입양 DTH의 유도 조브 문서를 참조하십시오 : <a href="/index/Details.stp?ID=325">고양이의 입양 지연 유형 과민성의 유도 및 모니터링</a> 크리스틴 비튼, 조지 K. Chandy 생리학 및 생물 물리학의학과 캘리포니아 대학, 어바인 J. 시각 실험, 제 8 여기, 우리는 phagocytic 항원 제시 세포의 시각화 수 있도록 레이블이 지정되지 않은 항원과 1:1 비율 항원 (Ovalbumin) 텍사스 - 레드에 복합을 사용하여이 프로토콜을 수정했습니다. 이어 조직 하베스트 <ol><li> 귀하의 승인된 동물 프로토콜에 명시된 절차에 의해 원하는 시간 지점에서 쥐를 안락사. 여기, 우리는 isoflurane 마취의 과용을 사용합니다. 이것은 통풍이 잘 후드 안에있는 닫힌 용기에 이루어집니다. 동물의 흉강을 열고 심장을 절단하여 중 잘린에 의해 죽었다는 보장합니다. </li><li> 큰 가위를 사용하면 가능한 한 동물의 몸에 가까운 싱글 컷 (그림 1)과 귀를 제거합니다. <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_0/Figure_1.jpg" alt="Figure_1.jpg" /> 그림 1. 쥐 (内耳)의 제거 </li><li> 얼음처럼 차가운 1X PBS 또는 RPMI - 1640의 ~ 10 ML을 포함한 15 ML 원뿔 관에 귀를를 놓습니다. 이 영상에 대한 조직을 준비하는 준비가 될 때까지 얼음 조직 샘플을 보관. </li><li> 최대한 빨리 이미지를 조직, 우리는 수확 즉시 군데 조직에 비해 얼음 1로 2 시간 조직에있는 세포 운동성에 뚜렷한 효과가 없다고하지만, 찾으십시오. </li></ol> 이미징을위한 조직 준비 표피와 피부 레이어의 I. 제거 * 참고 : 깊은 피부 레이어는 그대로 보관해야합니다. 제대로하면 큰 혈관은 그대로 유지되며 귀의 연골이 노출되지 않습니다. 더 염증 (관리 규정)이없는 특히 이것은 어려운 기술이며 그것은 해부 현미경을 사용하여 도움이됩니다. <ol><li> 10cm 조직 문화 요리에있는 원뿔 관의 조직과 언론 모두를 놓습니다. </li><li> 장갑 낀 손 (그림 2) 최대 직면하고있는 귀의 지느러미 측면과 귀 (말초)의 끝에 부드럽게 쥐의 귀를하라. <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_1/Figure_2.jpg" alt="Figure_2.jpg" /> 그림 2. 귀에에서 트림 모피 </li><li> 귀 상단, 깊은 진피에서 진피를 분리 폐쇄 더몬트 끝 # 5 가위를 사용하는 동안 지속적인 조직에 엄지손가락으로. 귀 가장자리 피부 / 깊은 진피의 오버행이있다면 또는, 이것은 집게로 파악 할 수 있으며 부드럽게 아래 조직 (그림 3)에서 이것을 분리 뽑아. <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_2/Figure_3.jpg" alt="Figure_3.jpg" /> 그림 3. 상단 진피의 제거 </li><li> 일단 피부의 작은 지역 또는 부드럽게 제거하고 피부 dislodged에서 껍질로 피부 레이어와 집게 사이자를 가위를 사용하여 분리 단계를 반복, 기본 조직에서 분리되었습니다. </li><li> 5 × 5 mm 또는 항원 주입의 초기 사이트 (그림 4)에서 최소 3mm는 귀 조직의 큰 영역을 쉽게받을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_3/Figure_4.jpg" alt="Figure_4.jpg" /> 그림 4. 이미지에 대한 노출 조직 </li></ol> II. 이미징 스테이지에 조직을 확보 <ol><li> 준비 조직보다 약간 큰 크기로 플라스틱 커버 슬립 컷. </li><li> 3M Vetbond 슬라이드에 걸쳐 ™ 조직 안전한 접착제의 얇은 레이어를 확산. </li><li> 준비된 조직 (이 이미지에 가능성이있는 곳으로 가는게)의 코너를 파악, 미디어에서 제거하고, 소량은 렌즈 종이나 Kym에있는 조직의 아래쪽 초과 미디어를 제거하는 닦으십시오. </li><li> 접착제 커버 슬라이드 (즉시 서부 유럽 표준시 조직에 Vetbond 치료)로 조직의 가장자리를 터치. 부드럽게 (그림 5) 슬라이드를 만진되는 반대 엔드와, 평면 조직을 스트레칭 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_4/Figure_5.jpg" alt="Figure_5.jpg" /> 그림 5. 쪽지를 커버하기 위해 조직을 마운트 </li><li> 로 반전 조직 샘플 / 슬라이드 및 조직 및 슬라이드가 45도 각도로 얼굴 아래로 약하는 등 미디어 저수지에서 수영. Vetbond ™ 치료 각도에 거꾸로 조직을 개최하면 노출된 조직 표면에 경화에서 초과 접착제를 방지하는 데 도움이됩니다. 조직의 표면에 접착제가 레이저 (그림 6)을 차단합니다. <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_5/Figure_6.jpg" alt="Figure_6.jpg" /> 그림 6. vetbond 조직 GLU 치료미디어 마른하여 전자 참고 : 단계 2-5은 마스터에 약간의 연습이 걸릴 수 있습니다. 처음 시도하기 전에 삭제 또는 추가 조직 조각과 연습을보십시오. </li><li> 슬라이드의 맨 아래에 실리콘 그리스의 DAB는 작은 금액입니다. </li><li> 재관류 챔버에서 슬라이드를 놓습니다. 재관류 미디어는 37 ° C를 흐르는하고 조직을 추가하기 전에 산소 있는지 확인합니다. 부드럽게 재관류 챔버의 바닥 및 플라스틱 커버 슬립 사이에 실리콘 그리스와 도장을 만들어 슬라이드의 가장자리 아래로 누르십시오. </li></ol> III. 두 광자 이미징 <ol><li> 밝은 - 현장 빛의 전송을 사용하여 조직의 꼭대기에 중점을두고 있습니다. 조명의 모든 전원을 끕니다. </li><li> 레이저를 켜고, 귀하의 다중 광자 현미경 시스템에 필요한 PMTs. </li><li> 높은 주문한 섬유 단백질의 두 번째 고조파 세대 (SHG) (콜라겐과 마이 오신)은 여기 레이저의 절반 파장에서 신호를 생산하고 있습니다. 우리는 현미경의 &quot;푸른&quot;채널을 사용하여 시각 수있는 450 nm의에서 SHG에 이르는, 900 nm의 여기에서를 사용합니다. 세대 SHG 것은 비선형 (2 광자) 과정이며, 따라서 형광의 2 광자 여기의 비슷한 광학 &quot;sectioning&quot;효과를 제공합니다. 병렬로 실행 원섬유이 시각되지 않습니다 반면 SHG의 절정 효율성은 원섬유는 레이저로 수직 때 발생 1. </li><li> 세포 가득한 좋은 이미지 영역을 찾아, 세포의 대부분 중앙에 있으며, 영상을 시작 귀하의 수집 영역을 설정합니다. 참고 : DTH 반응, T 세포와 다른 세포 infiltrates는 종종 다른 분야 세포 2 침투은없는하는 동안 함께 집중해야 볼 수 있습니다. 따라서 이미지에 가장 좋은 지역을 찾으려면 조직을 검색 시간이 좀 걸릴 수 있습니다. </li><li> 이미징 동안 셀 속도와 극성을 평가하여 세포 생존을위한 확인하십시오. 최소한 사진 손상을 보장하기 위해 허용되는 이미지 품질을 제공하는 낮은 레이저 파워를 사용하십시오. </li><li> 필요에 따라 새로운 조직 준비 스왑. </li></ol>

<ol>
	<li>Koo, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+the+voltage-gated+potassium+channel+Kv1.3+inhibits+immune+responses+in+vivo.">Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo.</a> J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).</li><li>Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+activation+and+T+lymphocyte+infiltration+in+allergen-induced+late+phase+skin+reactions+and+classical+delayed-type+hypersensitivity.">Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity.</a> J Immunol. 147, 816-822 (1991).</li><li>Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoaggressive+effector+T+cells+in+the+course+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+visualized+in+the+light+of+two-photon+microscopy.">Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy.</a> J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).</li><li>Kawakami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+effector+cell+trafficking+and+autoantigen+recognition+within+the+unfolding+autoimmune+encephalomyelitis+lesion.">Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion.</a> J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Matheu, M. P. B., A, C. G. a. r. c. i. a., Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Imaging+of+Effector/Memory+T+Cells+During+DTH+and+Suppression+by+Kv1.3+Channel+Block.">In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block.</a> Immunity. , (2008).</li></ol>

imaging effector memory t cells in the ear after induction of adoptive dth

효과기 / 메모리 T의 lymphocytes - 지연 유형 과민성 (DTH)은 주요 선수들이 CCR7하는 면역 반응이다. 여기, 우리는 쥐의 귀에 DTH 반응의 진행 상황을 유도하고 기록하는 방법을 보여줍니다. 효과기 / 메모리 T 세포 응답 - ​​이것은 CCR7의 2 광자 이미징을위한 쥐의 귀 조직의 준비 시범옵니다. 효과기 / 메모리 T 세포 라인 (비튼, C J. 시각 실험, 이슈 8) - 입양 DTH는 GFP - 레이블 OVA 특정 CCR7의 intraperitoneal 주사로 유도합니다. 전지는 다음 시각화를 허용하도록 텍사스 - 레드에 OVA와 OVA 복합의 1:1 혼합 (OVA - TR)과 호수 (제어 EAR)과 다른 하나의 귀를 주사하여 도전하기 전에 48 시간 동안 쥐의 평형을 사용할 수 있습니다 주민 항원 제시 세포. 우리는 영상 두번째 고조파 생성하여 콜라겐 섬유의 시각화와 함께 면역 반응 동안 피부 깊은 계층 내에서 세포의 운동성 유용 조직 준비 방법을 설명합니다. 귀 조직은 5 X 5mm의 사각형 (약간 큰 더이다)​​로 절단 후 37 이미징 챔버에 실리콘 그리스를 사용하여 보안과 산소 - 부풀어 오른 조직 문화 매체에 의해 superfused 아르 Vetbond ™를 사용하여 플라스틱 커버 미끄러져에 탑재되어 ° C .

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Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH

여기서 우리는 쥐의 귀에 지연 유형 과민성 (DTH) 반응의 진행 상황을 유도하고 기록하는 방법을 보여줍니다. 이것은 이펙터 / 메모리 T 세포 응답의 2 광자 이미징을위한 쥐의 귀 조직의 준비 시범옵니다.

입양 DTH의 유도 후 귀에 영상 효과기 메모리 T 세포

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an immune reaction in which the main players are CCR7- effector / memory T lymphocytes. Here, we demonstrate a ...

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10.2K 조회수.  University of California, Irvine (UCI). 여기서 우리는 쥐의 귀에 지연 유형 과민성 (DTH) 반응의 진행 상황을 유도하고 기록하는 방법을 보여줍니다. 이것은 이펙터 / 메모리 T 세포 응답의 2 광자 이미징을위한 쥐의 귀 조직의 준비 시범옵니다.