Induzione di DTH adottivi Si prega di consultare l&#39;articolo jove: <a href="/index/Details.stp?ID=325">induzione e monitoraggio del adottivi ipersensibilità ritardata nei ratti</a> Christine Beeton, George K. Chandy Dipartimento di Fisiologia e Biofisica, University of California, Irvine Esperimenti J. visualizzati, Numero 8 Qui, abbiamo modificato questo protocollo usando antigene (ovoalbumina), coniugata con Texas-Red in un rapporto 1:1 con l&#39;antigene senza etichetta per consentire la visualizzazione di fagocitaria cellule presentanti l&#39;antigene. Orecchio tessuto Harvest <ol><li> Euthanize il ratto al momento desiderato-punto per le procedure descritte nel protocollo animali approvato. Qui, usiamo una dose eccessiva di anestetico, isoflurano. Questo viene fatto in un contenitore chiuso all&#39;interno di una cappa ben ventilata. Assicurarsi che l&#39;animale è morto da una decapitazione del aprendo la cavità toracica e tagliando il cuore. </li><li> Utilizzando le forbici grandi rimuovere l&#39;orecchio con un unico taglio, più vicino al corpo dell&#39;animale possibile (Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_0/Figure_1.jpg" alt="Figure_1.jpg" /> Figura 1. La rimozione dell&#39;orecchio ratto </li><li> Posizionare l&#39;orecchio in un tubo da 15 ml contenente circa 10 ml di ghiacciata 1x PBS o RPMI-1640. Mantenere i campioni di tessuto sul ghiaccio fino al momento di preparare il tessuto per l&#39;imaging. </li><li> L&#39;immagine del tessuto il più presto possibile, troviamo, però, che 1 o 2 ore sul ghiaccio non ha alcun effetto distinguibile sulla motilità delle cellule nei tessuti rispetto al tessuto raccolto e ripreso immediatamente. </li></ol> Preparazione dei tessuti per l&#39;imaging Rimozione I. strato epidermico e dermico * Nota: Lo strato dermico profondo deve essere mantenuta intatta. Se fatto correttamente grandi vasi sanguigni rimarrà intatto e la cartilagine dell&#39;orecchio non saranno esposti. Questa è una tecnica difficile, soprattutto quando non c&#39;è l&#39;infiammazione (condizioni di controllo) ed è utile usare un microscopio da dissezione. <ol><li> Luogo sia il tessuto e dei media dal tubo conico in un piatto di coltura di tessuti 10 cm. </li><li> Con le mani guantate tenere l&#39;orecchio ratto delicatamente sulla punta dell&#39;orecchio (distale) con la parte dorsale del l&#39;orecchio rivolto verso l&#39;alto (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_1/Figure_2.jpg" alt="Figure_2.jpg" /> Figura 2. Pelliccia tagliare l&#39;orecchio </li><li> Con il pollice sulla parte superiore dell&#39;orecchio, stabile il tessuto mentre si usa la punta di chiusura Dumont # 5 forbici per separare il derma dal derma profondo. In alternativa, se il bordo del padiglione auricolare ha una sporgenza della pelle / derma profondo, questo può essere afferrato con una pinza e delicatamente tirato a separare questo dal tessuto sottostante (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_2/Figure_3.jpg" alt="Figure_3.jpg" /> Figura 3. La rimozione del derma superiore </li><li> Una volta che una piccola zona di pelle è stata separata dal tessuto sottostante, ripetere la procedura di separazione in alternativa usare le forbici per tagliare tra gli strati del derma e pinze per rimuovere delicatamente e rimuovere la pelle sloggiato. </li><li> Esporre un 5 x 5 mm o maggiore superficie di tessuto orecchio che è di almeno 3 mm dal sito iniziale di iniezione antigene (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_3/Figure_4.jpg" alt="Figure_4.jpg" /> Figura 4. Tessuti esposti per l&#39;imaging </li></ol> II. Protezione del tessuto allo stage Imaging <ol><li> Tagliare un pezzo di plastica di copertura a una dimensione leggermente più grande rispetto al tessuto preparato. </li><li> Stendere uno strato sottile di 3M ™ Vetbond tessuto-safe colla tutta la diapositiva. </li><li> Afferrare l&#39;angolo del tessuto preparato (dove non sono suscettibili di immagine), rimuovere dai media, e tamponare la parte inferiore del tessuto su carta lenti o Kym pulire per rimuovere il supporto in eccesso. </li><li> Toccare il bordo del tessuto alla diapositiva colla coperto (le cure Vetbond immediatamente sul tessuto bagnato). Tratto delicatamente il tessuto piatto, con l&#39;estremità opposta è l&#39;ultimo a toccare la diapositiva (Figura 5) <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_4/Figure_5.jpg" alt="Figure_5.jpg" /> Figura 5. Monte dei tessuti per fodera </li><li> Curare l&#39;™ Vetbond invertendo il campione di tessuto / slide e immersione in un serbatoio di media in modo tale che il tessuto e far scorrere sono a faccia in giù e più o meno ad un angolo di 45 gradi. Tenendo premuto il tessuto a testa in giù in un angolo aiuta a prevenire la colla in eccesso da curare sulla superficie del tessuto esposto. Colla sulla superficie del tessuto blocca il laser (Figura 6). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_5/Figure_6.jpg" alt="Figure_6.jpg" /> Figura 6. Cure vetbond tessuto glue per immersione nei media Nota: 2-5 passaggi possono prendere un po &#39;di pratica per padroneggiare. Prova pratica con pezzi di tessuto scartati o più prima di provare per la prima volta. </li><li> Tamponare una piccola quantità di grasso al silicone sul fondo della diapositiva. </li><li> Mettere il vetrino nella camera di perfusione. Assicurarsi che il supporto perfusione è scorrevole, 37 ° C e ossigenata prima di aggiungere dei tessuti. Premere delicatamente sul bordo del vetrino fare un sigillo con il grasso al silicone tra il fondo della camera di perfusione e la polizza di copertura in plastica. </li></ol> III. Due-Photon Imaging <ol><li> Utilizzando campo chiaro luce trasmessa, messa a fuoco sulla parte superiore del tessuto. Spegnere tutte le luci. </li><li> Accendere il laser, PMT, come richiesto dal sistema multi-fotone microscopio. </li><li> Generazione di seconda armonica (SHG) in altamente ordinato proteine ​​fibrose (collagene e miosina) produce un segnale a metà della lunghezza d&#39;onda del laser di eccitazione. Noi usiamo eccitazione a 900 nm, portando a SHG a 450 nm che può essere visualizzato utilizzando il canale &quot;blu&quot; del microscopio. SHG generazione è un non-lineare (a due fotoni) di processo, e fornisce quindi un effetto ottico &quot;sezionare&quot; simile a quella di eccitazione a due fotoni di fluorescenza. L&#39;efficienza di picco di SHG si verifica quando le fibrille sono perpendicolari al laser, mentre le fibrille che corrono in parallelo non verrà visualizzato 1. </li><li> Individuare una buona zona di imaging con abbondanza di celle, impostare l&#39;area di tale acquisizione che la maggior parte delle cellule si trovano nel centro e iniziare imaging. Nota: Nelle reazioni DTH, le cellule T e cellule infiltrati altri si trovano spesso a concentrarsi insieme mentre altre zone sono prive di infiltrare cellule 2. Pertanto, si può richiedere un certo tempo a cercare i tessuti per trovare la zona migliore per immagine. </li><li> Verificare la presenza di vitalità cellulare, valutando la velocità e la polarità delle cellule durante l&#39;imaging. Utilizzare il minor potenza laser che offre una qualità dell&#39;immagine accettabile per garantire la minima foto-danni. </li><li> Swap in un preparato nuovo tessuto, se necessario. </li></ol>

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	<li>Koo, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+the+voltage-gated+potassium+channel+Kv1.3+inhibits+immune+responses+in+vivo.">Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo.</a> J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).</li><li>Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+activation+and+T+lymphocyte+infiltration+in+allergen-induced+late+phase+skin+reactions+and+classical+delayed-type+hypersensitivity.">Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity.</a> J Immunol. 147, 816-822 (1991).</li><li>Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoaggressive+effector+T+cells+in+the+course+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+visualized+in+the+light+of+two-photon+microscopy.">Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy.</a> J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).</li><li>Kawakami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+effector+cell+trafficking+and+autoantigen+recognition+within+the+unfolding+autoimmune+encephalomyelitis+lesion.">Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion.</a> J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Matheu, M. P. B., A, C. G. a. r. c. i. a., Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Imaging+of+Effector/Memory+T+Cells+During+DTH+and+Suppression+by+Kv1.3+Channel+Block.">In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block.</a> Immunity. , (2008).</li></ol>

imaging effector memory t cells in the ear after induction of adoptive dth

Ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) è una reazione immunitaria in cui i protagonisti sono CCR7 - effettrici / linfociti T memoria. Qui, dimostriamo un metodo per indurre il progresso e la registrazione di una reazione DTH nell&#39;orecchio ratto. Questa è seguita da una dimostrazione della preparazione di tessuto di ratto orecchio per l&#39;imaging a due fotoni del CCR7 - effettrici / risposta delle cellule T memoria. Un DTH adottiva è indotta dalla iniezione intraperitoneale di GFP-etichettata Ova-specifiche CCR7 - effettrici / memoria linea cellulare T (Beeton, C J. Esperimenti Visualized, numero 8). Le cellule sono poi lasciato equilibrare nel ratto per 48 ore prima sfida, iniettando un orecchio con soluzione salina (controllo orecchio) e l&#39;altro con una miscela 1:1 di coniugati Ova e Ova a Texas-Red (Ova-TR) per consentire la visualizzazione residente di cellule presentanti l&#39;antigene. Descriviamo un metodo di preparazione dei tessuti utili per l&#39;imaging la motilità delle cellule all&#39;interno dello strato dermico profondo durante una risposta immunitaria, in collaborazione con visualizzazione delle fibre di collagene da generazione di seconda armonica. Il tessuto viene tagliato l&#39;orecchio in 5 x 5 millimetri quadrati (leggermente più grande è meglio), montato su slitta copertura in plastica con Vetbond ™, che sono poi protetti con grasso al silicone in una camera di imaging e superfused da ossigeno-bolle terreni di coltura a 37 ° C .

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Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH

Qui mostriamo un metodo per indurre la registrazione e il progresso di una ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) reazione nell&#39;orecchio ratto. Questa è seguita da una dimostrazione della preparazione di tessuto di ratto orecchio per l&#39;imaging a due fotoni del effettrici / risposta delle cellule T memoria.

Imaging Effector cellule T di memoria nell&#39;orecchio dopo l&#39;induzione di DTH adottivi

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an immune reaction in which the main players are CCR7- effector / memory T lymphocytes. Here, we demonstrate a ...

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10.2K Views.  University of California, Irvine (UCI). Qui mostriamo un metodo per indurre la registrazione e il progresso di una ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) reazione nell'orecchio ratto. Questa è seguita da una dimostrazione della preparazione di tessuto di ratto orecchio per l'imaging a due fotoni del effettrici / risposta delle cellule T memoria.