Risparmiato il Nerve pregiudizio (SNI) Modello di Allodinia meccanica indotta nei topi

Riepilogo

Il Risparmiata lesioni nervose modello animale è descritto qui come un modello murino di dolore neuropatico periferico dopo denervazione parziale del nervo sciatico con lesione dei rami del nervo tibiale e peroneale comune, lasciando i rimanenti nervo surale intatta. Modificazione comportamentale che derivi dalla meccanica allodinia è quantificato da von filamenti Frey.

Abstract

Dolore neuropatico periferico è una condizione di dolore cronico grave che può derivare da traumi ai nervi sensoriali del sistema nervoso periferico. Il risparmiato lesioni nervose (SNI) modello induce sintomi del dolore neuropatico, come dolore allodinia meccanica cioè a causa di stimoli tattili che normalmente non provocano una risposta dolorosa [1].

Il modello murino SNI prevede la legatura di due delle tre branche del nervo sciatico (il nervo tibiale e il nervo peroneo comune), mentre il nervo surale è lasciata intatta [2]. I risultati lesione nei casi di ipersensibilità segnato nella zona laterale della zampa, che è innervato dal nervo surale risparmiato. La non-operato lato del mouse può essere utilizzato come controllo. I vantaggi del modello di SNI sono la robustezza della risposta e che non richiede competenze di microchirurgia esperti.

La soglia del dolore per la risposta meccanica è determinata dal test con filamenti di Von Frey di crescente forza di piega, che vengono ripetutamente premuto contro la superficie laterale della zampa [3], [4]. Una reazione positiva dolore è definito come il ritiro zampa improvvisa, indietreggiare e / o leccarsi zampa indotto dal filamento. Una risposta positiva a tre su cinque stimoli ripetitivi è definita come la soglia del dolore.

Come dimostrato nel protocollo video, topi C57BL / 6 allodinia profonda esperienza già a partire dal giorno seguente l'intervento chirurgico e mantenere questo per diverse settimane.

Protocollo

1. misurazioni di base von Frey prima dell'intervento

Per la procedura di von Frey test, fare riferimento alla sezione 5.

2. Anestesia / preparato

1. Anestetizzare gli animali (iniezione intraperitoneale di una miscela di 100mg/kg ketamina e 15 mg / kg xilazina).
2. Posto l'animale in un luogo tranquillo fino a quando completamente anestetizzato (ad esempio coperto da un tovagliolo di carta).
3. Controllare riflessi pizzicando la punta della coda e le zampe con un paio di pinzette. Assicurarsi che gli animali non rispondono prima di procedere.
4. Iniettare per via sottocutanea (zona delle spalle indietro) 0,5 ml soluzione salina isotonica con antibiotici, per esempio ampicillina (per evitare la disidratazione e prevenire l'infezione, anche se questo è un piccolo intervento chirurgico).
5. L'utilizzo di un rasoio elettrico, rasatura del campo operatorio da poco sotto l'area ginocchio alla zona dell'anca (per destrorsi persone l'arto posteriore sinistra è consigliato).
6. Applicare una pomata oftalmica per gli occhi con un cotone-lana gemma.
7. Posto l'animale sul suo lato destro e portare il arti posteriori a sinistra su una piccola piattaforma per mantenerla elevata. Fissare la gamba con nastro adesivo.
8. La disinfezione del campo operatorio con alternanza di macchie di etanolo e betadine da fuori del sito chirurgico.

3. Chirurgia

1. Individuare il ginocchio con il pollice della mano sinistra e utilizzare un bisturi per fare un app. 1 incisione cm in senso longitudinale prossimale al ginocchio.
2. Aprire la pelle per via smussa con la punta di un paio di forbici sterili.
3. Separare lo strato muscolare per via smussa proprio accanto al vaso sanguigno ben visibile, vicino al femore (femore). Se fatto correttamente, gli strati muscolari facilmente separato senza alcun sanguinamento, rivelando il nervo sciatico destro sotto i muscoli.
   Se l'emorragia si verifica ad esempio da un danno ad un vaso sanguigno vicino al ginocchio, l'uso di cotone idrofilo sterile gemme o pezzi dello sguardo per assorbire il sangue. Premere finché l'emorragia si ferma.
4. Posizionare il mouse al microscopio stereo e con attenzione separare i muscoli con un paio di pinzette sterili (nr. 2) per visualizzare il nervo sciatico. Retrattori può anche essere applicata.
5. Identificare l'area in cui i rami del nervo surale dal nervo sciatico. Il nervo surale è il più piccolo dei tre rami, che si dirama a destra alla gamba sinistra.
6. Applicare sutura (6-0 sutura) intorno agli altri due rami, che sono ancora in esecuzione in parallelo (i nervi tibiale e peroneo comune), facendo molta attenzione a non toccare il ramo surale. Questo è un passo critico come il nervo surale deve essere lasciato completamente intatto.
7. Fare un nodo stretto chirurgico. Se il primo nodo è stretto, contrazioni degli arti sarà osservato.
8. Afferra i nervi da tagliare sotto la sutura con un paio di pinzette (nr. 5) e tagliare i nervi sopra e sotto le pinzette con un paio di piccole forbici. In primo luogo il taglio sopra il paio di pinzette, tirando dei nervi è evitato.
9. Tagliare le estremità di sutura con un paio di forbici micro e chiudere delicatamente lo strato muscolare. Aggiungere una goccia di lidocaina per la ferita e suturare con nodi chirurgici.

4. Dopo l'intervento chirurgico

1. Controllare se unguento occhio è ancora sufficiente.
2. Posizionare il mouse in una gabbia pulita sotto un tovagliolo di carta in una posizione comoda. Se la stanza è fredda, posto un pad termico sotto una parte della gabbia (solo in parte della gabbia come l'animale deve essere in grado di sfuggire ad una zona più fredda se preferite).
3. Assicurare acqua facilmente accessibili e chow.

5. von Frey test (di base, e dal giorno dopo l'intervento)

1. Posizionare il mouse in cilindri di plastica di colore rosso posto su un tavolo rete metallica due giorni e un giorno prima dell'intervento. Abituare per 15 minuti in cilindri prima del test. Il colore rosso dei cilindri aiuta i topi a rilassarsi in fretta perché non possono vedersi e si trovano in una zona più scura.
2. Verificare che i topi sono calmi e applicare von filamenti Frey alla parte laterale della zampa: partire con il filamento di 0,02 g, applicare forza alla zampa sinistra per cinque volte per un periodo totale di 30 secondi (circa 2 secondi per lo stimolo) e valutare la reazione del mouse dopo ogni applicazione. Ripetere con il filamento stesso e la zampa sinistra di altri topi, e poi ricominciare di nuovo con la zampa destra del primo mouse prima di passare al successivo filamento, ad esempio:
   
   • Mouse 1: zampa sinistra 5 volte con filamento 0,02 g
   • Mouse 2: zampa sinistra 5 volte con filamento 0,02 g ecc
   • Mouse 1: zampa destra 5 volte con filamento 0,02 g
   • Mouse 2: zampa destra 5 volte con filamento 0,02 g ecc
   • Mouse 1: zampa sinistra 5 volte con filamento 0,04 g
   • Mouse 2: zampa sinistra 5 volte con filamento 0,04 g ecc
3. Risposta a tre su cinque stimoli è considerato come una reazione positiva. Filamenti di sopra threshold può essere applicata per verificare il livello di soglia.
   = Risposta zampa ritiro improvviso, repentino battere ciglio, zampa improvvisa leccare.

6. Rappresentante risultati

Figura 1. Test Von Frey su C57BL / 6 anni topi 8-10 settimane è stato eseguito 1 giorno prima dell'operazione e ripetutamente dopo l'intervento. 4-8 animali sono stati inclusi in ciascun gruppo. Von Frey test del lato operato è rappresentato da ipsilaterale e il non-operato lato il controllo è rappresentato da controlaterale. Il giorno dopo l'intervento degli animali sviluppare ipersensibilità significativo sulla zampa utilizzati mentre il non-operato è solo leggermente influenzata rispetto ai topi sham operato. (* <0,05, ** <0.01, *** <0,001, rispetto ipsilaterale al controlaterale).

Discussione

Passaggi critici

Danni al nervo surale deve essere evitata al fine di studiare i cambiamenti patologici nel pregiudizio intatta a seguito del nervo surale ai nervi tibiale e peroneo comune. Danni collaterali al nervo surale può portare alla paralisi e può quindi essere visualizzato come il trascinamento dell'arto operato posteriori.

Solo la parte laterale della zampa è innervato dal nervo surale risparmiato e, quindi, solo questa zona si sviluppa neuropatia. Test altre zone, innervate dai nervi recisi, può fortemente influenzare la valutazione dei alterata soglia meccanica.

Eventuali modifiche

Altri tipi di legature possono essere complementari in termini di studio delle condizioni patologiche del dolore dopo un trauma del nervo periferico, come una lesione costrizione cronica [5] o la legatura parziale del nervo [6]. Ogni procedura di risultati sperimentali in diversi cambiamenti fenotipici che deve essere valutata prima di post-chirurgia test.

Inoltre, altri test sensoriali come iperalgesia termica può essere applicato [7], anche se questo fenotipo è meno robusta SNI seguente.

Applicazioni future

Questa tecnica può essere utilizzata per la sperimentazione dei farmaci alterare lo sviluppo o la manutenzione di allodinia meccanica [8]. Analisi del nervo sciatico, gangli delle radici dorsali (DRG) e / o il midollo spinale lombare consentirà la ricerca dei meccanismi molecolari responsabili del fenotipo indotto.

La sperimentazione animale è stata eseguita secondo buona prassi di laboratorio nel pieno rispetto della normativa danese ed europea. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal danese Animal Experiments Ispettorato del Ministero della Giustizia (autorizzazione numero 2006/561-1206).

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anestesia: ketamina e xilazina	Bisturi
Pomata oftalmica	Paio di pinzette nr. 2
Rasoio elettrico	Paio di pinzette nr. 5
Guanti	Paio di forbici per dissezione
70% (v / v) di etanolo	Micro forbici
Cotone-lana gemme / sguardo	6,0 Prolene non riassorbibili sutura
Microscopio stereo	2 x ago titolari
Nastro adesivo	Calore pad
filamenti di von Frey (0,02 - 2,0 g per i topi) (Stoelting)