Bimolecular 형광 Complementation

요약

단백질의 subcellular 지방화는 세포 신호의 spatio - 시간적 규정을 결정 중요합니다. 여기, 우리는 세포에있는 단백질의 공간적 상호 작용을 모니터링을위한 간단한 방법으로 bimolecular 형광 complementation (BiFC)를 설명합니다.

초록

신호 단지의 subcellular 배포를 정의하면 해당 복잡한에서 출력을 이해하는 데 필수적입니다. 같은 immunoprecipitation과 같은 기존의 방법은 단지의 공간적 지방화에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 반대로, BiFC는 상호 작용과 단백질 단지의 subcellular compartmentalization을 모니터링합니다. 이 방법에서는 fluororescent 단백질 그 다음으로 흥미가있는 두 개의 단백질에 융합 아르 아미노 및 카르복시 - 터미널이 아닌 형광등 조각으로 분할합니다. 형광단의 reconstitution (그림 1) ^1,2에있는 단백질 결과의 상호 작용. BiFC의 제한은 조각난 형광단가 재구성되면 복잡한 ³ 되돌릴 수있다는 것입니다. 이러한 제한은 일시적인 또는 약한 상호 작용을 검출에 유리하지만, 복잡한 역학의 운동 분석하는 걸로. 추가 주의해야 할 점은 재구성 flourophore 다시 실시간으로 상호 작용 ^4의 관찰을 precluding, 성숙하고 형광을 30 분 필요합니다. 단백질 상호 작용 ^5,6 : BiFC는 녹색 형광 단백질 변형으로 기자 단백질 (BiFC), dihydrofolate 환원 효소, B - lactamase, 그리고 단백질을 측정 루시페라제 고용 단백질 조각의 complementation 분석 (PCA)의 구체적인 예입니다. 단백질 연구에 다른 방법 : 세포의 단백질 상호 작용 형광 공동 현지화 및 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) ^7을 포함합니다. 공동 지방화를위한 두 개의 단백질이 개별적으로 직접 형광단 또는 간접 immunofluorescence을 통해 태그가 있습니다. 그러나,이 방법은 어려운 공동 현지화 데이터를 해석할 수 있도록 아닌 상호 작용하는 단백질의 높은 배경에 이르게한다. 또한, 공촛점 현미경의 해상도의 한계로 인해 두 단백질은 반드시 상호 작용없이 공동화된 나타날 수 있습니다. 관심의 두 단백질이 상호 작용하면 BiFC으로 형광은 관찰됩니다. 안달은 단백질 연구를위한 또 다른 우수한 방법이다 : 단백질 상호 작용을하지만, 기술적으로 도전하실 수 있습니다. 안달 실험은 기증자와 수용체가 세포에서 유사한 밝기와 stoichiometry 것으로합니다. 또한, 하나는 수용체의 채널과 반대로 기증자의를 통해 출혈을 차지합니다. 걱정과는 달리, BiFC는 이미지 데이터의 작은 배경 형광, 작은 후처리가 높은 overexpression을 필요로하지 않으며, 약하거나 과도 상호 작용을 감지할 수 있습니다. Bioluminescence의 공명 에너지 전달 (브렛)은 기증자가이를 흥미로운 수용체 발광 생물이 될 수있는 기판을 catalyzes 효소 (예 : 루시페라제)입니다 제외하고 걱정 비슷한 방법입니다. 브레트 통해 출혈의 기술적인 문제와 높은 배경 형광이 부족하지만, 인해 특정 구획 ⁸ 기판 지방화의 부족으로 공간 정보를 제공하는 능력이 부족. 전체 BiFC는들에게만 신호에 대한 통찰력을 얻기 위해 단백질 단지의 subcellular 지방화를 시각화를위한 훌륭한 방법입니다.

프로토콜

A. BiFC 보정

1. 형광단을 선택합니다. BiFC 퓨전 파트너 (표 1)으로 잘 작동 등 YFP과 금성 등 여러 fluorophores가있다. 비너스의 아미노 및 카르복시 - 터미널 엔드 YFP BiFC 조각이 형광단 형성 ² 촉진하기 위해 30 ° C에서 미리 배양을 요구하면서, 37 ° C에서 복잡한를 형성 할 수 있습니다. 낮은 온도에서이 부화 일부 세포 프로세스를 변경할 수 있으며, 조각을 선택할 때 고려되어야합니다. 단백질의 카르복시 - 말단에 융합 비너스의 벡터 Addgene (에서 구할 수 있습니다 http://www.addgene.org/pgvec1 컨트롤로 사용하기 위해 추가 구성 예와 함께, seepBiFC - VN173 및 pBiFC - VC155) pBiFC - bJunVN173 그리고 pBiFC - bFosVC155 ^2. 아미노 터미널 비너스 벡터 (pFLAG - VN173 및 PHA - VC155) 등 추가 벡터는 다음 사이트에서 구할 수 있습니다 http://people.pnhs.purdue.edu/ ~ hu1 / .
2. 관심의 단백질에 태그를 추가하십시오. BiFC 조각이 후보 단백질의 아미노 또는 카르복시 - 터미널을 종료하기 위해 융합하고 있습니다. 어떤 단백질은 단백질 기능의 장애로 인해 양쪽 끝에 태그를 허용하지 않을 수 있습니다. 예를 들어, GTPases의 라스의 superfamily의 많은 회원들은 그 끝에 BiFC 조각의 카르복시 - 말단 따라서 precluding 첨부 파일에서 수정 지질 있습니다. 따라서 BiFC 조각의 첨부 파일이 관심의 단백질의 기능에 영향을 미칠 수있는 방법에 대한 몇 가지 아이디어를 가지고하는 것이 중요합니다. 그것이 단백질이 어떤 영향을 미치는지 명확하지 않은 경우 태그의 기능은 여러 가지 조합을 테스트해야합니다. BiFC 조각 이외에, 펩티드 링커는 조각 형광단 및 후보 단백질 사이의 유연성을 높이기 위해 포함될 수 있습니다. BiFC 벡터에 여러 복제 사이트 (MCS)은 충분한 유연성, RSIAT, KQKVMNH 및 RPACKIPNDLKQKVMNH linkers를 제공할 수 있습니다 짧은 아미노산 펼쳐진를 인코딩하는 동안 성공적으로 BiFC 실험 ^3,9에 사용되었습니다
3. transfection 조건을 확인합니다. 여러 돌연변이를 테스트하기 전에, 몇 가지 제어 실험을 수행하여야한다. 시도해야합니다 처음 두 BiFC 조합은 상호 작용하는 것으로 알려진 한 야생 유형과 상호 작용하지 돌연변이 두 야생 유형 단백질입니다. 이 두 조합을 이용하여 DNA와 transfection 시간의 다른 금액은 후보 단백질에 대한 BiFC 신호를 검출 최적의 조건을 결정하기 위해 테스트해야합니다. 우리는 6 자 요리 잘 한 각 BiFC 구조의 0.25ug, 0.5ug, 1.0ug을 테스트하는 것이 좋습니다. 신호 개발을위한 최적의 시간을 결정하기 위해 형광 현미경에 의해 transfection 모니터 세포 다음날. pBiFC - bJunVN173 및 pBiFC - ^bFosVC155이 구조는 BiFC 유용 긍정적인 제어하고 Addgene (위 참조)에서 사용할 수 있습니다. 또한, 서양 얼룩 분석은 구성의 동일한 표현을 확인하기 위해 수행되어야합니다. 조건은 형광 신호가 두 야생 유형 단백질 있지만 신호에 약간의 사이에서 관찰되는 등이 야생 타입과 돌연변이 단백질 사이의 관찰 선정해야합니다. 마지막으로,이 이외의 특정 상호 작용을 방지하기 위해 가능한 한 낮은 단백질 발현을 유지하는 것이 좋습니다.
4. BiFC 조각의 추가 관심의 단백질의 지방화을 바꿀지도 모르겠어 있는지 확인합니다. 각 BiFC 구조 역시 HA 또는 깃발 에피토프 태그를 포함하고 있습니다. Immunostain는 HA 또는 깃발 에피토프 태그뿐만 아니라 B​​iFC 태그가 관심의 단백질의 지방화에 영향을 미치는 경우에는 확인하기 위해 잘 내생 단백질 (가능한 경우) 모두에 대한 세포를 transefected.

세포의 B. 도금 및 Transfection

1. COS 세포는 (1.3x10 ⁵⁾ 1 유리 바닥 Matek 플레이트 및 샘플 당 6 잘 판의 두 우물로 각각 도금하고 있습니다. 세포가 하루 37 ° C. 해결하도록 허용 관심의 후보 단백질에 더 관련된 다른 세포 유형도 사용할 수 있습니다.
2. transfection에 대한 DNAs를 준비합니다. 우리는 일반적으로 COS의 transfections에 대한 Lipofectamine (Invitrogen)을 사용합니다. 그러나, 다른 시약 관심의 세포 라인에 대한 더 적절한 수 있습니다. transfection 혼합물 하나의 유리 바닥 요리와 6 자 판의 두 우물 사이에서 분할되기 때문에,이 부문에 대한 계정으로 DNA의 적절한 금액을 사용합니다. 혈청 무료 (SF) DMEM의 250uL에서 DNA를 희석. transfection 제어 등 총 BiFC DNAs의 1 / 5 금액 CFP를 추가합니다. BiFC 부량 들어, CFP 양성에만 세포가 BiFC 신호의 존재에 대해 분석합니다. 따라서 다른 transfection 제어, CFP 스펙트럼은 표 1에 BiFC 쌍 일부 중복됩니다아마 필요했습니다. 250uL SF DMEM (DNA의 10uL Lipofectamine/1ug)에 Lipofectamine을 희석. DNA와 Lipofectamine의 dilutions를 섞습니다. 20 분 대한 상온에서 알을 품다.
   참고 : Lipofectamine : DNA의 비율이 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다. 관심의 세포 라인에 해당하는 transfection 방법을 사용합니다.
3. 따뜻한 SF DMEM과 2X 세포 린스. 6 잘 요리 잘 각 유리 바닥 플레이트 또는 SF DMEM의 2mL를 추가합니다.
4. 유리잔 하나 바닥 요리와 6 자 요리의 두 우물 사이에 균등하게 각 transfection 혼합물을 분리.
5. 5hrs에 대해 37 ° C에서 세포를 품어.
6. transfection 미디어를 제거하고 (DMEM 10% FBS) 전체 미디어 바꿉니다.
7. 37 밤새 품어 세포 ° C. 인큐베이션 다음의 transfection의 길이는 관심의 단백질의 표현 수준에 따라 달라집니다. 이 단계는 경험적으로 결정되어야합니다 때문에 장시간 배양이 아닌 구체적인 상호 작용이 발생할 수 있습니다.

이미징을위한 세포의 C. 준비

1. 세포는 처음에는 긍정적인 컨트롤이 형광 있는지 확인하는 epifluorescent 현미경 검사입니다. 그렇지 않다면 그것은 신호가 관찰됩니다 ° C까지 37 셀을 추가 시간을 허용해야 할 수 있습니다.
2. PBS (산도 7.4)로 3 배 세포 린스. 유리 바닥 접시에있는 세포 2 % paraformaldehyde (산도 7.4)을 추가합니다. 얼음 10 분에 대한 세포를 수정. PBS (산도 7.4)로 3 배 세포 린스. 4 스토어 세포 ° C 1mL PBS (산도 7.4)가 있었다. 세포 이미징에 대한 고정해야 없지만, 일단 BiFC 조각은 역동적인 상호 작용 ³ 돌이킬 수 때문에 예방 분석하는 손상 형광단 개혁. 또한 떼어낸 세포가 신호를 개발하기 위해 지속 것을 명심하십시오. 6 잘 접시에있는 세포를 Lyse과 서양 얼룩 분석을위한 lysates을 준비합니다. lysed 세포가 몇 군데 세포의 대표 수 있도록 모든 세포가 동시에 준비하는 것이 중요합니다.

D. 이미징 세포

1. 형광 강도는 세포마다 계산됩니다. 이미지 각각의 세포를해야합니다.
2. CFP는 tranfection 컨트롤로 포함되었습니다에만 CFP 양성 세포 BiFC 신호의 분석을 위해 선택됩니다. 우리는 세포가 CFP와 transfected있다면, 그것은 또한 BiFC 구조와 transfected 있다고 가정합니다. 이러한 접근 방식은 BiFC 신호를 부족 군데 세포가 관심의 단백질이 아닌 하나의 부재로 인해 또는 셀에 두 BiFC 표현 구조 사이의 상호 작용의 부족으로 인해 부정적인 것을 보장합니다.
3. 우리는 세포 이미징을위한 자이스 혈구 LSM 510 공촛점 현미경을 사용합니다. 이 현미경을 사용하는 경우 그것은 줌, 핀홀, 검출기 이득, 증폭기 오프셋, 프레임 크기, 스캔 속도, 스캔 평균, 그리고 레이저의 파워 일관성을 유지하는 것이 중요합니다. 모든 이미징 시스템을 사용하는 경우 그것은 형광이 샘플 사이에 비교할 수 있도록 설정을 지속적으로 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 형광을 quantifying 때 픽셀이 포화되지 않은 것이 중요합니다.

E.가 형광을 Quantifying

1. 형광은 어떤 이미징 소프트웨어를 사용하여 계량 수 있습니다. 우리는 NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/)에서 다운 받으시면됩니다 ImageJ을 활용한다. ImageJ에있는 이미지 파일을 엽니다. AnalyzeSet​​ 측정로 이동합니다. 지역에 대한 확인란을 선택하고 측정 상자에 회색 가치를 의미합니다.
2. '자유 재량의 선택'도구를 사용하여 CFP 채널의 전체 세포의 가장자리 주위에 테두리를 그립니다.
3. 장소에이 윤곽을 떠나, YFP 채널 이동. AnalyzeMeasure로 이동합니다.
   평균 회색 값 픽셀의 숫자 (즉, 세포의 지역 당 평균 형광 강도)로 나누어 선택의 모든 픽셀의 회색 값의 합계입니다.
4. 각 이미지에 대한 세포를 포함하지 않는 영역에서 YFP 채널에 원을 그립니다. 배경으로이 지역에 대한 측정을 가져가라. 각각의 이미지에서 배경을 뺍니다.
5. 한 샘플에서 몇 군데의 모든 세포에 대한 평균 값을 뺀 회색 배경에 평균. 이것은 세포의 인구의 평균 형광 강도 것입니다. 우리는 세 실험을 통해 약 60 세포 계량 될 제안합니다.

F. 대표 검색 결과 :

우리 연구실은 다중 도메인 비계 단백질, 여러 생화학 및 신호 경로에게 ^{10,11,12,13,14을} 규제하기 위해 수많은 단백질과 상호 작용 intersectin (ITSN)에 초점을 맞추고 있습니다. ITSN 두 Eps15 상동 (EH) 도메인, 코일 - 코일 지역 다섯 SRC의 상동 3 (SH3) 도메인이 포함되어 있습니다. ITSN의 이상 이소형도 Dbl 상동 (DH)와 Cdc42 ¹⁵ 구아닌 염기 교환 요소로 콘서트에서 pleckstrin의 상동 (PH) 도메인되는 행위가 포함되어 있습니다. 이것은 모듈식 구조는 단백질의 증진 : 단백질 상호 작용과 BiFC 실험을위한 이상적인 후보자를 ITSN 수 있습니다. ITSN의 subcellular 지방화는 바인딩 파트너를 변경하므로 ITSN (unpublis 규제 경로를 변경할 수 있습니다쓰인 데이터). 최근 우리 연구소는 ITSN이 소설 클래스 II PI3K, PI3K - C2β ¹¹ 규제를 통해 생존의 연결을 조절 것을 보여주었다. PI3K - C2β의 아미노 터미널 프로 풍부한 도메인 ITSN의 SH3 도메인을위한 두 바인딩 사이트를 포함하고 있습니다. ITSN와 PI3K - C2β 절단 돌연변이와 함께 공동 immunoprecipitation를 사용하여 우리는 ITSN의 SH3A과 SH3C 도메인은 PI3K - C2β의 아미노 터미널 지역과 상호 작용하는 것을 보여주었다. 다음, 우리는이 단지의 subcellular 지방화를 시각화하는 BiFC를 사용합니다. ITSN는 비너스 (PHA - VC155)의 카르복시 - 말단에 융합 비너스 (pFLAG - VN173)와 PI3K - C2β 구조의 아미노 말단에 융합되었다. 또 다른 대조군으로가 아닌 특정 펩타이드는 PHA - VC155에 융합되었다. VN - ITSN 및 VC - PI3K - C2β은 구두점 분포 (그림 2A, 상단 패널)와 BiFC 복잡한을 형성. ITSN와 PI3K - C2β의 공동 침전을 방해 PI3K - C2β의 프로 풍부한 도메인에 변이가 BiFC 신호 (그림 2A, 낮은 패널) ¹¹ 감소. ITSN 두 개의 PI3K - C2β 단백질 사이 BiFC 신호의 이러한 차이는 단백질의 표현의 차이 (그림 2B)에 의한되지 않았습니다.

. 그림 1 BiFC에서는 형광단가 (이 경우에는 비너스) (VN) 아미노산으로 분할합니다 - 카르복시 (VC) - 단자 끝납니다. 이 끝을은 흥미가있는 두 개의 단백질을 융합하고 있습니다. 두 단백질이 상호 작용하면, VN 및 VC 조각을 다시 연결 상호 작용의 사이트에 형광단 및 형광의 reconstitution의 결과. 단백질 상호 작용 ⁵ BiFC 단백질을 측정하는 데 사용되는 단백질 조각의 complementation 분석 (PCA)의 구체적인 예입니다.

그림 2. ITSN와 PI3K - C2β 양식 BiFC 복잡. A. VN - 태그 ITSN은 VC - 태그 PI3K - C3β WT 또는 프롤린 부유한 도메인과 공동 tranfected되었다 돌연변이 (PI3K - C2β - PA). ITSN 및 WT PI3K - C2β 양식 복잡한 (녹색). CFP (적색)은 서양 얼룩이 구성의 동일한 표현을 증명하기 위해 수행되었다 transfection 제어 B.으로 사용되었다. VC - 태그 구성은 HA가 추가됩니다.

표 1. BiFC와 호환되는 여러 벡터가 있습니다. YN155 : YFP 1 - 155aa, YC155 : YFP의 155 - 238aa; YN173 : YFP 1 - 172aa, YFP의 YC173, 173 - 238aa, VN155 : 금성의 1 154aa, VC155 : 금성의 155-238, VN173 : 비너스의 1 172aa, VC173 : 금성의 173 - 238aa, CN155 CFP의 1 154aa, CC155 CFP의 155 - 238aa, GN173 : GFP 중 1 172aa, CitN155 : 시트린 1 - 155aa, CitC155 : 중 155 - 238aa 시트린, CitN173 : 시트린 1 - 172aa, CitC173 : 시트린의 173 - 238aa, CerN173 : 세룰리안 ^2,3,9 1 - 172aa.

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토론

전체 세포의 단백질 상호 작용과 이들 단지의 subcellular 지방화를 결정 : BiFC 단백질을 시각화를위한 훌륭한 방법입니다. BiFC의 장점은 상호 작용하는 단백질이 형광 것을 있으며, 과도 상호 작용을 안정화하고, 영상 데이터의 후처리가 최소집니다. 이 방법의 두 가지 단점은 형광단 및 형광단 복합의 비가 역성에 대한 성숙 시간입니다. 일부 응용 프로그램에서이 비가 역성은 장점으로 사용할 수 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Cellgro	10-013
Fetal bovine serum	Cellgro	35-011-CV
Glass Bottom Microwell dishes	Matek	P35G-1.5-14C
6-well dishes	Falcon BD	35-3846
Lipofectamine	Invitrogen	18324020
PBS	Cellgro	21-031-CV
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Confocal Microscope	Carl Zeiss, Inc.	LSM510 META