Poupado da lesão do nervo Model (SNI) de alodinia mecânica induzida em camundongos

Resumo

Poupado do Nervo modelo animal de lesão é descrita aqui como um modelo do rato da dor neuropática periférica seguintes denervação parcial do nervo ciático por a lesão do tibial e nervo peroneal comum ramos, deixando o nervo sural restante intacto. Modificação comportamental resultante da alodinia mecânica é quantificada por filamentos de von Frey.

Resumo

Dor neuropática periférica é uma condição de dor crônica grave que pode resultar de trauma de nervos sensoriais no sistema nervoso periférico. A lesão do nervo poupado modelo (SNI) induz sintomas da dor neuropática, tais como dor ou seja alodinia mecânica devido a estímulos táteis que normalmente não provocar uma resposta dolorosa [1].

O modelo do rato SNI envolve ligadura de dois dos três ramos do nervo ciático (nervo tibial eo nervo fibular comum), enquanto o nervo sural é deixada intacta [2]. Os resultados da lesão em hipersensibilidade marcada na região lateral da pata, que é inervado pelo nervo sural poupado. O lado não-operado do mouse pode ser usado como um controle. As vantagens do modelo de SNI são a robustez da resposta e que não requerem habilidades de microcirurgia especialista.

O limite para a resposta à dor mecânica é determinada por meio de testes com filamentos de von Frey de aumentar a força de flexão, que são repetidamente pressionado contra a região lateral da pata [3], [4]. Uma reação positiva dor é definida como a retirada de pata súbita, vacilar e / ou pata lambendo induzida pelo filamento. Uma resposta positiva em três dos cinco estímulos repetitivos é definido como o limiar de dor.

Como demonstrado no protocolo de vídeo, camundongos C57BL / 6 alodinia experiência profunda, logo no dia seguinte à cirurgia e manter isso por várias semanas.

Protocolo

1. von Frey medidas de base antes da cirurgia

Para von Frey procedimento de teste, consulte a seção 5.

2. Anestesia / preparação

1. Anestesiar os animais (injeção intraperitoneal de uma mistura de ketamina 100mg/kg e 15 Xilazina mg / kg).
2. Colocar o animal em um lugar calmo até totalmente anestesiado (por exemplo, coberta com uma toalha de papel).
3. Verifique reflexos por beliscar a ponta da cauda e as patas com um par de pinças. Certifique-se que os animais não respondem antes de prosseguir.
4. Por via subcutânea injetar (área de ombro para trás) salina isotônica 0,5 ml com antibióticos, por exemplo, ampicilina (para evitar desidratação e evitar a infecção, embora este seja um pequeno procedimento cirúrgico).
5. Usando um barbeador elétrico, a barba do campo operatório de um pouco abaixo da área do joelho para a área do quadril (para destros pessoas o membro posterior esquerdo é recomendado).
6. Aplicar pomada oftálmica nos olhos com um chumaço de algodão hidrófilo.
7. Colocar o animal em seu lado direito e coloque o membro posterior esquerdo em uma pequena plataforma para mantê-la elevada. Segura a perna com fita adesiva.
8. Desinfectar o campo operatório com a alternância de scrubs de etanol e betadine de fora do sítio cirúrgico.

3. Cirurgia

1. Localize o joelho com o polegar da mão esquerda e usar um bisturi para fazer uma app. Uma incisão cm no sentido longitudinal proximal ao joelho.
2. Abra a pele por dissecção romba com a ponta de uma tesoura esterilizada.
3. Separar a camada muscular por dissecção romba ao lado do vaso sangüíneo claramente visível, perto do osso da coxa (fêmur). Se feito corretamente, as camadas musculares facilmente separados sem qualquer sangramento, revelando o nervo ciático direito abaixo dos músculos.
   Se o sangramento ocorre por exemplo, danos a um vaso sanguíneo próximo ao joelho, use estéril algodão botões ou pedaços de olhar para absorver o sangue. Pressione até que o sangramento pare.
4. Posicione o mouse em um microscópio estéreo e separe cuidadosamente os músculos com um par de pinças estéreis (nr. 2) para visualizar o nervo ciático. Retratores também pode ser aplicada.
5. Identificar a área onde os ramos do nervo sural do nervo ciático. O nervo sural é o menor dos três ramos, ramificação à direita na perna esquerda.
6. Aplicar sutura (6-0) em torno dos outros dois ramos que ainda estão em execução em paralelo (os nervos tibial e fibular comum), sendo muito cuidadoso para não tocar no ramo sural. Este é um passo crítico como o nervo sural tem de ser deixada completamente intacto.
7. Faça um nó apertado cirúrgico. Se o primeiro nó está apertado, as contrações do membro será observado.
8. Agarre os nervos a ser cortado abaixo da sutura com um par de pinças (nr. 5) e cortar os nervos acima e abaixo de uma pinça com um pequeno par de tesouras. Pelo primeiro corte acima do par de pinças, puxando dos nervos é evitada.
9. Eliminar as extremidades da sutura com um par de tesouras micro e suavemente feche a camada muscular. Adicionar uma gota de lidocaína sobre a ferida e sutura com nós cirúrgicos.

4. Após a cirurgia

1. Verifique se pomada ainda é suficiente.
2. Posicione o mouse em uma gaiola limpa sob uma toalha de papel em uma postura confortável. Se o quarto é frio, coloque uma almofada de calor sob uma parte da gaiola (somente sob parte da gaiola que o animal deve ser capaz de escapar a uma área mais fria se preferir).
3. Garantir água de fácil acesso e ração.

5. von Frey teste (linha de base, e desde o dia após a cirurgia)

1. Coloque os ratos em vermelho cilindros de plástico colorido colocado sobre uma mesa de malha de arame de dois dias e um dia antes da cirurgia. Habituar por 15 min em cilindros antes do teste. A cor vermelha dos cilindros ajuda os ratos rapidamente relaxar, pois não podem ver um ao outro e estão em uma área mais escura.
2. Verificar se os ratos são calmas e aplicar filamentos von Frey para a parte lateral da pata: Começando com o filamento 0,02 g, primeiro aplique força para a pata esquerda cinco vezes durante um período total de 30 segundos (cerca de 2 segundos por estímulo) e avaliar a reação do camundongo após cada aplicação. Repita com o filamento mesmo ea pata esquerda de qualquer outros ratos, e depois começar tudo de novo com a pata direita do mouse antes de passar para a próxima filamento, por exemplo:
   
   • Rato 1: pata esquerda 5 vezes com filamentos de 0,02 g
   • Mouse 2: pata esquerda 5 vezes com filamentos de 0,02 g etc
   • Rato 1: pata direita 5 vezes com filamentos de 0,02 g
   • Mouse 2: pata direita 5 vezes com filamentos de 0,02 g etc
   • Rato 1: pata esquerda 5 vezes com filamentos de 0,04 g
   • Mouse 2: pata esquerda 5 vezes com filamentos de 0,04 g etc
3. Resposta em três dos cinco estímulos é considerada como uma reação positiva. Filamentos acima threshold pode ser aplicado para verificar o nível do limiar.
   Resposta = retirada pata súbita, repentina vacilar pata, lambendo súbita.

6. Resultados representativos

Figura 1. Von Frey testes em camundongos C57BL / 6 ratos idade 80-10 semanas de idade foi realizada um dia antes da operação e repetidamente após a cirurgia. 4-8 animais foram incluídos em cada grupo. Von Frey testes do lado operado é representado por ipsilateral com o lado controle não operado é representado por contralateral. O dia após a cirurgia os animais desenvolvem hipersensibilidade significativo sobre a pata operada enquanto o não operado é apenas ligeiramente afetada em relação aos ratos sham operados. (* <0,05, ** <0,01, *** <0,001, em relação ao contralateral ipsilateral).

Discussão

Etapas críticas

Danos ao nervo sural devem ser evitados a fim de estudar alterações patológicas na lesão do nervo sural seguintes intacto para os nervos tibial e fibular comum. Danos colaterais do nervo sural pode levar à paralisia e pode assim ser visualizado como arrastar do membro operado traseiras.

Apenas o lado lateral da pata é inervado pelo nervo sural poupado e, portanto, apenas esta área desenvolve neuropatia. Testes de outras áreas, inervados pelos nervos seccionados, pode viés fortemente a avaliação do limiar de mecânica alterada.

Possíveis modificações

Outros tipos de ligaduras podem ser complementares em termos de estudar as condições de dor patológica após a lesão do nervo periférico, como a lesão constrição crônica [5] ou ligadura parcial do nervo [6]. Cada experimental procedimento resulta em alterações fenotípicas distintas que devem ser considerados antes da pós-operatório de testes.

Além disso, outros testes sensoriais, tais como hiperalgesia térmica pode ser aplicada [7], embora este fenótipo é menos robusto SNI seguinte.

Aplicações futuras

Esta técnica pode ser usada para testes de drogas alteram o desenvolvimento ou manutenção de alodinia mecânica [8]. Análise do nervo ciático, os gânglios da raiz dorsal (DRG) e / ou o cabo de coluna lombar permitir a investigação dos mecanismos moleculares responsáveis ​​pelo fenótipo induzido.

Experimentação animal foi realizada de acordo com boas práticas de laboratório em plena conformidade com os regulamentos dinamarquês e europeu. Todos os experimentos foram aprovados pelo dinamarquês Experimentos em animais Inspecção do Ministério da Justiça (número de permissão 2006/561-1206).

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anestesia: Ketamina e Xilazina	Bisturi
Pomada oftálmica	Par de pinças nr. 2
Barbeador elétrico	Par de pinças nr. 5
Luvas	Tesoura para dissecção romba
70% (v / v) de etanol	Micro tesoura
Algodão brotos / olhar	6,0 sutura não absorvível Prolene
Microscópio estéreo	2 x agulha titulares
Fita adesiva	Calor pad
filamentos de von Frey (0,02-2,0 g para ratos) (Stoelting)