研究のための気管支肺胞洗浄（BAL）、適切なサンプル利回りの取得

要約

我々は低圧吸引を使用して気管支鏡検査および気管支肺胞洗浄のための研究手法を説明します。技術が肺の気管支表面から免疫細胞を採取するために使用される。局所麻酔薬と軽度の意識下鎮静（ミダゾラム）が使用されます。被験者はよく手順を容認し、最小限の副作用を経験する。

要約

私たちは、粘膜表面から付着していない細胞と肺の被覆液を除去するために、手動ハンドヘルド吸引を使用して、気管支肺胞洗浄（BAL）と気管支鏡検査のための研究手法を説明します。研究環境において、BALは肺内の先天性（肺マクロファージ）のサンプリングは、細胞（B-及びT-細胞）、および体液性（免疫グロブリン）の応答を可能にする。

BALは、国際的に研究目的のために受け入れられ、1999年以来、技術が私たちのグループが、英国とマラウィで>千被験者で行われている。

我々の技術は、点眼液の穏やかな手持ち式吸引を使用し、これは、返されたBAL容積を最大にし、繊毛上皮に最小剪断力を加えるように設計されてBAL液内の細胞の構造および機能を維持すると成長を促進するために生存率を維持するためにex vivoで培養中の細胞の。研究手法は、それゆえ、より大きなボリュームインを使用していますtillate（典型的には200mlを順に）と細胞損傷を低減する手動吸引を使用する。

患者は、局所麻酔薬を与えられた意識下鎮静（ミダゾラム）を提供し、最小限の副作用でよく手順を容認されています。口頭および書面による被写体情報の耐性を向上させ、書面でのインフォームドコンセントは必須です。被検者の安全性が最も重要です。被験者は慎重に明確な基準および除外基準を使用して選択されます。

このプロトコルは、潜在的なリスクの説明、およびそれらを軽減するために行われるステップ、禁忌のリスト、前後の手続きのチェックだけでなく、正確な気管支鏡検査および検査技術を含む。

概要

背景

気管支鏡検査は、臨床実践のために開発された、それは広く、両方の診断と治療に^1,2使用されています。気管支肺胞洗浄（BAL）は、非接着細胞および粘膜表面からの肺被覆液を除去し、生検粘膜および粘膜下組織をサンプリングするために使用される。研究環境において、BALは、先天性のサンプリングを可能にする（肺マクロファージ^3-5）肺内、（B-及びT-細胞^6）細胞性および体液性（免疫グロブリン^7）応答。

BALは、国際的に研究目的の⁸のために受け入れられ、1999年以来、技術が私たちのグループが、英国とマラウイの>千の被験者に行われている。我々は実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ^9,17、バイオマス煙^5、HIVや予防接種、および補助的治療STUを含む肺炎球菌抗原に対する、先天的な細胞、および体液性免疫応答の研究にこの手法を使用肺炎からの回復に死ぬ。我々の技術は、点滴液の穏やかな手持ち式吸引を使用し、これは、返されたBAL容積を最大にし、BAL液内の細胞の構造および機能を維持するために繊毛上皮の最小剪断力を適用するように設計されている。

研究のコンテキストでは、BALは、診断や治療上の利益を得ることを目指している呼吸器や集中治療室の医師（しばしば呼ばれる気管支洗浄、洗浄液、洗浄、またはBAL）が実践とは異なる技術を利用する。研究技術は、細胞を採取し、ex vivoで培養中の細胞の増殖を促進するために生存能力を維持するように設計されている。これらの理由のための研究手法は、（典型的には200mlを順に）大きな体積の点滴を使用し、細胞の損傷を減少させるために手動吸引を使用する。患者は、局所麻酔薬、提供される意識下鎮静（ミダゾラム）を与えられ、最小限の副作用でよく手順を容認している。口頭および書面による主観T情報は、許容度を改善し、書面でのインフォームドコンセントは¹必須です。

目標

全体的な目標は、手順が安全かつ有効であることがある。被験者は、いずれかの生理学的障害を経験してはならず、事業者は、一貫して被験者からのBALの100ミリリットルを超える収集する必要があります。手順の後、被験体は、最小限の副作用を経験するべきである。

安全

被検者の安全性が最も重要です。被験者は慎重に明確な基準および除外基準を使用して選択されます。このプロトコルは、潜在的なリスクや、それらを軽減するためにとった措置の説明が含まれています。

研究気管支鏡検査の禁忌は、絶対または相対として表現することができ、排除と包含の基準としての治験実施計画書に含まれています。私たちの被験者はすべてのフル健康を確保するためにスクリーニングされる。

絶対禁忌不安定頸椎、無反応低酸素症、不安定狭心症、出血性素因、悪性不整脈が含まれています。

増加合併症率に関連した条件を含む相対的禁忌は、次のとおりです。

一般：悪い協同対象^1、重大な一般的な医学的問題の例：てんかん 、リドカインまたはミダゾラム、妊娠、栄養不足に対する副作用を知ら以前の悪い容認気管支鏡検査、。

呼吸器：、高炭酸ガス血症、不安定な喘息^1、著しく損なわ呼吸機能^1（FEV ₁ <1リットル）、肺高血圧症の低酸素症[空気<94パーセント上の彩度（SATS）]。

心血管：尿毒症、心筋梗塞^1、 上大静脈閉塞の 6週間以内

その他：免疫抑制（当社グループは、定期的にこのproceを行い、HIV陽性の被験者でdure）。

研究のためにBALに伴うリスク- 表1を参照してください。

プロトコル

1。被験者は、呼吸器の研究看護師が到着時に満たされている

1. 対象は固形食と明確な流体¹のための2時間> 4時間絶食されています。
2. 手順は、（標準的な病院のポリシーに従って）適切な前後の手続きのチェックで一日のケースのように行われている。
3. 被験者は、病院のガウンを着ています。
4. 小さ ​​なゲージのカニューレは、（理想的には左手に）挿入され、後の手続きの回復期間¹が終了するまでその場に残っている。
5. 観察前処置がとられる（血圧、心拍数、酸素飽和度[SATS]）。
6. 対象は気管支鏡検査スイートに転送されます。

2。被写体が気管支鏡検査の経験が呼吸器研究の臨床医によってSuiteの処置のために準備されている

1. 3誘導心電図、パルスオキシメータ^1,10および血圧計、監視装置を含めて取り付けられている。 AnesthetICサポートは、書面によるインフォームドコンセントなど、必要とされていません。
2. 酸素は> ^90％1 SATSを達成するために、最大4 L /分で鼻カニューレを介して送達されてもよい。
3. オペレータは、これは、滅菌生理食塩水を吸引することにより、効果的な吸引力を確保することが含まれ、気管支鏡をチェックします。
4. リドカインと局所麻酔（キシロカインを使用）（Instillagel ^1を使用して）、鼻腔と口腔粘膜で達成される
5. 鎮静は、適切な被験者から要求されている場合、静脈内ミダゾラムは^、1投与される。適切な逆転エージェント（フルマゼニル）は、すぐに使用可能です。
6. 蘇生装置は^1,10容易に利用可能である必要があります。

3。気管支鏡を挿入して配置されている

1. 挿管は経鼻通常。これが原因で鼻ポリープ、炎症を起こした鼻甲介、または任意の不快感にできない場合は、被写体が口から挿管されている（口ガードを防止するのに使用されているスコープまたは被験者の歯の損傷）。
2. 喉頭での局所麻酔た。通常は4-6 mLの合計が使用され、4％リドカインを使用して完成する。一般的にこれは点滴で咳が発生します。
3. 声帯を通過し、さらに粘膜麻酔は右下葉（RLL）と右中葉（RML）の一部門で、かつ、RMLの入り口に、カリーナで2％リドカイン2mlのアリコートを使用しています。
4. 気管支鏡は、吸引が（ 'ウィンクテスト'吸引ボタンを使用して適用されたときに気道が崩壊するように、それが安全な位置にあると十分に遠位が、あまりにも遠位ない位置で、理想的に内側区域において、RML内に配置されている）。
5. 良い位置決めが完全に気管支鏡検査、すぐに穏やかな吸引で完全に閉じない気道によって所定の位置に保持することができる気管支鏡でウインクテスト中に示されている。

4。 BALが実行される

1. 四60ミリリットルの注射器は、事前です60ミリリットル、50ミリリットル、50ミリリットル、連続注射器内の40ミリリットル - 温め生理食塩水で満たされた。件名と気管支鏡検査の準備が整ったら気管支鏡検査は、RMLの位置を維持しながら、生理食塩水の最初の注射器は気管支鏡アシスタントで点眼しています。
2. 手で穏やかに吸引が同じポートと50ミリリットル注射器を使用アシスタントperformed is。
3. この手順は、次いで、我々の具体的な手法で用い200mlを最大容量で、さらに3回繰り返す。
4. 検索されたBAL液は、すでに溶融氷上に保持した容器にゆっくりと放出される。ガラス容器は、細胞の付着を阻害し、細胞のリターンを最大化するためにpresiliconizedてもよい。
5. BAL液は、界面活性剤によって形成される表面シャボン玉と光に対してかすん表示されます。
6. 気管支鏡をゆっくりと完全に引き出される。
7. BAL液は、即時処理のために氷上で遅滞なく輸送される。

5。件名の回復

1. 被験者は、病棟での呼吸の研究看護師が2〜4時間、回収される。
2. この時間の間に、彼らは（彼らのツバメが安全であると評価されている場合）手順の後に、順番に誤嚥のリスクを軽減休息してからだけ食べて、> 60の分^1を飲むことを許可されています。
3. 処置後の観察は監視され、記録されている。臨床検査は、退院前に発生します。
4. 被験者は、一般的な副作用（発熱、軽度の右乳腺下胸部不快感、のどの痛み）についての予備放電を説明を受け、重大な副作用は^1を発生した場合の連絡先の電話番号が与えられる。
5. 被写体が続くアップされている1-5日後の手順で臨床接点と。これは電話で、または個人のいずれであってもよい。

6。細胞は、研究室で単離される - 溶ける氷の上で実行可能な場合は

1. BAL液の容積を、無菌ガーゼ綿棒の二重層を通して記録し、濾過し予備冷却し、50mlの滅菌遠心管に粘液栓を除去した。
2. 細胞を5〜10分間、4℃で500×gの遠心分離によってペレット化し、50mlの冷生理食塩水をボルテックスすることにより洗浄する。遠心分離を1回繰り返す。
3. 細胞（RPMI-1640 + 10％ウシ胎児血清+ 2mMのL-グルタミン+ペニシリン[40 IU / mlの]、ストレプトマイシン[75 IU / mlの]、およびアンホテリシンB [0.5 IU / mlの]）と培養培地中に再懸濁する差動計数をトリパンブルーの等しい容積と血球計数器を用いて行う。
4. 細胞懸濁液は、適切な組織培養プレートにピペッティングにより導入、（我々が1×10 ⁶細胞/ mlを使用）、およびマクロファージ付着を可能にする3時間37℃でインキュベートし、必要な濃度に正規化される。ウェル当たりこの細胞懸濁液1mlを24ウェル培養プレートに適している。
5. リンパ作業のため、インキュベーションの3時間後に、培養培地を穏やかに上下に3回ピペッティングし、そして回収される。この培地は、リンパ球を含有する非付着及びマクロファージおよびリンパ球機能を評価するために使用することができ、それは、マクロファージを除去するためにCD14磁性ビーズで、例えば精製工程でも使用することができる。
6. マクロファージの仕事のため、インキュベーションの3時間後に、培地を慎重に最小限のピペットで除去し、抗生物質を含まない新鮮な温かい培地（RPMI 1640 + 10％ウシ胎児血清+ 2mMのL-グルタミン）で置き換えた。マクロファージは（ 図1参照）組織培養プレートに接着性である。

結果

良好な臨床結果が100以上ミリリットルのBAL量と最大で経験している対象、マイナーな不快感（ 表1参照）である。これはリラックスして協力対象を必要とします。臨床医は、（ 材料 ）に完全に準備された自信がある、と理解ボランティアに向けなければなりません。

（差分カウント数を含む）の細胞収率の間および体内ばらつきが記載されている。健康な被験者からの差分細胞数は、典型的には> 90％好中球数の少ないマクロファージ（<2％）およびリンパ球（5〜10％）である。顕微鏡スライド上に遠心分離したBAL細胞は、この情報（ 図1）を得るために、差動核染色で染色することができる。 図1において、BAL細胞を固定し、製造業者の指示に従ってヘマカラー染色を用いて染色されている。少なくとも300細胞がマクロファージ信頼できる結果を得るためにカウントする必要があり、好中球やリンパ球、稀な細胞型のための500個の細胞。

危険	リスク	：によってこのプロトコルで減少
気管支鏡検査およびBAL 1、14 の効果
軽度の不快感	<25％14、＃	適切な鎮痛と鎮静。 被写体までの自信と思いやりのあるアプローチ。
鼻出血	<1％＃	唯一鼻挿管のための穏やかな圧力。 経口挿管代わり​​に - 主題不快感や狭く開口ます。
気管支内出血（喀血）	<0.1％* 15	いいえ検は行われません。 気管支鏡検査時の慎重な制御 - 呼吸器粘膜を回避することができる。
のNAUEA、嘔吐と誤嚥性肺炎	<0.02％14、＃	固形食> 4時間の前処置1絶食。 適切な局所麻酔。 処置中に半横臥位。 注意深い後手順観測。
発熱	0.01 百分の14から 1までの＃16	炎症に関連し、BALの最大のコレクションによって最小化することができる。 単一の葉BALのみ。＃
痛み、鼻/喉嗄声	<25％14、＃	鼻、喉、喉頭（咳を最小化する）のに十分な局所麻酔。
感染	<負のHIVの0.1％、 HIV陽性14、＃の1％	標準気管支鏡の洗浄手順1。 単一の葉BAL。＃ 感染の早期発見：1時間のANの中、臨床検査1-5日気管支鏡検査後にD臨床接触。
胸痛/咳	<0.2％14、＃	単一の葉BAL。最大のBALコレクション。＃
薬の効果：リドカイン、ミダゾラム
不整脈	*非常にまれ	5ミリグラムの最大値が使用/ 14リドカインキロ。 点眼し、生理食塩水を温めた。＃ パルス酸素（酸素補給で> 90％SATS）、手順全体を通して心臓モニタリング。 ベンゾジアゼピン拮抗薬（フルマゼニル）すぐに利用可能。
見当識障害/攪拌しながら	<0.1％† 番号
カーディオ呼吸抑制	*非常にまれ

* 1,500以上の研究の手順で、当社グループで経験していない。

†Idiosむしろ用量依存的反応よりyncratic。

＃1500以上の研究手続きにおける当社グループの経験。

表1。研究のためにBALに関連するリスク 。これは、ハザードリスクを含み、これが説明する手法を用いて低減される方法。気管支鏡検査/ BAL、また使用される任意の医薬薬剤の効果の影響が含まれる。

図1。 BALマクロファージと時折好中球を表示顕微鏡スライド 。 BAL細胞をメタノールで固定し、ヘマカラーレッド（エオシンY）、青（アズールB）で染色されている。

ディスカッション

良い結果を達成するために、以下が役に立ちます。

1. 舌と後咽頭のベースが得意anesthetisation。それは、被験者の手続きトレランスと、全体的な快適さを向上させるため、これは重要です。
2. 小児（外径3.4〜3.6ミリメートル）又は成体気管支鏡（外径4.8〜5.9ミリメートル）のいずれかを使用することができる。
3. 経鼻挿管時に不快感がある場合には、経口挿管が好ましい。一般的に、鼻挿管は簡単な技術であるか、または放棄されるべきである。
4. 中咽頭にリドカインの最初の点眼後、被験者は、気管支鏡を経口挿入されている場合は特に、麻酔の開始保留中取り下げられた気管支鏡を好むかもしれません。
5. 少なくとも10×10ミリリットル注射器はリドカインのみ2〜4ミリリットルをあらかじめ充填されていることを確認してください。空気がコードや気管支粘膜に直接麻酔の改善された送達を可能にする注射器内に残されるべきであるSA。
6. BALの収率を有意に減少させる手順の間に咳をするので、温めた生理食塩水を用いて、良好な粘膜麻酔を有し、これを低減するために重要である。
7. 50ミリリットルの注射器を温め、生理食塩水であらかじめ入力されている必要があります。これは、デッドスペースの損失と端末気道に実行して、残りのために10〜20ミリリットルを得るために通常の生理食塩水点滴注入の最初の50ミリリットルのが一般的である。さらに一定分量は、流体の大部分を返す。
8. オペレーターは常に無菌生理食塩水を吸引することにより効果的な吸引力を確保するなど、事前の挿管に気管支鏡をチェックする必要があります。吸引の損失は、一般的に気管支鏡や吸引装置との接続の周りのチューブやリークのねじれに起因する発生する可能性があります。
9. 手動吸引時、理想的に気道が崩壊しないようにしてください。吸引再帰的に気道を崩壊した場合は、BALリターンは弁機構に還元され、局所の炎症や出血が可能性が高いされています。これは、順番に気道メートルになります鉱石過敏や咳可能性が高い。最も適切なRML亜区域枝を選択し、低吸引圧を使用することが重要商標です。
10. 空気が常に吸引されたときに気管支鏡への注射器の接続および遠位気道における気管支鏡の位置を再確認。これは再発性の問題である場合には、後手順気管支鏡自体に穴がないことを確認してください。
11. 喫煙者からのBALは、多くの場合、暗い、細胞内の微粒子の存在によるものである。喫煙者はあまり気管支鏡検査に耐えてよく、咳を増加している。
12. 好ましいBAL容積収率は> 100 mlである。 > 150 mLの収率が優れている。我々は> 170ミリリットル任意の収量を経験していない。細胞収量およびBALボリューム収量の間には直線的関係はありません。
13. <100ミリリットルの収率は、我々の経験では、このような咳、胸痛や発熱などの副作用を引き起こす可能性が高くなります。我々は、<100の収率を有する被験者はRECOことマイシンというアドバイス左側臥位でベレット、これは残りの肺液の排出を助けることができる。
14. 臨床接触は副作用のないことを確認するために1-5日以内に以下を行う必要があります。
15. ミダゾラム鎮静は、英国での被験者の50％とマラウイの<​​5％<使用されます。ミダゾラムは直接忍容性を向上させるためには表示されません。いくつかの事業者は、鎮静、時には対象とコヒーレント（および安心感を与える）の対話を維持するのに逆効果であることを感じる。
16. 我々の経験では、この技術の重要な学習曲線があります。例えば、医師または看護師間の調整には時間がかかり、収率は学習プロセスの開始時にしばしば低い。
17. HIV陽性の被験者では、予防的に抗生物質prebronchoscopyを使用しています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material	Company	Catalogue Number	Comments
Fibreoptic bronchoscope, light and suction source	unspecified
Surgical gown, sterile gloves	unspecified
Sphygnomanometer	unspecified		For continuous patient monitoring
Pulse oximeter	unspecified		For continuous patient monitoring
3 lead ECG monitor	unspecified		For continuous patient monitoring
Nasal oxygen delivery 2-4l/min	unspecified
Lidocaine 10% spray (Xylocaine)	AstraZeneca		For topical anaesthesia
Lidocaine hydrochloride 2%	unspecified		For topical anaesthesia
Lidocaine gel (Instillagel)	Farco-Pharma, Germany		Alternative products available from other suppliers
Normal saline, sterile 200ml	unspecified		Warm to 30oC
10ml taper-end syringe (x10)	unspecified		For administration of lidocaine
Intravenous cannula 18G	unspecified		For administration of midazolam
Midazolam	unspecified		For sedation
Flumazenil	unspecified		Reversal of benzodiazepine sedation (emergency use only)
60ml taper-end syringes (x4)	unspecified		For normal saline injection and BAL fluid withdrawal. May require connector to attach to the injection port of the bronchoscope
Sterile gauze swab	Vernaid, UK		Alternative products available from other suppliers
Sterile container for BAL fluid	See text and comments		Siliconised glass bottles reduce macrophage adherence. Alternatively, 50ml centrifuge tubes may be used (total capacity 200ml)
Sigmacote	Sigma, UK	SL2	Only if siliconised glass bottles used. NB: Harmful and flammable. If used, follow precautions detailed in manufacturer’s MSDS
Centrifuge	unspecified		At least 4x50ml tube capacity. Refrigeration to 4oC preferred.
Shandon Cytospin centrifuge	Thermo Scientific, UK		For differential count only
RPMI 1640 medium with L-glutamine	Sigma, UK	R8758	Alternative products available from other suppliers
Fetal bovine serum	Sigma, UK	F6178	Alternative products available from other suppliers
Penicillin-Streptomycin	Sigma, UK	P4333	Alternative products available from other suppliers
Amphotericin B	Sigma, UK	A2942	Alternative products available from other suppliers
Tissue culture plates	Greiner Bio-One, UK	662160	Alternative products available from other suppliers
Glass microscope slides	unspecified		For differential count only
Shandon cytofunnel	Thermo Scientific, UK	A78710003	For differential count only
Shandon cytoclip	Thermo Scientific, UK	59910052	For differential count only
Hemacolor staining set (fixative, red and blue reagents)	Merck, Germany	111661	Use according to manufacturer’s instructions