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Method Article
タンパク質の細胞内局在は、細胞シグナル伝達の時空間制御を決定する上で重要です。ここで、我々は、細胞内のタンパク質の空間的な相互作用を監視するための簡単な方法として、二分子蛍光相補(BiFC)を記述する。
シグナル伝達複合体の細胞内分布を定義すると、その複合体からの出力を理解する上で不可欠です。 このような免疫沈降などの従来の方法は、複合体の空間的局在に関する情報を提供していません。対照的に、BiFCはタンパク質複合体の相互作用と細胞内局在を監視します。この方法では、fluororescentタンパク質は、関心のある2つのタンパク質に融合されているアミノおよびカルボキシ末端に非蛍光フラグメントに分割されます。蛍光体の再構成におけるタンパク質の結果の相互作用(図1)1,2。 BiFCの制限は、断片化された蛍光体が再構成されると、複雑な3不可逆であるということです。この制限は、一時的または弱い相互作用を検出するのに有利であるが、複雑なダイナミクスの動態解析を排除する。追加の注意点は、再構成されたflourophoreが再びリアルタイムの相互作用4の観察を排除、成熟し、蛍光を発するために30分必要があるということです。タンパク質相互作用5,6:BiFCはそのような緑色蛍光タンパク質変異などのレポータータンパク質(BiFC)、ジヒドロ葉酸還元酵素、β-ラクタマーゼ、および蛋白質を測定するルシフェラーゼを採用した蛋白質フラグメントの相補アッセイ(PCA)の具体例です。蛋白質研究するために代替方法:細胞内のタンパク質の相互作用は、蛍光共局在し、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)7が含まれています。共局在のために、二つのタンパク質は、個別に直接蛍光体でまたは間接蛍光抗体のいずれかによってタグ付けされます。しかし、このアプローチは、それが困難な共局在のデータを解釈すること、非相互作用するタンパク質の高いバックグラウンドにつながります。さらに、共焦点顕微鏡の分解能の限界のため、2つのタンパク質は必ずしも相互に作用することなく、共局在表示されることがあります。興味のある2つのタンパク質が相互作用するときBiFCで、蛍光のみが観察される。タンパク質相互作用が、技術的に挑戦することができます:FRETはタンパク質を研究するための別の優れた方法です。 FRETの実験では、ドナーとアクセプターは、細胞内で同様の明るさと化学量論であることが必要です。さらに、一つはアクセプターチャネルとその逆にドナーの通過ブリードを考慮する必要があります。 FRETのとは異なり、BiFCは、画像データの少ないバックグラウンド蛍光、少し後処理を有し、高い過剰発現を必要とせず、弱または一時的な相互作用を検出することができます。生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)はドナーがそれによって刺激的なアクセプター発光になるために基質を触媒する酵素(例えばルシフェラーゼ)であることを除いてFRETを同様の方法です。 BRETは、スルーブリードの技術的な問題や高いバックグラウンドの蛍光を欠いていることもありましたが、特定のコンパートメント8〜基板の局在の欠如に空間的な情報を提供する能力を欠いている。全体的に、BiFCは区分シグナリングへの洞察を得るためにタンパク質複合体の細胞内局在を可視化するための優れた方法です。
A. BiFCキャリブレーション
セルのB.播種とトランスフェクション
イメージングのための細胞のC.の準備
D.イメージング細胞
蛍光を定量化するE.
F.代表の結果:
私たちの研究室では、複数の生化学的およびシグナル伝達経路10,11,12,13,14を規制する多くのタンパク質と相互作用する複数のドメイン足場タンパク質、intersectin(ITSN)に焦点を当てています。 ITSNは2つのEps15相同性(EH)ドメイン、コイルドコイル状の地域、および5つのSrcホモロジー3(SH3)ドメインが含まれています。 ITSNの長いアイソフォームもDBLホモロジー(DH)およびCdc42 15グアニンヌクレオチド交換因子としてコンサートのプレクストリン相同(PH)ドメインをその行為が含まれています。このモジュラー構造は、タンパク質促進:タンパク質間相互作用をしBiFC実験のための理想的な候補をITSNです。 ITSNの細胞内局在は、その結合パートナーを変えるため、ITSN(unpublisによって規制経路を変更することができますHEDデータ)。最近、私たちの研究室では、ITSNはPI3K -C2β11、小説クラスII PI3Kの調節を介してニューロンの生存を調節することが実証されています。 PI3K -C2βのアミノ末端プロリッチドメインは、ITSNのSH3ドメインの2つの結合部位が含まれています。 ITSNとPI3K -C2β切断型変異体との共免疫沈降法を用いて、我々は、ITSNのSH3AとSH3Cドメインは、PI3K -C2βのアミノ末端領域と相互作用することを示した。次に、我々はこの複合体の細胞内局在を可視化するBiFC使用。 ITSNは金星(PHA - VC155)のカルボキシ末端に融合金星(pFLAG - VN173)とPI3K -C2β構造のアミノ末端に融合されました。別のネガティブコントロールとして、非特異的なペプチドは、PHA - VC155に融合した。 VN - ITSNとVC - PI3K -C2βは、句読点の分布(図2A、上部のパネル)でBiFC複合体を形成。 ITSNとPI3K -C2βの共沈を混乱させるPI3K -C2βのプロが豊富なドメインの変異はBiFC信号(図2A、下のパネル)11に減少。 ITSN二PI3K -C2βタンパク質間のBiFC信号の差は、蛋白質の発現の違い(図2B)によるものではなかった。
図1 BiFCでは、蛍光体(この場合は金星は)(VN)アミノ酸に分割されます-とカルボキシ(VC)端子が終了。これらの目的は、関心のある2つのタンパク質に融合されています。 2つのタンパク質が相互作用する場合、VNとVCの断片が再アソシエートの相互作用部位と蛍光団と蛍光の再構成をもたらす。タンパク質相互作用5:BiFCは蛋白質を測定するために使用される蛋白質の断片の相補アッセイ(PCA)の具体例です。
図2。ITSNとPI3K -C2βフォームBiFC複雑。 A. VN -タグ付きITSNは、VC -タグ付きPI3K -C3βWTまたはプロリンリッチドメイン変異体(PI3K -C2β- PA)と共同tranfectedした。 ITSNとWT PI3K -C2βフォーム複合体(緑)。 CFP(赤)ウエスタンブロット法は構造の等しい発現を実証するために実行されたトランスフェクションコントロールB.として使用されていました。 VC -タグ付きのコンストラクトは、HAタグ付けされています。
表1。BiFCと互換性のある複数のベクトルがあります。 YN155:YFPの1 - 155aa、YC155:YFPの155 - 238aa、YN173:YFPの1 - 172aa、YFPのYC173、173 - 238aa、VN155:金星の1 - 154aa、VC155:金星の155から238、VN173:金星の1 - 172aa、VC173:金星の173 - 238aa、CN155 CFPの1 - 154aa、CC155 CFPの155 - 238aa、GN173:GFPの1 - 172aa、CitN155:シトリンの1 - 155aa、CitC155:155 - 238aaシトリン、CitN173:シトリン、CitC173の1 - 172aa:シトリン、CerN173の173 - 238aa:セルリアン2,3,9の1 - 172aa。
細胞全体のタンパク質の相互作用およびこれらの複合体の細胞内局在を決定する:BiFCは、タンパク質を可視化するための優れた方法です。 BiFCの利点は唯一相互作用するタンパク質は、蛍光、過渡的な相互作用が安定しているか、および画像データの後処理が最小である。ということですこのメソッドの2つの欠点は、蛍光団と蛍光団複合体の不可逆性のための成熟の時間です。一部のアプリ...
ITSN、このプロトコルで使用されるPI3K -C2β、およびコントロールベクターは、非商用目的のみのため、ご要望に応じて、著者から入手できます。著者は、親切にアドバイスとオブライアンの実験室でBiFCプロトコルの確立に使用される試薬を提供するために博士はチャントウ胡を認識したい。カーは、財団ジェロームルジューンからの資金によってサポートされていました。オブライアンの実験室での作業は、NIH(HL090651)、DOD(PR080428)、聖剣帯の財団、及び財団ジェロームルジューンからの補助金によってサポートされています。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | Cellgro | 10-013 | |
Fetal bovine serum | Cellgro | 35-011-CV | |
Glass Bottom Microwell dishes | Matek | P35G-1.5-14C | |
6-well dishes | Falcon BD | 35-3846 | |
Lipofectamine | Invitrogen | 18324020 | |
PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 META |
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