La lesión del nervio Salvados (SNI) Modelo de alodinia mecánica inducida en ratones

Resumen

La lesión del nervio Salvados modelo animal es descrito aquí como un modelo de ratón del dolor neuropático periférico después de denervación parcial del nervio ciático por lesionar las ramas tibial y peroneo común del nervio, dejando el nervio sural se mantiene intacta. Modificación de la conducta resultante de la alodinia mecánica se cuantifica por filamentos de von Frey.

Resumen

El dolor neuropático periférico es una afección grave dolor crónico que puede resultar de un trauma a los nervios sensoriales del sistema nervioso periférico. La lesión del nervio escatimado (SNI) modelo induce los síntomas del dolor neuropático, como la alodinia mecánica es decir, dolor debido a los estímulos táctiles que no suelen provocar una respuesta dolorosa [1].

El modelo de ratón SNI consiste en la ligadura de dos de las tres ramas del nervio ciático (el nervio tibial y el nervio peroneo común), mientras que el nervio sural se deja intacto [2]. Los resultados de la lesión en la hipersensibilidad marcada en la zona lateral de la pata, que es inervado por el nervio sural ahorrado. El lado no operado del ratón se puede usar como control. Las ventajas del modelo de SNI son la solidez de la respuesta y que no requiere conocimientos de expertos de microcirugía.

El umbral para la respuesta al dolor mecánico está determinado por las pruebas con filamentos de von Frey de la creciente fuerza de flexión, que son repetidamente presiona contra la zona lateral de la pata [3], [4]. Una reacción positiva del dolor se define como repentina retirada de la pata, acobardarse y / o la pata lamiendo inducida por el filamento. Una respuesta positiva en tres de los cinco estímulos repetitivos se define como el umbral del dolor.

Como se demuestra en el protocolo de vídeo, los ratones C57BL / 6 experiencia alodinia profunda tan pronto como al día siguiente de la cirugía y mantener esto durante varias semanas.

Protocolo

1. von Frey mediciones de referencia antes de la cirugía

Para el procedimiento de von Frey prueba, por favor refiérase a la sección 5.

2. Anestesia / preparación

1. Anestesiar a los animales (inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina y 100mg/kg 15 xilazina mg / kg).
2. Colocar el animal en un lugar tranquilo hasta que esté completamente anestesiado (por ejemplo, cubierta con una toalla de papel).
3. Revisar los reflejos pellizcando la punta de la cola y las patas con un par de pinzas. Asegúrese de que los animales no responden antes de proceder.
4. Por vía subcutánea inyección (zona posterior del hombro) con 0,5 ml de solución salina isotónica antibióticos, por ejemplo, ampicilina (para evitar la deshidratación y prevenir la infección, aunque este es un procedimiento quirúrgico menor).
5. Usando una máquina de afeitar eléctrica, afeitarse el campo operatorio desde ligeramente por debajo del área de la rodilla a la cadera (para las personas diestras la extremidad posterior izquierda es recomendable).
6. Aplique un ungüento oftálmico para los ojos con un bastoncillo de algodón.
7. Colocar el animal sobre su lado derecho y colocar la extremidad posterior izquierda en una pequeña plataforma para mantenerla elevada. Asegurar la pierna con cinta adhesiva.
8. Desinfectar el campo operatorio con la alternancia de matorrales de etanol y betadine de fuera del sitio quirúrgico.

3. Cirugía

1. Localice la rodilla con el pulgar de su mano izquierda y el uso de un bisturí para realizar una aplicación. Incisión de 1 cm en la dirección longitudinal proximal a la rodilla.
2. Abrir la piel mediante disección roma con la punta de unas tijeras estériles.
3. Separar la capa muscular mediante disección roma justo al lado de los vasos sanguíneos visibles, cerca del hueso del muslo (fémur). Si se hace correctamente, las capas musculares fácilmente por separado sin ningún tipo de hemorragia, dejando al descubierto el nervio ciático derecho debajo de los músculos.
   Si se produce una hemorragia por ejemplo, por el daño a los vasos sanguíneos cerca de la rodilla, el uso de lana estéril bastoncillos de algodón o pedazos de la mirada para absorber la sangre. Pulse hasta que se detenga el sangrado.
4. Coloque el ratón debajo de un microscopio estereoscópico y separar cuidadosamente los músculos con un par de pinzas estériles (n º 2) para visualizar el nervio ciático. Retractores también se puede aplicar.
5. Identificar el área donde las ramas del nervio sural del nervio ciático. El nervio sural es el más pequeño de los tres poderes, la ramificación a la derecha en la pierna izquierda.
6. Aplicar sutura (6-0 sutura) en torno a las otras dos ramas que todavía están funcionando en paralelo (los nervios peroneo común y tibial), teniendo mucho cuidado de no tocar la rama sural. Este es un paso crítico como el nervio sural tiene que ser dejado intacto.
7. Haga un nudo apretado quirúrgica. Si el primer nudo es apretado, las contracciones de las extremidades se observan.
8. Coge los nervios a cortar por debajo de la sutura con un par de pinzas (n º 5), y cortar los nervios encima y debajo de las pinzas con un pequeño par de tijeras. En primer lugar, el corte por encima del par de pinzas, halando de los nervios se evita.
9. Corte los extremos de sutura con un par de tijeras micro y cierre suavemente la capa muscular. Añadir una gota de lidocaína en la herida y la sutura con nudos quirúrgicos.

4. Después de la cirugía

1. Compruebe si ungüento para los ojos es todavía suficiente.
2. Coloque el ratón en una jaula limpia con una toalla de papel en una postura cómoda. Si la habitación es fría, colocar una almohadilla de calor en una parte de la caja (sólo en la parte de la jaula, el animal debe ser capaz de escapar a un área más fría si se prefiere).
3. Asegurar que el agua de fácil acceso y comida.

5. prueba de von Frey (línea de base, y desde el día después de la cirugía)

1. Coloque el ratón en rojo cilindros de plástico de color colocados sobre una mesa de malla de alambre de dos días y un día antes de la cirugía. Habituarse durante 15 minutos en los cilindros antes de la prueba. El color rojo de los cilindros de ayuda a los ratones para relajarse rápidamente, ya que no pueden verse entre sí y se encuentran en una zona más oscura.
2. Verifique que los ratones son tranquilas y aplicar filamentos de von Frey a la parte lateral de la pata: A partir del filamento de 0,02 g, en primer lugar aplicar la fuerza de la pata izquierda cinco veces durante un período total de 30 segundos (aproximadamente 2 segundos por estímulo) y evaluar la reacción de los ratones después de cada aplicación. Repita el procedimiento con el mismo filamento y la garra izquierda de otros ratones, y luego comenzar de nuevo con la pata derecha del ratón antes de pasar a la siguiente filamento, por ejemplo:
   
   • 1 del ratón: la pata izquierda 5 veces con filamentos de 0,02 g
   • Mouse 2: pata izquierda 5 veces con filamentos de 0,02 g, etc
   • 1 del ratón: la pata derecha 5 veces con filamentos de 0,02 g
   • Mouse 2: pata derecha 5 veces con filamentos de 0,02 g, etc
   • 1 del ratón: la pata izquierda 5 veces con filamentos de 0,04 g
   • Mouse 2: pata izquierda 5 veces con filamentos de 0,04 g, etc
3. Respuesta en tres de los cinco estímulos se considera una reacción positiva. Filamentos por encima de threshold se puede aplicar para verificar el nivel de umbral.
   Respuesta = retirada de la pata súbita, repentina inmutarse, la pata de repente lamer.

6. Los resultados representativos

Figura 1. Von Frey prueba en C57BL / 6 ratones de edad 8-10 semanas de edad se realizó un día antes de la operación y en varias ocasiones después de la cirugía. Animales 8.4 se incluyeron en cada grupo. Von Frey prueba en el lado operado está representado por ipsilateral y la parte de control no funciona es representado por contralateral. El día después de la cirugía los animales desarrollan hipersensibilidad significativa en la pata operada, mientras que la no operada es sólo ligeramente afectada en relación con los ratones con operación simulada. (* <0,05, ** <0,01, *** <0,001, en relación ipsilateral a contralateral).

Discusión

Los pasos críticos

Daño en el nervio sural se debe evitar con el fin de estudiar los cambios patológicos en el intacta lesión del nervio sural siguientes a los nervios peroneo común y tibial. El daño colateral en el nervio sural puede conducir a la parálisis y por lo tanto puede ser visualizado como el arrastre de la extremidad posterior funcionamiento.

Sólo la parte lateral de la pata es inervado por el nervio sural ahorrado y, por tanto, sólo que esta zona se desarrolla una neuropatía. Prueba de otras áreas, inervados por los nervios seccionados, puede muy sesgo en la evaluación del umbral de mecánica alterada.

Posibles modificaciones

Otros tipos de ligaduras pueden ser complementarios en términos de estudio de las condiciones patológicas del dolor después de una lesión de nervios periféricos, tales como la lesión de constricción crónica [5] o la ligadura parcial del nervio [6]. Los resultados de cada procedimiento experimental en distintos cambios fenotípicos que deben ser considerados antes de la prueba después de la cirugía.

Además, otras pruebas sensoriales, tales como la hiperalgesia térmica se puede aplicar [7], aunque este fenotipo es menos robusto SNI siguientes.

Las futuras aplicaciones

Esta técnica puede ser utilizada para las pruebas de drogas que alteran el desarrollo o mantenimiento de la alodinia mecánica [8]. Análisis del nervio ciático, los ganglios de la raíz dorsal (DRG) y / o la médula espinal lumbar permitir la investigación de los mecanismos moleculares responsables del fenotipo inducido.

La experimentación con animales se realizó de acuerdo a buenas prácticas de laboratorio en plena conformidad con las normas danesas y europeas. Todos los experimentos fueron aprobados por el danés experimentos con animales de Inspección del Ministerio de Justicia (número de la autorización 2006/561-1206).

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anestesia: La ketamina y xilazina	Bisturí
Oftálmicos pomada	Pinzas nr. 2
Rasuradora eléctrica	Pinzas nr. 5
Guantes	Par de tijeras para disección roma
70% (v / v) de etanol	Micro tijeras
Lana de bastoncillos de algodón / la mirada	6.0 Prolene sutura no absorbible
Microscopio estereoscópico	2 x porta-agujas
Cinta adhesiva	Almohadilla de calor
filamentos de von Frey (0,02 - 2,0 g para los ratones) (Stoelting)