연구를위한 기관지 폐포 세척액 (BAL), 적절한 샘플 수익률을 얻기

요약

우리는 낮은 압력 흡입을 이용하여 광섬유 기관지 내시경과 기관지 폐포 세척액에 대한 연구 방법을 설명합니다. 기법은 폐 기관지 표면에서 면역 세포를 수확하기 위해 사용된다. 국소 마취제와 가벼운 수면 마취 (미다 졸람)이 사용된다. 주제는 프로 시저 잘 경험 최소한의 부작용을 견딜.

초록

우리는 점막 표면에서 비 접착 세포와 폐 라이닝 유체를 제거하기 위해 수동 소형 흡입을 사용하여 기관지 폐포 세척액 (BAL)와 광섬유 기관지 내시경에 대한 연구 방법을 설명합니다. 연구 환경에서는 BAL은 폐 내의 선천적 (폐 식세포)의 샘플링, 셀룰러 (B-및 T-세포) 및 체액 (면역 글로불린) 응답을 허용한다.

BAL은 국제적으로 연구 목적으로 허용되며, 1999 년부터이 기술은 우리의 그룹에 의해 영국과 말라위에서> 1,000 과목에서 수행되었습니다.

우리의 기술은 점안 유체의 완만 한 휴대용 흡인을 사용하며, 이는 BAL 볼륨 반품 최대화하고 BAL 유체 내에서 세포의 구조와 기능을 유지하고 성장을 촉진하기 위하여 생존을 유지하기 위해 섬모 상피 조직에 최소 전단력을 적용하도록 설계 체외 배양 세포의. 연구 기술은 따라서 더 큰 볼륨 기능을 사용tillate (일반적으로 200 ㎖의 순서로) 및 세포 손상을 줄이기 위해 수동 흡착을 이용한다.

환자는 국소 마취를 부여 수면 마취 (미다 졸람)을 제공하고, 최소한의 부작용과 잘 절차를 허용하고 있습니다. 구두 및 서면 대상 정보는 내성을 개선하고 서면 동의서는 필수입니다. 피사체의 안전이 가장 중요하다. 주제는 신중하게 명확 포함 및 제외 기준을 사용하여 선택됩니다.

이 프로토콜은 잠재적 위험의 설명 및 그것들을 완화하기 위해 취해지는 단계, 금기의리스트, 사전 및 사후 절차 검사뿐만 아니라, 정확한 기관지 및 실험 기술을 포함한다.

서문

배경

광섬유 기관지 내시경은 임상 실습을 위해 개발되었다 널리 모두 단적으로 및 치료 ^{1, 2를} 사용합니다. 기관지 폐포 세척액 (BAL)는 비 접착 세포와 점막 표면에서 폐 라이닝 유체를 제거하며 조직 검사는 점막과 점막하 조직을 샘플링하는 데 사용됩니다. 연구 환경에서, BAL은 폐 내에서, (폐의 대 식세포 ^3-5) 타고난 세포 (B-및 T-세포 ^6)의 샘플링 및 체액 성 (면역 글로불린 ⁷⁾ 응답을 할 수 있습니다.

BAL은 국제적으로 연구 목적으로 ^8을 위해 허용되며, 1999 년부터이 기술은 우리의 그룹에 의해 영국과 말라위에서> 1,000 과목에서 수행되었습니다. 우리는 실험적인 인간의 폐렴 구균 마차 ^9,17, 바이오 매스 연기 ^5, HIV 예방 접종 및 부속 치료 STU 등의 폐렴 구균 항원에, 타고난 세포 및 체액 성 면역 반응의 연구에서이 기술을 사용폐렴에서 회복에 죽는다. 우리의 기술은 점안 유체의 완만 한 휴대용 흡인을 사용하며, 이는 리턴 BAL 볼륨을 최대화하고 BAL 유체 내에서 세포의 구조와 기능을 유지하기 위해 섬모 상피 조직에 최소 전단력을 적용하도록 설계된다.

연구의 맥락에서 BAL 진단 또는 치료 효과를 얻기 위해 목표로 호흡기 및 집중 치료 의사 (종종 불리는 기관지 세척, 세척, 세척, 또는 BAL)에 의해 실행과는 다른 기술을 사용합니다. 연구 기법은 세포를 수확하고 생체 외 배양 세포의 성장을 촉진하기 위하여 생존력을 유지하도록 설계된다. 이러한 이유로 연구 기법은 (일반적으로 200 ㎖의 순으로) 더 큰 부피 instillate를 사용하며 세포 손상을 감소시키기 위해 수동 흡착을 이용한다. 환자는 국소 마취를 부여 수면 마취 (미다 졸람)을 제공하고, 최소한의 부작용과 잘 절차를 허용하고 있습니다. 구두 및 서면 subjecT 정보는 내성을 개선하고 서면 동의서는 ¹ 필수입니다.

골

전반적인 목표는 절차가 안전하고 효과적 일해야한다는 것입니다. 주제는 생리 장해를 발생하지 않습니다 및 운영자는 지속적으로 과목에서 BAL 100 ㎖를 초과 수집해야합니다. 시술 후, 주제는 최소한의 부작용을 경험해야합니다.

안전

피사체의 안전이 가장 중요하다. 주제는 신중하게 명확 포함 및 제외 기준을 사용하여 선택됩니다. 이 프로토콜은 잠재적 위험하고이를 완화하기 위해 취해지는 단계의 설명을 포함한다.

연구 기관 지경 금기는 절대 또는 상대 다음과 같이 표현 될 수있다, 배제 및 포함 조건으로 우리의 연구 프로토콜에 포함되어 있습니다. 우리의 주제는 모든 전체의 건강을 보장하기 위해 검사합니다.

절대 금기불안정 경추, 응답 저산소증, 불안 정형 협심증, 출혈 체질, 악성 부정맥이 (가) 있습니다.

증가 합병증 비율과 관련된 이러한 조건을 포함하여 상대적 금기 사항은 다음을 포함한다 :

일반 : 가난하게 협력 대상 ^1, 의미있는 일반적인 의료 문제, 예를 들면 간질, 리도카인 또는 미다 졸람, 임신, 영양 결핍에 대한 이상 반응 알려진 이전 저조한 용납 지경.

호흡기 :, 고탄 산혈증, 불안정한 천식 ^1, 크게 손상 호흡 기능 ¹ (FEV _{1 <1} L), 폐동맥 고혈압 저산소증 [공기 <94 %의 포화도 (SAT 성적)].

심장 혈관 : 요독증, 심근 경색 ^1, 우수한 대정 맥 폐쇄 후 6 주 이내.

기타 : 면역 억제 (우리 그룹은 정기적으로이 proce을 수행HIV 양성 과목에서 틀리면).

연구 BAL과 관련된 위험 - 표 1을 참조하십시오.

프로토콜

1. 주제는 호흡 연구 간호사에 의해 도착에 만족

1. 주제는 고체 음식과 맑은 액체 ¹ 2 시간> 4 시간 동안 금식을하고있다.
2. 절차는 (표준 병원 정책에 따라) 적절한 사전 및 사후 절차 검사와 함께 일 경우로 수행됩니다.
3. 주제는 병원 가운을 착용.
4. 작은 계기 정맥은 (이상적으로 왼쪽 손에) 삽입 시술 후 회복 기간 ^1이 끝날 때까지 현장에 남아있다.
5. 시술 전 관측이 수행된다 (혈압, 맥박, 산소 포화도 [SAT 성적]).
6. 피사체가 기관지 제품군에 전달된다.

2. 주제는 기관지에 경험 호흡기 임상 연구에 의해 스위트 룸에있는 절차에 대한 준비가되어 있습니다

1. 3 - 리드 ECG, 맥박 산소 측정기 ^1,10 및 혈압계, 모니터링 장비 등의 부착된다. AnesthetIC 지원은 서면 동의서를 포함하여 필요하지 않습니다.
2. 산소는> 90 % ¹ SAT 성적을 달성하기 위해, 최대 4 L / min으로 비강 캐뉼라를 통해 전달 될 ​​수있다.
3. 운영자는이 멸균 생리 식염수를 흡입하여 효과적인 흡입을 보장 포함, 기관 지경을 확인합니다.
4. 리도카인과 국소 마취 (xylocaine 사용) ^{(Instillagel를} 사용하여) 비강과 구강 점막에 달성
5. 진정 작용이 적절하고 피사체에 의해 요구되는 경우, 정맥 미다 졸람 ^1을 투여한다. 적절한 반전 에이전트 (플루 마제 닐은) 즉시 사용할 수 있습니다.
6. 소생 장비는 ^1,10 쉽게 사용할 수 있습니다.

3. 기관 지경을 삽입 위치

1. 삽관 법은 코를 통해 보통이다. 이 때문에 비강 폴립, 염증 비갑개 또는 불편 다음 피사체가 입을 통해 삽관되어 할 수없는 경우 (입 가드 방지하는 데 사용됩니다) 범위 나 대상의 치아에 손상 될 수 있습니다.
2. 후두에 국소 마취 보통 4-6 밀리리터의 전체가 사용되며, 4 % 리도카인을 사용하여 완성된다. 일반적으로이 점안에 기침의 원인이됩니다.
3. 성대가 전달되고 오른쪽 하엽과 오른쪽 중간 엽 (RML)의 부문과 RML 입구에, 분 기부에서 2 % 리도카인 2 ㎖ 분취 량을 사용하여 더 점막 마취.
4. 기관 지경은 흡인 ( '윙크 시험'흡인 버튼을 이용하여인가 될 때기도가 붕괴되도록 그것이 안전한 위치에 충분한 원위 그러나 너무 원위없는 위치에 이상적으로 내측 부분에서, RML 내에 위치 ).
5. 좋은 위치는 완전히 bronchoscopist 즉시 부드러운 흡입에 완전히 닫히지기도에 의해 위치에 유지 될 수있는 지경에 윙크 테스트 중에 표시됩니다.

4. BAL이 수행

1. 네 개의 60 ㎖를 주사기 사전입니다60 ㎖, 50 ㎖, 50 ㎖, 연속 주사기에 40 ㎖ - 가온 생리 식염수로 채워진. 제목과 bronchoscopist 준비가되면 bronchoscopist가 RML의 위치를​​ 유지하는 동안 식염수의 첫 번째 주사기는 기관지 조수에 의해 주입된다.
2. 부드러운 손 흡입 후, 같은 포트 및 50 ㎖ 주사기를 사용하여 보조에 의해 수행된다.
3. 이 절차는 다음 우리 고유의 기술로 사용되는 200 ㎖의 최대 양으로, 또한 3 회 반복된다.
4. 검색 BAL 유체는 이미 얼음이 녹는에 개최 라벨이 부착 된 용기에 부드럽게 배출된다. 유리 용기는 세포 부착을 억제하고 세포의 수익을 극대화하기 위해 presiliconized 할 수있다.
5. BAL 액이 계면 활성제에 의해 형성된 표면에 비누 거품과 빛에 대한 흐릿한 나타납니다.
6. 기관 지경 서서히 완전히 배출된다.
7. BAL 액은 즉시 처리를 위해 얼음에 지연없이 전송됩니다.

5. 제목 복구

1. 주제는 병동 호흡 연구 간호사에 의해 2 ~ 4 시간 동안 복구됩니다.
2. 이 시간 동안 그들이 (그들의 제비가 안전한 것으로 평가 될 때) 과정을 거친 후, 순서에 흡인의 위험을 감소 휴식 후 만 먹고> (60) 분 ^1을 마실 수 있습니다.
3. 포스트 절차 관측 모니터링 및 기록됩니다. 임상 검사는 배출하기 전에 발생합니다.
4. 피사체가 일반적인 부작용 (발열, 가벼운 바로 submammary 가슴 통증, 목의 통증)에 대한 프리 디스 브리핑 상당한 부작용 ¹ 발생할 경우 연락 번호 부여됩니다.
5. 피사체 추적 관찰 1 ~ 5 일 임상 접촉 후 절차에. 이 전화 나 사람이 될 수 있습니다.

6. 세포는 실험실에서 고립되어 - 녹는 얼음에 수행 가능한

1. BAL 유체의 부피는 멸균 거즈 면봉의 이중 층을 통해 기록 및 여과prechilled, 멸균 50 ML의 원심 분리기 튜브에 점액 플러그를 제거합니다.
2. 세포는 5 ~ 10 분 동안 4 ° C에서 500 XG에서 원심 분리하여 펠렛 및 50 ㎖의 차가운 생리 식염수에 소용돌이로 교반하여 세척한다. 원심 분리 한 번 반복된다.
3. 세포 (RPMI-1640 + 10 % 소 태아 혈청 + 2 밀리미터 L-글루타민 + 페니실린 [40 IU / ㎖], 스트렙토 마이신 [75 IU / ㎖] 및 암포 테리 신 B [0.5 IU / ㎖])와 문화 매체에 재현 탁된다 미분 계수 트리 판 블루의 동량과 혈구를 사용하여 수행 하였다.
4. 세포 현탁액은 적절한 조직 배양 접시에 피펫에 의해 도입, (우리가 1 × 10 ⁶ 세포 / ml 사용), 그리고 대식 세포의 부착을 허용하는 3 시간 동안 37 ° C에서 배양 필요한 밀도로 정규화됩니다. 웰 당이 세포 현탁액 1 ㎖를 24 - 웰 배양 플레이트에 적절하다.
5. 림프구 작업, 3 시간 배양 한 후, 배양 배지를 부드럽게 상하 3X 피펫 팅하고, 수집된다. 이 매체는 림프구를 포함및 비 접착 성 대 식세포 및 림프구 기능을 평가하기 위해 사용될 수 있으며, 또한 정제 단계에서 사용될 수있다 식세포를 제거하는 CD14 자기 비드 예.
6. 대식 작업, 배양 3 시간 후, 매체는 조심스럽게 최소한의 피펫으로 제거하고 항생제없이 신선한, 따뜻한 배지 (RPMI 1640 + 10 % 소 태아 혈청 + 2 밀리미터 L-글루타민)로 대체. 대 식세포는 (도 1 참조) 조직 배양 플레이트에 부착한다.

결과

좋은 임상 결과는 100 개 이상의 ML의 BAL 볼륨과 대부분에서 경험 한 주제, 불편 함 (표 1 참조)입니다. 이 편안하고 협력 대상을 필요로한다. 임상의, (재료) 만반의 준비를 확신하고 이해 자원 봉사쪽으로해야합니다.

(미분 계수 포함) 세포 수율 간 및 내 주제의 변화를 설명하고있다. 건강한 과목에서 미분 세포 수는 일반적으로> 90 % 호중구의 작은 숫자와 대 식세포 (<2 %)와 림프구 (10 %)이다. 현미경 슬라이드에 원심 분리 BAL 세포는이 정보 (그림 1)을 얻었다 차등 핵 염색을 할 수 있습니다. 그림 1에서, BAL 세포를 고정하고 제조업체의 지침에 따라 Hemacolor 염색을 사용하여 염색되었습니다. 적어도 300 세포는 대 식세포에 대한 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 계산되어야호중구와 림프구, 희귀 한 종류의 세포 500 세포.

위험	위험	작성자 :이 프로토콜에 감소
기관지 및 BAL 1, 14의 효과
가벼운 불편	<25 % 14 #	적절한 마취 및 진정 작용. 주제에 대한 자신감과 돌보는 방법.
출혈	<1 % #	만 코 삽관 가벼운 압력. 만약 대상이 불편하거나 축소 조리개 - 경구 삽관 대신.
기관지 출혈 (객혈)	<는 0.1 % × 15	어떤 조직 검사도 수행하지 않습니다. 기관지 동안주의 깊은 관리 - 호흡기 점막을 피하는.
으로 NAUEA, 구토 및 흡인 성 폐렴	<0.02 % 14 #	단단한 음식> 4 시간의 시술 전 1 단식. 적절한 국소 마취. 절차를 수행하는 동안 Semirecumbent 위치. 조심 시술 후 관찰.
열	0.01 14~1% 번호 16	염증에 관한 것으로, BAL의 최대 수집을 최소화 할 수 있습니다. 싱글 로브 BAL 만. #
아픈 코 / 목 및 쉰 목소리	<25 % 14 #	코, 목구멍과 후두 (기침을 최소화)의 적절한 국소 마취.
감염	<부정 HIV에 0.1 %, HIV 양성 14, # 1 %	표준 기관 지경 세척 절차 1. 싱글 로브 BAL 만. # 감염의 조기 인식 : 1 시간 내 임상 시험1-5일 기관지 D 후 임상 접촉.
가슴 통증 / 기침	<0.2 % 14 #	싱글 로브 BAL 만. 최대 BAL 수집. #
약물의 효과 : 리도카인, 미다 졸람
부정맥	* 매우 드문	5 MG의 최대 / 사용 14 리도카인을 kg. 주입 따뜻하게 생리 식염수. # 맥박 산소 (산소 보충과 SAT 성적은> 90 %), 절차 전반에 걸쳐 심장 모니터링. 벤조디아제핀 길항제 (플루 마제 닐) 바로 사용 가능합니다.
방향 감각 상실 / 교반	<0.1 % † 번호
심장 호흡 억제	* 매우 드문

* 1500 이상의 연구 과정에서 우리 그룹에 경험하지 않습니다.

† Idios오히려 용량 의존적으로 반응보다 yncratic.

# 1,500 연구 과정에서 우리 그룹의 경험.

표 1. 연구 BAL과 관련된 위험. 이것은 위험 또는 위험을 포함하고, 이는 설명 된 기술을 사용함으로써 감소되는 방법. 기관지 / BAL도 사용되는 의약 약물의 효과에 미치는 영향이 포함되어 있습니다.

그림 1. BAL 대 식세포 및 수시 호중구를 보여주는 현미경 슬라이드. BAL 세포는 메탄올에 고정 Hemacolor 레드 (에오신 Y), 청색 (하늘빛 B)로 염색되었다.

토론

양호한 결과를 달성하기 위해 다음과 같은 도움이된다 :

1. 혀와 구강 인두 후부의 기지에서 좋은 anesthetisation. 피사체의 절차 적 내성과 전체적인 편안함을 향상하기 때문에 중요하다.
2. 소아 (외부 직경 3.4-3.6 mm) 또는 성인 지경 (외부 직경 4.8-5.9 mm) 중 하나를 사용할 수 있습니다.
3. 비강 삽관시 불편 함이있는 경우, 경구 삽관 법이 바람직하다. 일반적으로 코 삽관 법은 간단한 방법 중 하나 또는 포기해야한다.
4. 구강 인두에 리도카인의 초기 점안 후, 피사체는 기관 지경은 경구로 삽입되는 경우에는 특히 마취 개시 보류 철회하는 기관 지경을 선호 할 수 있습니다.
5. 적어도 10 × 10 ㎖ 주사기는 리도카인의 만 2 ~ 4 ㎖로 채워져되어 있는지 확인합니다. 공기가 직접 코드와 기관지 점막에 마취의 개선 배달을 허용 주사기에 남아 있어야합니다사.
6. 절차를 수행하는 동안 기침 때문에 크게 BAL 수율을 줄여 따뜻하게 식염수를 사용하여 좋은 점막 마취이 감소하는 것이 중요하지.
7. 50 ㎖ 주사기 따뜻하게 식염수로 채워져 있어야합니다. 그것은 죽은 공간 손실과 터미널기도로 실행하는 나머지로 인해 10 ~ 20 사이의 ML을 산출하기 심어 생리 식염수의 첫 번째 50 ㎖ 일반적입니다. 또한 분주 유체의 더 큰 비율을 반환합니다.
8. 운전자는 항상 멸균 생리 식염수를 흡입하여 효과적인 흡입을 보장하는 등의 이전 삽관에 기관 지경을 확인해야합니다. 흡인의 손실은 일반적으로 인한 기관 지경 또는 흡입 장치와 연결 주변 튜브 또는 누출의 꼬임에 발생할 수있다.
9. 수동 흡입하는 동안, 이상적으로기도 붕괴하지 않아야합니다. 흡입 재발 하기도를 축소하는 경우, BAL 반환은 밸브기구로 감소, 지역 염증과 출혈이 더 가능성이있다 :이 차례로기도 m합니다광 과민성 기침 가능성이 높습니다. 가장 적절한 RML의 subsegmental 분기를 선택하고 낮은 흡입 압력을 사용하는 것이 중요 둘 수 있습니다.
10. 공기가 지속적으로 흡입되면 지경에 주사기의 연결도 원위기도에있는 기관 지경의 위치를​​ 다시 확인. 이 재발하는 문제의 경우, 시술 후 기관 지경 자체에 구멍이 있는지 확인하십시오.
11. 흡연자에서 BAL은 종종 인해 세포 내 입자의 존재에 어둡다. 흡연자가 덜 기관지 내시경을 허용, 증가 기침이있을 수 있습니다.
12. 바람직한 BAL 볼륨 수율은> 100 ㎖이다. > 150 밀리리터의 수율이 우수합니다. 우리는> 170 ㎖의 모든 수익률을 경험하지 않았습니다. 세포 수율 및 BAL 볼륨 수익률 사이에 선형 관계가 없습니다.
13. <100 ML의 수율, 우리의 경험에, 기침, 가슴 통증과 발열 등의 부작용을 초래할 가능성이 더 높습니다. 우리는 <100의 수율 과목 RECO 수 밀리리터하는 것이 바람직합니다왼쪽 측면 위치에 베 레드, 이것은 남아있는 폐 유체의 배수에 도움이 있습니다.
14. 임상 접촉은 부작용을 지키기 위하여 1 ~ 5 일 사이 대상으로해야한다.
15. 미다 졸람의 진정 작용은 영국의 과목의 50 %와 말라위에있는 <5 % <에 사용됩니다. 미다 졸람 직접 내약성을 개선하기 위해 표시되지 않습니다, 일부 사업자는 진정 작용이 때때로 주제와 일관성 (및 재 보증) 대화를 유지하는 역효과를 수 있다는 것을 생각합니다.
16. 우리의 경험에 의하면,이 기술에 상당한 학습 곡선이있다. 예를 들어 의사와 간호사 간의 조정은 시간이 걸리고 수익률은 학습 과정의 시작 부분에 종종 낮다.
17. HIV 긍정적 인 주제에, 우리는 예방 prebronchoscopy 항생제를 사용합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material	Company	Catalogue Number	Comments
Fibreoptic bronchoscope, light and suction source	unspecified
Surgical gown, sterile gloves	unspecified
Sphygnomanometer	unspecified		For continuous patient monitoring
Pulse oximeter	unspecified		For continuous patient monitoring
3 lead ECG monitor	unspecified		For continuous patient monitoring
Nasal oxygen delivery 2-4l/min	unspecified
Lidocaine 10% spray (Xylocaine)	AstraZeneca		For topical anaesthesia
Lidocaine hydrochloride 2%	unspecified		For topical anaesthesia
Lidocaine gel (Instillagel)	Farco-Pharma, Germany		Alternative products available from other suppliers
Normal saline, sterile 200ml	unspecified		Warm to 30oC
10ml taper-end syringe (x10)	unspecified		For administration of lidocaine
Intravenous cannula 18G	unspecified		For administration of midazolam
Midazolam	unspecified		For sedation
Flumazenil	unspecified		Reversal of benzodiazepine sedation (emergency use only)
60ml taper-end syringes (x4)	unspecified		For normal saline injection and BAL fluid withdrawal. May require connector to attach to the injection port of the bronchoscope
Sterile gauze swab	Vernaid, UK		Alternative products available from other suppliers
Sterile container for BAL fluid	See text and comments		Siliconised glass bottles reduce macrophage adherence. Alternatively, 50ml centrifuge tubes may be used (total capacity 200ml)
Sigmacote	Sigma, UK	SL2	Only if siliconised glass bottles used. NB: Harmful and flammable. If used, follow precautions detailed in manufacturer’s MSDS
Centrifuge	unspecified		At least 4x50ml tube capacity. Refrigeration to 4oC preferred.
Shandon Cytospin centrifuge	Thermo Scientific, UK		For differential count only
RPMI 1640 medium with L-glutamine	Sigma, UK	R8758	Alternative products available from other suppliers
Fetal bovine serum	Sigma, UK	F6178	Alternative products available from other suppliers
Penicillin-Streptomycin	Sigma, UK	P4333	Alternative products available from other suppliers
Amphotericin B	Sigma, UK	A2942	Alternative products available from other suppliers
Tissue culture plates	Greiner Bio-One, UK	662160	Alternative products available from other suppliers
Glass microscope slides	unspecified		For differential count only
Shandon cytofunnel	Thermo Scientific, UK	A78710003	For differential count only
Shandon cytoclip	Thermo Scientific, UK	59910052	For differential count only
Hemacolor staining set (fixative, red and blue reagents)	Merck, Germany	111661	Use according to manufacturer’s instructions