 gradi Celsius. Quindi, lavare i gel quattro volte per 15 minuti con un millilitro di PBS a temperatura ambiente. Ora, incubare i gel in 500 microlitri di tampone di ibridazione scongelato senza sonde per 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Diluire le sonde in tampone di ibridazione in rapporto da uno a 100, preparando 300 microlitri per gel. Incubare i gel con tampone di ibridazione contenente sonde per una notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare i gel prima nel tampone di lavaggio della sonda, poi nel PBS.
Per la reazione a catena di ibridazione, aggiungere 500 microlitri di tampone di amplificazione al gel e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Riscaldare le forcine fluorescenti a 95 gradi Celsius per 90 secondi in una macchina PCR e raffreddare la soluzione a 25 gradi Celsius per 30 minuti. Per ogni sonda, diluire le coppie di forcine corrispondenti in un rapporto da uno a 50 in un tampone di amplificazione, preparando 300 microlitri per gel.
Dopo aver agitato la miscela, aggiungere la miscela ai gel e incubare. Per montare il gel per l'imaging a foglio leggero, rivestire due volte la superficie di fissaggio del gel di un supporto per gel con un microlitro di polilisina, lasciandolo asciugare a 37 gradi Celsius tra una mano e l'altra. Quindi, posizionare il gel su un vetrino coprioggetti in modo che il taglio sia sul lato sinistro.
Utilizzando un pennello, trasferire il gel sulla superficie trattata con un solo movimento. I geni associati ai neurotrasmettitori e i geni dei neuropeptidi hanno mostrato modelli di espressione distinti nel cervello adulto di drosofila. VGluT e Gad1 sono stati co-rilevati nello stesso ciclo di ibridazione, mostrando pattern di espressione non sovrapposti.
L'AstA ha mostrato una forte espressione nel lobo ottico e un'espressione più debole nel complesso centrale. Crz era altamente espresso nella pars lateralis, mentre livelli di espressione più bassi sono stati osservati nei neuroni del lobo ottico. Tk è stato rilevato nei neuroni H delta D identificati con espressione di Mer-GFP utilizzando una specifica linea GAL4 divisa mediante microscopia a foglio ottico o confocale.
La FMRFamide era assente nei neuroni PFG marcati da Mer-GFP, ma rilevata nei neuroni circostanti. L'imaging ad alta risoluzione dei neuroni FB4K ha confermato la distribuzione spaziale dei trascritti VGluT e ChAT/VAChT. I neuropeptidi, come AstA e Crz, sono così altamente espressi in alcune cellule che i singoli punti fluorescenti che rappresentano singoli trascritti non possono più essere separati.
