Les blessures du nerf Epargnée (SNI) Modèle d'allodynie mécanique induite chez la souris

Résumé

Le modèle du nerf Epargnée blessures animal est décrit ici comme un modèle murin de douleur neuropathique périphérique suivantes dénervation partielle du nerf sciatique par lesioning les branches du tibia et du nerf péronier commun, laissant le nerf saphène reste intacte. Modification du comportement résultant d'allodynie mécanique est quantifiée par des filaments de von Frey.

Résumé

La douleur neuropathique périphérique est une affection chronique grave des douleurs qui peuvent résulter d'un traumatisme des nerfs sensoriels dans le système nerveux périphérique. La blessure épargné nerveuses (SNI) du modèle induit des symptômes de la douleur neuropathique comme l'allodynie mécanique à savoir la douleur due à des stimuli tactiles qui n'ont normalement pas provoquer une réaction douloureuse [1].

Le modèle de souris SNI implique la ligature de deux des trois branches du nerf sciatique (nerf tibial et le nerf fibulaire commun), tandis que le nerf sural est laissé intact [2]. Les résultats des lésions dans l'hypersensibilité marquée dans la zone latérale de la patte, qui est innervé par le nerf sural épargné. Le côté non opéré de la souris peut être utilisée comme contrôle. Les avantages du modèle SNI sont la robustesse de la réponse et qu'il ne nécessite pas de compétences d'experts de microchirurgie.

Le seuil de réponse à la douleur mécanique est déterminée par des essais avec des filaments de von Frey de force de flexion croissante, qui sont répétitivement pressé contre la surface latérale de la patte [3], [4]. Une réaction à la douleur positif est défini comme retrait de la patte soudain broncher et / ou de patte léchage induit par le filament. Une réponse positive dans trois des cinq stimuli répétitifs est défini comme le seuil de douleur.

Tel que démontré dans le protocole vidéo, souris C57BL / 6 expériences allodynie profonde dès le jour suivant la chirurgie et de maintenir ce pendant plusieurs semaines.

Protocole

1. mesures de von Frey de base avant la chirurgie

Pour la procédure de test de von Frey, s'il vous plaît se référer à la section 5.

2. Anesthésie / préparation

1. Anesthésier les animaux (injection intrapéritonéale d'un mélange de kétamine et 100mg/kg de 15 mg / kg de xylazine).
2. Placez l'animal dans un endroit tranquille jusqu'à totalement anesthésié (par exemple recouverte d'une serviette en papier).
3. Vérifiez réflexes en pinçant le bout de la queue et les pattes avec une paire de pincettes. Soyez sûr que les animaux ne réagissent pas avant de procéder.
4. Sous-cutanée d'injecter (zone arrière de l'épaule) 0.5ml solution saline isotonique avec des antibiotiques, par exemple, l'ampicilline (pour éviter la déshydratation et de prévenir l'infection, bien que cela est une procédure chirurgicale mineure).
5. Utiliser un rasoir électrique, raser le champ opératoire de légèrement en dessous de la zone du genou à la région de la hanche (pour les droitiers personnes du membre postérieur gauche est recommandé).
6. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux avec un coton-tige-laine.
7. Placez l'animal sur son côté droit et placer le membre postérieur gauche sur une petite plate-forme de la tenir élevée. Fixer la jambe avec du ruban adhésif.
8. Désinfecter le champ opératoire avec une alternance de gommages d'éthanol et de l'extérieur de la bétadine site chirurgical.

3. Chirurgie

1. Localisez le genou avec le pouce de votre main gauche et utiliser un scalpel pour faire une application. Une incision cm dans le sens longitudinal proximal au genou.
2. Ouvrez la peau par dissection en utilisant la pointe d'une paire de ciseaux stériles.
3. Séparez la couche musculaire par dissection juste à côté du vaisseau sanguin clairement visible, près de l'os cuisse (fémur). Si fait correctement, les couches musculaires se séparer facilement sans aucun saignement, révélant le nerf sciatique droite en dessous des muscles.
   Si le saignement se produit par exemple par des dommages à un vaisseau sanguin près du genou, stérile à usage coton bourgeons ou des morceaux de regard pour absorber le sang. Appuyez sur jusqu'à ce que le saignement s'arrête.
4. Placez la souris sous un microscope stéréo et séparer délicatement les muscles avec une paire de pinces stériles (n ° 2) de visualiser le nerf sciatique. Rétracteurs peut également être appliquée.
5. Identifier la zone où les branches du nerf saphène du nerf sciatique. Le nerf sural est la plus petite des trois branches, ramification vers la droite dans la jambe gauche.
6. Appliquer de suture (6-0 sutures) autour des deux autres branches qui sont toujours en cours en parallèle (les nerfs tibial et fibulaire commun), en faisant bien attention de ne pas toucher la branche saphène. Ceci est une étape critique que le nerf sural doit être laissé intact.
7. Faire un noeud serré chirurgicale. Si le premier nœud est serré, les contractions du membre sera observée.
8. Prenez les nerfs à couper en dessous de la suture avec une paire de pinces (n ° 5) et couper les nerfs dessus et en dessous une pince à épiler avec une petite paire de ciseaux. Par-dessus la première coupe de la paire de pinces à épiler, en tirant des nerfs est évité.
9. Couper les extrémités de suture avec une paire de ciseaux micro et fermer doucement la couche musculaire. Ajouter une goutte de la lidocaïne sur la plaie et suture avec noeuds chirurgicales.

4. Après la chirurgie

1. Vérifiez si la pommade oculaire est encore suffisante.
2. Placez la souris dans une cage propre sous une serviette de papier dans une posture confortable. Si la chambre est froide, placez un pad thermique sous une partie de la cage (seulement sous une partie de la cage de l'animal doit être en mesure d'échapper à une zone de froid si on préfère).
3. S'assurer que l'eau facilement accessible et Chow.

5. von Frey tests (de base et à partir du jour après la chirurgie)

1. Placez la souris en rouge cylindres de plastique de couleur placée sur une table treillis métallique deux jours et un jour avant la chirurgie. S'habituer pendant 15 min dans des bouteilles avant le test. La couleur rouge des cylindres permet aux souris de rapidement se détendre comme ils ne peuvent pas se voir et se trouvent dans une zone plus sombre.
2. Vérifiez que les souris sont calmes et appliquer von Frey filaments à la partie latérale de la patte: En commençant par le filament 0,02 g, appliquez d'abord la force à la patte gauche cinq fois sur une période totale de 30 secondes (environ 2 secondes par stimulus) et de évaluer la réaction de la souris après chaque application. Répétez l'opération avec le même filament et la patte gauche de toute autres souris, puis recommencer avec la patte droite de la première souris avant de passer à filament suivante, par exemple:
   
   • Souris 1: patte gauche 5 fois avec filament 0,02 g
   • Souris 2: patte gauche 5 fois avec filament 0,02 g etc
   • Souris 1: patte droite 5 fois avec filament 0,02 g
   • Souris 2: patte droite 5 fois avec filament 0,02 g etc
   • Souris 1: patte gauche 5 fois avec filament 0,04 g
   • Souris 2: patte gauche 5 fois avec filament 0,04 g etc
3. Réponse dans trois des cinq stimuli est considéré comme une réaction positive. Filaments-dessus SEUILSD peut être utilisée pour vérifier le niveau de seuil.
   Réponse = retrait de la patte soudaine, brutale broncher, patte soudaine lécher.

6. Les résultats représentatifs

Figure 1. Von Frey tests sur C57BL / 6 ans des souris âgées de 8-10 semaines a été effectuée un jour avant l'opération et à plusieurs reprises après la chirurgie. 4-8 animaux ont été inclus dans chaque groupe. Von Frey tests sur le côté opéré est représenté par le côté homolatéral et de contrôle non-exploité est représenté par controlatéral. Le lendemain de la chirurgie des animaux de développer une hypersensibilité significatif sur la patte exploité tandis que le non-exploité n'est que légèrement affectée par rapport à des souris une opération fictive. (* <0,05, ** <0,01, *** <0,001 par rapport ipsilatéral à controlatéral).

Discussion

Les étapes critiques

Dommages au nerf sural doit être évitée afin d'étudier les changements pathologiques dans les lésions du nerf saphène intacte suivants pour les nerfs tibial et fibulaire commun. Les dommages collatéraux du nerf sural peut conduire à la paralysie et peut donc être visualisé comme glisser du membre opéré postérieurs.

Seul le côté latéral de la patte est innervée par le nerf sural épargnée et, par conséquent, seule cette zone développe une neuropathie. Test d'autres domaines, innervée par les nerfs sectionnés, peut fortement biais de l'évaluation de seuil mécanique modifiée.

D'éventuelles modifications

D'autres types de ligatures peuvent être complémentaires en termes d'étudier les conditions suivantes douleur pathologique des lésions nerveuses périphériques, tels que les blessures constriction chronique [5] ou la ligature partielle du nerf [6]. Chaque procédure expérimentale dans les résultats des changements phénotypiques distinctes qui devraient être considérés avant de post-opératoires d'essai.

Par ailleurs, d'autres tests sensoriels tels que l'hyperalgésie thermique peut être appliquée [7], bien que ce phénotype est moins robuste SNI suivant.

Les applications futures

Cette technique peut être utilisée pour les tests de médicaments altérant le développement ou le maintien de l'allodynie mécanique [8]. Analyse du nerf sciatique, les ganglions de la racine dorsale (DRG) et / ou la moelle épinière lombaire permettre à la recherche des mécanismes moléculaires responsables du phénotype induit.

L'expérimentation animale a été réalisée selon bonnes pratiques de laboratoire en pleine conformité avec la réglementation danoise et européenne. Toutes les expériences ont été approuvés par l'expérimentation animale danoises Inspection du ministère de la Justice (2006/561-1206 nombre permission).

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthésie: kétamine et de xylazine	Scalpel
Pommade ophtalmique	Paire de pinces nr. 2
Rasoir électrique	Paire de pinces nr. 5
Gants	Paire de ciseaux pour dissection
70% (v / v) d'éthanol	Ciseaux Micro
Ouate bourgeons / regards	6,0 Prolène non résorbable
Microscope stéréo	2 x porte-aiguilles
Ruban adhésif	Heat pad
von Frey filaments (0,02 - 2,0 g pour les souris) (Stoelting)