마우스에서 유도된 기계 Allodynia의 겪었던 신경 상해 (스니) 모델

요약

용서해주 신경 부상 동물 모델은 나머지 sural 신경은 그대로두고, tibial 및 일반 peroneal 신경 가지를 lesioning하여 좌골 신경의 부분 denervation 다음과 주변 neuropathic 고통의 마우스 모델로 여기에 설명되어 있습니다. 기계 allodynia 인한 행동 수정은 폰 프라이 필라멘트에 의해 계량입니다.

초록

주변 neuropathic 통증이 외상에서 말초 신경계의 감각 신경에 발생할 수 있습니다 심각한 만성 통증 상태입니다. 용서해주 신경 손상 (스니) 모델로 인해 일반적으로 통증 반응을 자극하지 마라 촉각 자극하기 위해 기계 allodynia 즉, 통증 neuropathic 고통의 증상을 유도 [1].

sural 신경이 그대로 남아있는 동안 스니 마우스 모델, 좌골 신경 (tibial 신경 및 일반 peroneal 신경)의 세 가지 중 두 결합을 포함 [2]. 겪었던 sural 신경에 의해 innervated있는 앞발의 측면 영역에 표시된 과민성의 병변 발생합니다. 마우스 이외의 운영 측면은 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 스니 모델의 장점은 응답의 견고하고 있으며 전문가 microsurgical 기술을 필요로하지 않습니다.

기계적 통증 반응에 대한 임계값을 반복 넘어 측면 지역에 대한 누르는 아르 증가 굽힘 무력 폰 프라이 필라멘트와 테스트에 의해 결정됩니다 [3] [4]. 긍정적인 통증 반응은 필라멘트에 의해 유도된 핥아 및 / 또는 앞발을 아무 문제, 갑자기 포 탈퇴로 정의됩니다. 3 승제야 반복적인 자극에 긍정적인 반응은 고통의 한계로 정의됩니다.

로 비디오 프로토콜 시연, C57BL / 6 마​​우스는 수술 다음날 일찍 심오한 allodynia을 경험하고 몇 주 동안 이것을 유지합니다.

프로토콜

1. 이전 수술 폰 프라이베이스 라인 측정

폰 프라이 테스트 절차, 5 항을 참조하십시오.

2. 마취 / 준비

1. 동물 (케타민을 15 MG / kg Xylazine을 100mg/kg의 혼합물의 intraperitoneal 주사를) 마취.
2. (예 : 종이 타월로 덮여있) 완전히 anesthetized 때까지 조용한 장소에서 동물을 놓으십시오.
3. 핀셋 한 쌍의와 꼬리의 끝에와 발 곤란하여 반사를 확인합니다. 동물이 계속 진행하기 전에 응답하고 있는지 확인한다.
4. Subcutaneously, 항생제와 (과 다시 어깨 지역) 예 : 암피실린를 (이것은 가벼운 수술이지만, 탈수를 방지하고 감염을 방지하기 위해) 0.5ml isotonic 호수 주입.
5. 전기 면도기 사용 (오른손잡이 인 왼쪽 뒷다리가 권장) 약간 허리 영역으로 무릎 영역 아래에서 수술 필드를 면도.
6. 목화 - 울 버드와 눈 안과 연고를 적용합니다.
7. 그 오른쪽에있는 동물을 놓고 그것이 높은 유지하는 작은 플랫폼에서 왼쪽 hindlimb를 놓습니다. 접착제 테이프로 다리를 고정합니다.
8. 외과 사이트 밖에서 에탄올과 betadine의 스크럽을 교대로 수술 분야를 소독.

3. 외과

1. 왼손의 엄지와 무릎을 찾아 응용 프로그램을 만들기 위해 메스를 사용합니다. 무릎에 근위 세로 방향으로 1cm의 절개.
2. 멸균 가위의 팁을 사용 무딘 절개하여 피부를 엽니다.
3. 바로 명확하게 보이는 혈관 옆에 무딘 절개로 근육 레이어를 별도의 넓적다리 뼈 (대퇴골)에 인접해 있습니다. 제대로하면, 근육층은 쉽게 바로 근육 아래 좌골 신경을 드러내는 어떠한 출혈없이 별도의 것입니다.
   출혈이 거의 무릎에 혈관 손상에 의해 발생하는 경우 예를 들면, 혈액을 흡수하기 위해 멸균 솜 울 꽃봉오리이나 시선의 조각을 사용합니다. 출혈이 멈출 때까지 누르십시오.
4. 스테레오 현미경 마우스를 놓고 조심스럽게 좌골 신경을 시각화하기 위해 멸균 핀셋 (nr. 2) 한 쌍의와 근육을 분리. 견인기도 적용될 수 있습니다.
5. 좌골 신경에서 sural 신경 가지 영역을 식별합니다. sural 신경이 왼쪽 다리에서 오른쪽으로 분기, 세 가지의 작은 것입니다.
6. 여전히, (tibial 일반적인 peroneal 신경) 병렬 실행 sural 지점을 만지지 않도록 조심중인 다른 두 가지 주위 봉합을 (6-0 봉합사) 적용합니다. sural 신경이 완전히 그대로 유지되어야한다로 이것은 중요한 단계입니다.
7. 꽉 수술 매듭을 만듭니다. 첫 번째 매듭이 꽉 경우, 사지의 수축이 관찰됩니다.
8. 핀셋 한 쌍의 (nr. 5)와 봉합 아래 절단되도록 신경을 잡고 가위의 작은 한 쌍의와 핀셋 위 아래의 신경을 ​​절단. , 족집게의 쌍을 위에 절단 신경의 첫번째 철수에 의해 피할 수있다.
9. 마이크로 가위로 봉합 종료를 차단하고 부드럽게 근육 레이어를 닫습니다. 수술 옹이와 상처를 봉합하기 위해 lidocaine의 드롭을 추가합니다.

4. 수술 후

1. 눈 연고가 여전히 충분한 있는지 확인하십시오.
2. 편안한 자세에서 종이 타월 아래 깨끗한 새장에 마우스를 놓습니다. 방이 차가운 경우 (단 원하는 경우 추운 지역으로 탈출할 수 있어야 동물 케이지의 일부 이하)은 새장의 한 부분 아래에 열 패드를 놓습니다.
3. 쉽게 접근할 수 물과 식량을 보장합니다.

5. 폰 프라이 테스트 (기준 및 수술 다음날부터)

1. 와이어 메쉬 테이블 이틀 수술 이전에 하루에 배치 붉은 컬러 플라스틱 실린더에서 생쥐를 놓습니다. 테스트하기 전에 실린더에서 15 분 길들. 실린더의 붉은 색깔은 그들이 서로를보고 어두운 지역에있는 수로 쥐가 빨리 휴식을 취할 수 있도록 도와줍니다.
2. 생쥐가 침착되어 있는지 확인하고 손 옆 부분에 폰 프라이 필라멘트를 적용 : 0.02 g 필라멘트와 함께 시작하는 것은, 최초 30 초 (자극 당 약 2 초) 총 기간 동안 왼쪽 앞발 다섯 번 힘을 적용 각 응용 프로그램 후 마우스의 반응을 측정. 같은 필라멘트와 다른 생쥐의 왼쪽 앞발과 반복하고 다음 필라멘트 예로 이동하기 전에 첫 번째 마우스의 오른쪽 앞발로 다시 시작 :
   
   • 마우스 1 : 왼쪽 발 필라멘트 0.02 g 5 회
   • 마우스 2 : 왼쪽 발 필라멘트 0.02 g 등 5 회
   • 마우스 1 : 라이트 필라멘트 0.02 g 5 회
   • 마우스 2 : 라이트 필라멘트 0.02 g 등 5 회
   • 마우스 1 : 왼쪽 발 필라멘트 0.04 g 5 회
   • 마우스 2 : 왼쪽 발 필라멘트 0.04 g 등 5 회
3. 오 자극 중 3에 대한 응답은 긍정적인 반응으로 간주됩니다. threshol 상기 필라멘트D는 임계값 수준을 확인하기 위해 적용할 수 있습니다.
   답변 = 갑자기 발 탈퇴, 리킹 갑자기 아무 문제, 갑자기 앞발.

6. 대표 결과

8~10주 이전 C57BL / 6 마우스의 연령에 그림 1. 본 프라이 테스트 전에 작동 일일 수행과 반복 수술을 따라했다. 4-8 동물은 각 그룹에 포함되었다. 운영 측면에 본 프라이 테스트는 ipsilateral로 표시되며 이외의 운영 제어 측면은 contralateral으로 표시됩니다. 이외의 운영은 약간 가짜 운항 마우스에 상대적으로 영향을하면서 오늘 하루 종일 수술 후 동물 운영 앞발에 상당한 과민성을 개발합니다. (* <0.05, ** <0.01, *** <0.001, contralateral에 ipsilateral 상대적).

토론

중요 단계

sural 신경 손상은 tibial 일반적인 peroneal 신경에 손상 sural 신경 다음과 같은 부상의 병리 학적 변화를 연구하기 위해서는 피해야한다. sural 신경에 부수적인 피해 마비로 이어질 수 있으며, 따라서 운영 뒷다리의 드래그로 시각 수 있습니다.

손만이 측면 측면이 겪었던 sural 신경에 의해 innervated하고, 따라서,이 지역에만 신경 장해를 개발하고있다. 강력 바이어스 변경 기계 임계값의 평가를 가로로 신경에 의해 innervated 다른 분야를 할 수 테스트.

가능한 수정

ligations 다른 유형의 이러한 만성 수축 부상으로 말초 신경 손상에 따라 병적인 통증 조건, 연구의 관점에서 보충 수 있습니다 [5] 또는 일부 신경 내고 [6]. 이전 수술 후 테스트로 간주되어야 뚜렷한 phenotypic 변화의 각 실험 절차 결과입니다.

이 표현형 덜 견고한 다음 스니 있지만 또한 같은 온도 hyperalgesia 같은 다른 감각 테스트 [7]이 적용될 수 있습니다.

미래 애플 리케이션

이 방법은 기계 allodynia의 개발 또는 유지 보수를 변경 약품의 테스트에 사용할 수 있습니다 [8]. 좌골 신경의 분석, 지느러미 루트 신경 (DRG) 및 / 또는 요추 척수는 유도 표현형에 대한 분자 메커니즘 연구 책임 수 있습니다.

동물 실험은 덴마크와 유럽 규정을 준수 전체 좋은 실험실 연습에 따라 수행되었다. 모든 실험은 법무성 (허가 번호 2006/561-1206) 아래 덴마크 동물 실험 검사관의 관할 구역에 의해 승인되었습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
마취 : 케타민을와 Xylazine	외과용 메스
안과 연고	핀셋 NR의 쌍. 2
전기 면도기	핀셋 NR의 쌍. 5
장갑	무딘 절개에 대한 가위의 쌍을
70% (V / V) 에탄올	마이크로 가위
커튼 - 울 꽃봉오리 / 시선	6.0 Prolene 비 흡수성 봉합
스테레오 현미경	2 X 니들 홀더
접착제 테이프	열 패드
폰 프라이 필라멘트 (0.02-2.0 g 쥐를위한) (스토엘팅)