マウスで誘導機械的異痛症の倹約神経損傷（SNI）モデル

要約

免れる神経損傷の動物モデルは、残りの腓腹神経はそのままに、脛骨と総腓骨神経の枝をlesioningによって坐骨神経の部分的除神経以下の末梢神経因性疼痛のマウスモデルとしてここで説明されています。機械的異痛症に起因する行動修正は、von Freyのフィラメントによって定量化される。

要約

末梢神経因性疼痛は外傷から末梢神経系の感覚神経につながる可能性重度慢性疼痛治療​​の条件です。免れる神経損傷（SNI）モデルが原因で、通常痛みを伴う応答を誘発しない触覚刺激するような機械的異痛症すなわち痛などの神経因性疼痛の症状を誘導する[1]。

腓腹神経はそのまま残っている間、SNIのマウスモデルは、坐骨神経（脛骨神経と総腓骨神経）の三権の二つのライゲーションを含む[2]。脇に置いて腓腹神経によって支配されている足の外側の領域で著しい過敏症の病変の結果。マウスの非手術側を対照として使用することができます。 SNIモデルの利点は、応答の頑健性であり、それが専門家顕微スキルを必要としないこと。

機械的な疼痛反応のしきい値が繰り返し足の外側の領域に押圧されているの増加曲げ力のフォンフレイフィラメント、でテストすることによって決定される[3]、[4]。肯定的な痛みの反応は、フィラメントによって誘発されるなめると/または足を尻込み、突然の足の撤退として定義されています。 5人に3つの反復刺激の肯定応答は、疼痛閾値として定義されています。

ビデオのプロトコルで示すように、C57BL / 6マウスは、手術の翌日には早くも深遠な異痛症を経験し、数週間のためにこれを維持する。

プロトコル

1。手術前にフォンフレイのベースライン測定

フォンフレイテストの手順については、セクション5を参照してください。

2。麻酔/準備

1. 動物（ケタミンおよび15 mg / kgのキシラジンを100mg/kgの混合物の腹腔内注射）を麻酔。
2. （例えば、紙タオルで覆われて）完全に麻酔まで、静かな場所で動物を置きます。
3. ピンセットで尾の先端と足をつまんで反射神経をチェックしてください。動物が進む前に応答しないことを確認してください。
4. 皮下抗生物質、例えば、アンピシリン（脱水を避けるために、これは簡単な外科的処置であるが、感染を防ぐために）と（バック肩の部分）0.5ミリリットル等張食塩水を注入する。
5. 電気シェーバーを使用して、（右利きの人のために左後肢を推奨）をわずかに膝エリ​​アの下からヒップのエリアへの術野を削る。
6. 綿棒で目に眼軟膏を適用します。
7. その右側に動物を配置し、それが上昇を維持するために小さなプラットフォーム上で左後肢を置きます。粘着テープで足を固定します。
8. 手術部位の外からエタノールとbetadineのスクラブを交互に術野を消毒する。

3。手術

1. 左手の親指で膝の位置を確認し、アプリを作るためにメスを使用してください。膝への近位長手方向に1cmの切開。
2. 滅菌はさみの先端を使用して鈍的切開で皮膚を開きます。
3. 右はっきりと目に見える血管の隣の鈍的切開により筋層を分離、大腿骨（大腿骨）に近い。正しく行えば、筋肉の層は簡単に右の筋肉の下に坐骨神経を明らかに、あらゆる出血することなく分離されます。
   出血が近くに膝に血管への損傷によって、例えば発生した場合は、血液を吸収するために滅菌綿、ウールの芽や視線の部分を使用。出血が止まるまで押します。
4. 実体顕微鏡下でマウスを置き、慎重に坐骨神経を可視化するために滅菌ピンセット（nr. 2）のペアで筋肉を区切ります。リトラクターを適用することもできる。
5. 坐骨神経からの腓腹神経の枝領域を識別します。腓腹神経は左足で右に分岐、三権の中で最小です。
6. 腓腹枝に触れないように非常に注意しながら、依然として並列で実行されている他の二つの枝の周り縫合糸を（6-0縫合糸）（脛骨と総腓骨神経）を適用します。腓腹神経は完全にそのままにする必要があるので、これは重要なステップです。
7. タイトな外科的結び目を作る。第一結び目がタイトである場合は、四肢の収縮が観察されます。
8. ピンセット（nr. 5） 縫合糸でカットする神経を持ってきて、はさみの小さなペアでピンセットの上下に神経を切る。ピンセット上記の最初のカットによって、神経の引き上げが避けられます。
9. マイクロハサミで縫合の端をカットオフし、静かに筋層を閉じます。外科ノットで傷や縫合にリドカインのドロップを追加。

4。手術後の

1. 眼軟膏はまだ十分であるかどうか確認して下さい。
2. 快適な姿勢でペーパータオルできれいなケージでマウスを置きます。部屋が冷えている場合、（のみ好ましい場合寒い地域に脱出することができるはずの動物のようなケージの一部の下で）ケージの一部の下に熱パッドを配置。
3. 簡単にアクセス可能な水と餌を確認してください。

5。フォンフレイテスト（ベースライン、および手術後の日から）

1. ワイヤーメッシュのテーブルに置かれた赤い色のプラスチック製のシリンダーが2日間、手術の前日にマウスを置きます。テスト前シリンダーで15分間慣らす。シリンダーの赤い色は、彼らがお互いを参照して暗い領域にあることができないようにマウスはすぐにリラックスするのに役立ちます。
2. マウスが穏やかであることを確認して、足の外側部分にフォンフレイのフィラメントを適用する：0.02 gのフィラメントで起動すると、最初の30秒間（刺激あたり約2秒）の合計期間左足に5回の力を適用し、各アプリケーションの後にマウスの反応を測る。同じフィラメントと、他のマウスの左前足を繰り返してから、次のフィラメントなどに移る前に、最初にマウスの右前足をもう一度初めからやり直します。
   
   • マウス1：左足フィラメント0.02グラムで5回
   • マウス2：左足フィラメント0.02グラムなどで5回
   • マウス1：右足フィラメント0.02グラムで5回
   • マウス2：右足フィラメント0.02グラムなどで5回
   • マウス1：左足フィラメント0.04グラムで5回
   • マウス2：左足フィラメント0.04グラムなどで5回
3. five刺激のうち3つの応答は、正反応とみなされます。 threshol上記フィラメントdは、しきい値レベルを確認するために適用することができます。
   応答=突然の足の撤退、舐める突然尻込み、突然の足。

6。代表的な結果

80〜10週齢C57BL / 6マウスの年齢の図1。フォンフレイテストは、操作を繰り返し、次の手術前に1日を実施した。 4月8日の動物は、各グループに含まれていた。運営側のフォンフレイテストは、対で表される同側と非駆動制御側で表されます。非操作しながら動物が作動足に重大な過敏症を開発する手術の翌日にはほんのわずかに偽手術したマウスからの相対影響を受けます。 （* <0.05、** <0.01、*** <0.001、対側同側の相対的な）。

ディスカッション

重要なステップ

腓腹神経の損傷は、脛骨と総腓骨神経の損傷後そのまま腓腹神経の病理学的変化を研究するために避けるべきである。腓腹神経への巻き添え被害が麻痺につながる可能性がありますので、操作後肢のドラッグとして可視化することができる。

足の唯一の側面は脇に置いて腓腹神経で神経支配と、それゆえ、唯一のこの領域は、神経障害を開発しています。 transected神経によって支配さ、他の領域のテスト、バイアス変更された機械的なしきい値の評価を強くできる。

実行可​​能な変更

ライゲーションの他のタイプは、そのような慢性的収縮損傷などの末梢神経損傷後の病理学的な痛みの条件を研究するという点で補足、[5]または部分的な神経結紮[6]があります。前術後の試験に考慮すべき明確な表現型の変化の各実験操作の結果。

この表現型は少ない堅牢な以下のSNIですがさらに、そのような熱痛覚過敏のような他の感覚テストは、[7]を適用してもよい。

将来のアプリケーション

この技術は、機械的異痛症の開発や保守を変える薬物のテストに使用することができる[8]。坐骨神経の分析、後根神経節（DRG）および/または腰部脊髄は、誘導表現型の原因分子メカニズムの研究を可能にする。

動物実験は、デンマークとヨーロッパの規制に完全に準拠優良試験所の状況にしたがって実施した。全ての実験は、法務省（許可番号2006/561-1206）でデンマークの動物実験検査官によって承認された。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
麻酔：ケタミンとキシラジン	外科用メス
眼軟膏	ピンセットNRのペア。 2
電気かみそり	ピンセットNRのペア。 5
手袋	鈍的切開用はさみ
70％（v / v）エタノール	マイクロはさみ
コットンウールのつぼみ/視線	6.0 Prolene非吸収性縫合糸
ステレオ顕微鏡	2 ×針ホルダー
接着テープ	熱パッド
フォンフレイフィラメント（0.02〜2.0グラムのマウス用）（Stoelting）