Пощадили повреждение нерва (SNI) Модель Индуцированные Механические аллодиния у мышей

Резюме

Пощадили повреждение нерва животного модель описывается здесь как мышь модель периферической нейропатической боли после частичной денервации седалищного нерва lesioning большеберцового и общего малоберцового ветвей нерва, оставив икроножных нервов нетронутым. Поведенческие модификации в результате механической аллодиния можно измерить с помощью нитей фон Фрей.

Аннотация

Периферийные нейропатической боли является тяжелым хроническим заболеванием боль, которая может быть результатом травмы чувствительных нервов в периферической нервной системе. Пощадили повреждение нерва (SNI) модель вызывает симптомы нейропатической боли, такие как механическая боль аллодиния т.е. из-за тактильные раздражения, которые обычно не вызывают болезненных ответ [1].

Модель SNI мыши включает перевязку двух из трех ветвей седалищного нерва (большеберцового нерва и общего малоберцового нерва), а икроножных нервов остается без изменений [2]. Поражение приводит к повышенной чувствительности отмечен в боковой площади лапу, которая иннервируется пощадил икроножных нерва. Неоперированных сторону мышь можно использовать в качестве контроля. Преимущества модели SNI являются надежность и ответ, что он не требует навыков эксперт микрохирургических.

Порог для механического ответа боли определяется путем тестирования с фон нитей Фрей увеличения силы изгиба, которые многократно прижимается боковой площади лапу [3], [4]. Положительная реакция боль определяется как внезапное снятие лапу, дрогнув и / или лапу лизать индуцированных нити. Положительный отклик в трех из пяти повторяющихся стимулов определяется как болевой порог.

Как показано в видео-протокол, C57BL / 6 мышей опыт глубокого аллодиния уже на следующий день после операции и сохранить это в течение нескольких недель.

протокол

1. фон Фрей базовые измерения до операции

Для фон процедуру тестирования Фрей, пожалуйста, обратитесь к разделу 5.

2. Анестезия / препарата

1. Анестезию животных (при введении препарата в смеси 100mg/kg кетамин и 15 мг / кг Ксилазин).
2. Место животное в тихое место, до полного наркоза (например, покрыты бумажным полотенцем).
3. Проверить рефлексы, зажимая кончик хвоста и лап с пинцетом. Будьте уверены, что животные не реагируют прежде чем продолжить.
4. Подкожно вводят (задняя область плеча) 0,5 мл изотонический солевой раствор с антибиотиками, например, ампициллин (чтобы избежать обезвоживания и профилактики инфекции, хотя это незначительные хирургические процедуры).
5. Использование электрической бритвы, бритье операционного поля от чуть ниже колен области для области бедра (для правшей левой задней конечности рекомендуется).
6. Применение глазной мази для глаз с ватой зародыше.
7. Место животных на правый бок и положите левую задние конечности на небольшую площадку, чтобы держать это повышение. Безопасные ноги клейкой лентой.
8. Лечить операционного поля с чередующимися скрабы этанола и бетадин от хирургического нашем сайте.

3. Хирургия

1. Найдите колена с большим пальцем левой руки и использовать скальпель, чтобы сделать приложение. 1 см разрез в продольном направлении, проксимальнее коленного сустава.
2. Открытое кожи тупой диссекции с помощью иглы парой стерильных ножниц.
3. Отдельные мышечного слоя путем тупой диссекции в непосредственной близости от хорошо видны кровеносные сосуды, близкие к бедренной кости (бедро). Если все сделано правильно, мышечные слои будут легко отделить без каких-либо кровотечение, выявление седалищного нерва справа внизу мышц.
   Если кровотечение происходит, например, с повреждением кровеносных сосудов близко к колену, используйте стерильные ватные почки или части взгляда, чтобы поглотить кровь. Нажимайте, пока не остановится кровотечение.
4. Наведите под стерео микроскопом и тщательно отдельных мышц с парой стерильных пинцетов (№ 2) для визуализации седалищного нерва. Ретракторы также может быть применен.
5. Определите область, где икроножных ветвей нерва от седалищного нерва. Икроножных нерва является самым маленьким из трех ветвей, ветвление, чтобы прямо в левую ногу.
6. Применить шва (6-0 шва) вокруг двух других отраслей, которые все еще работают параллельно (большеберцового и общего малоберцового нервов), будучи очень осторожны и не прикасайтесь икроножных отрасли. Это очень важный шаг, как икроножных нервов, чтобы их оставили в полной неприкосновенности.
7. Сделать плотно хирургических узлов. Если первый узел туго, сокращений конечности будут соблюдены.
8. Захватите нервы быть сокращены ниже шва с пинцетом (№ 5) и вырезать нервы выше и ниже пинцетом с небольшим ножницы. По первой резки выше пинцетом, перетягивание нервов не происходит.
9. Отрежьте шов заканчивается пару микро-ножницы и аккуратно закрыть мышечного слоя. Добавить каплю раствора лидокаина на рану и шовные хирургические узлы.

4. После операции

1. Проверьте, глазная мазь по-прежнему достаточно.
2. Наведите в чистой клетке под бумажным полотенцем в удобном положении. Если в комнате холодно, место тепла площадку под часть клетки (только под часть клетки, как животных должны быть в состоянии бежать в холодные области, если предпочтительно).
3. Обеспечить легко доступной водой и кормом.

5. фон Фрей тестирования (базовый уровень, и на следующий день после операции)

1. Место мышей в красные пластиковые цилиндры стоящую на столе проволочной сетки двух дней и один день до операции. Приучать течение 15 мин в цилиндры перед тестированием. Красный цвет цилиндров помогает мышам быстро расслабиться, поскольку они не могут видеть друг друга и находятся в темной области.
2. Убедитесь, что мышь спокойны и применять фон Фрей нитей на боковой части лапу: начиная с 0,02 г нити, сначала прикладывать к левой лапой в пять раз за весь период от 30 секунд (примерно 2 секунды на раздражитель) и оценить реакцию мыши после каждого применения. Повторите с той же нити и левой лапой любой другой мыши, а затем начните снова с правой лапой первую мышь, прежде чем перейти к следующему нити, например:
   
   • Мышь 1: левая лапа 5 раз нити 0,02 г
   • Мышь 2: левая лапа 5 раз с 0,02 г нити и т.д.
   • Мышь 1: правая лапа 5 раз нити 0,02 г
   • Мышь 2: правая лапа 5 раз с 0,02 г нити и т.д.
   • Мышь 1: левая лапа 5 раз нити 0,04 г
   • Мышь 2: левая лапа 5 раз с 0,04 г нити и т.д.
3. Ответ в трех из пяти стимулов рассматривается как положительная реакция. Нити выше thresholг может быть применен для проверки порогового уровня.
   Ответ = внезапного изъятия лапу, внезапные дрогнув, внезапные лапу лизать.

6. Представитель результаты

Рисунок 1. Фон Фрей тестирование на C57BL / 6 мышей возрасте 8-10 недель было выполнено за 1 день до операции и несколько раз после операции. 4-8 животных, включенных в каждую группу. Фон Фрей тестирование на оперированной стороне представлена ​​ипсилатеральной и неоперированных контрольной стороне представлена ​​контралатеральной. День после операции животных развивать значительные гиперчувствительности на оперированной лапе при неоперированных лишь немного пострадавших по отношению к мнимой работать мышей. (* <0,05, ** <0,01, *** <0,001, ипсилатеральных по отношению к контралатеральной).

Обсуждение

Критические шаги

Повреждение нервов икроножных следует избегать в целях изучения патологических изменений в нетронутой икроножных травмы следующие нерв голени и общего малоберцового нервов. Сопутствующий ущерб в икроножных нерва может привести к параличу и тем самым могут быть представлены в виде увлечения работают задние конечности.

Только боковые стороны лапы иннервируется пощадил икроножных нервов и, следовательно, только в этой области развивается нейропатия. Тестирование других областях, иннервируемых пересекаются нервы, может сильно искажать результаты оценки измененных механических порога.

Возможные изменения

Другие виды перевязки может быть дополнительным с точки зрения изучения патологических состояний боли после травмы периферических нервов, таких как хронические травмы сужение [5] или частичной перевязке нервов [6]. Каждый экспериментальных результатов процедуры в различных фенотипические изменения, которые должны быть рассмотрены до послеоперационного тестирования.

Кроме того, в других сенсорных тестов, таких как тепловой гипералгезии может быть применен [7], хотя этот фенотип менее надежные следующие SNI.

Будущие приложения

Этот метод может быть использован для тестирования лекарств изменяя развития или поддержания механической аллодиния [8]. Анализ седалищного нерва, спинной ганглий корня (DRG) и / или поясничного спинного мозга позволяют исследование молекулярных механизмов, ответственных за индуцированного фенотипа.

Эксперименты на животных проводили в соответствии с надлежащей лабораторной практики в полное соответствие с датскими и европейскими нормами. Все эксперименты были одобрены датский эксперименты на животных, инспекция при Министерстве юстиции (разрешения числа 2006/561-1206).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Анестезия: Кетамин и Ксилазин	Скальпель
Офтальмология мазь	Пинцет номер тел. 2
Электробритва	Пинцет номер тел. 5
Перчатки	Ножницы для вскрытия тупой
70% (об. / об) этанол	Micro ножницы
Ваты почки / Взгляд	6,0 Prolene, не рассасывающиеся нити
Стерео микроскоп	2 держателя х иглы
Скотч	Тепло площадку
фон Фрей нитей (0,02 - 2,0 г для мышей) (Stoelting)