単一平面照明モジュールと広視野顕微鏡用マイクロキャピラリーアプローチ

要約

単一平面照明顕微鏡法のためのモジュール（SPIM）を容易に反転広視野顕微鏡に適合し、3次元細胞培養に最適化されて記載されている。試料は、長方形のキャピラリー内に配置され、マイクロ流体システムを介して蛍光色素、薬剤または薬物は、少量で適用することができる。

要約

簡単に、反転広視野顕微鏡に適合し、3次元細胞培養に最適化されて記述されている光シートまたは単一平面照明顕微鏡（SPIM）のためのモジュール、例えば、多細胞腫瘍スフェロイド（MCTS）。 SPIM励起モジュールの形状や試料が顕微鏡の検出経路に垂直なシート光によって照らされるように光を偏向する。システムは、照明光シートの同期調整と同様に蛍光検出のために使用される対物レンズにより、試料（また、回転用マイクロキャピラリーアプローチによって、高度なバージョンで）保持するための長方形のキャピラリーを使用することを特徴とする蛍光色素、少量の薬剤または薬物の適用のためのマイクロ流体システムの適応による。このシステムを操作するためのプロトコルが与えられ、いくつかの技術的な詳細が報告されます。代表的な結果は、最大の（1）測定値を含む酸化剤の添加により細胞増殖抑制薬物（ドキソルビシン）と、分解生成物への部分的変換の遺伝的にコードされるグルタチオンセンサを使用することにより、（2）酸化還元測定を行い、（3）開始との阻害の際に細胞壊死のラベリングミトコンドリア呼吸鎖。既存のシステムと比較して現在のSPIMモジュールの違いおよび利点は、説明されています。

概要

十分に確立された方法（共焦点又は多光子レーザー走査顕微鏡^1-4、構造化照明顕微鏡^5,6）光シート又は単一平面照明顕微鏡（SPIM）に加えて、3D撮像^7,8の有益な方法であることが証明され^{、 9。}特に興味深いのは、創薬研究^10,11のためにますます使用されている3次元細胞培養、 たとえば、多細胞腫瘍球（MCTS）、への応用である。さらに、SPIMも長期暴露または反復測定値に低光用量のみ、この面が光に曝露されたサンプルの各平面を測定するためのので、サンプルの生存性を維持するために必要とされる優先的な方法である。アップ多数の面光線量和の記録時と試料^12を損傷することができるように、これは、各焦点面の検出のための試料全体が点灯している他の顕微鏡技術とは対照的である。

シート光顕微鏡またはSPIMは、シリンドリカルレンズを使用することによって、または励起用レーザビームを走査することにより、いずれかの観察光路（総説については参考文献8を参照）に直交する方向の試料の照射に基づいている。これは多くの場合、特別なサンプルチャンバ^13,14または行列を必要とし、 例えば、アガロース^7,15、特別な高コスト顕微鏡で実装。これらのシステムに代わるものとしてSPIMための比較的簡単な照明装置は開発され、従来の倒立顕微鏡^16（ 図1参照）に適合。約100μmの被写界深度を超える6-10ミクロンの厚さのシート光には、8mmの直径に拡張し、シリンドリカルレンズ（0.08：50ミリメートル、開口数、焦点距離）により集光されたレーザ光から構成され。サンプルは、顕微鏡対物レンズのlenの前方に配置600-900ミクロンの内径の長方形のキャピラリーに配置されている蛍光検出のための。これらの主な機能は、現在完了して保持するための蛍光検出（同一の光路に使用される（軸方向）のサンプル、照明光シートの同期調整と、対物レンズを回転させるための高度なマイクロキャピラリーアプローチを使用することによって最適化されている変位の長さは、このように、必要な数量と費用を最小限に抑え、機械的な飼料の補正）、および蛍光色素、医薬品または薬物の適用のためのマイクロ流体システムの適応を必要とする。

プロトコル

1。細胞スフェロイドの成長とインキュベーション

1. 実験1：化学療法薬とインキュベートした細胞のスフェロイド
   1. （6プレートのために十分な）の30ml培地にアガロース物0.45gを添加することによって培養培地中で1.5％アガロースを準備する。
   2. 随時、それを攪拌しながら、ステップ1.1.1から少なくとも80℃まで混合物を加熱する。
   3. 96ウェルプレートの各ウェルにステップ1.1.2からの加熱混合液50μlを記入し、それが1〜2時間以内に固化してみましょう。使用するまで5℃で冷蔵庫に閉じられ、覆われたプレートを保管してください。
   4. ハム10％ウシ胎児血清（FCS）を補充したF-12培地と1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で調製し、96ウェルプレートの各ウェル中150 MCF-7乳癌細胞についてのシード。
   5. 5％のCO _2、37℃のインキュベーター中で約200〜300ミクロンの直径まで5-7日間スフェロイドを育てる76; C。
   6. 5％のCO _2、37℃のインキュベーター中で2μMおよび（培養液中の）8μMの範囲の濃度で6時間、アントラサイクリン系抗生物質塩酸ドキソルビシンによる細胞スフェロイドを培養する。
   7. 前顕微鏡に培養液またはアールの平衡塩類溶液（EBSS）を有する細胞スフェロイドを洗ってください。
2. 実験2：酸化還元センサーを発現しているスフェロイドにおける酸化プロセス
   1. 永久にDMEM中で96ウェルプレートのアガロースゲルでコーティングされたウェル（ス​​テップ1.1.1-1.1.3に記載された手順）でグルタチオン敏感な緑色蛍光レドックスセンサーGrx1-roGFP2でトランスフェクトした400 U251-MG-L106神経膠芽腫細胞についての種子10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよびハイグロマイシンB（150μgの/ ml）を補充した培地。
   2. 5％のCO _2、37℃のインキュベーター内で約200〜300ミクロンの直径まで5-7日間スフェロイドを育てる。
   3. 10＆＃を追加します。181は、100 mMのストック溶液を作成するために990μlの再蒸留水に過酸化水素水（purum年率、≥30％）のlは12時間以内に使用する。
   4. 右の実験前にEBSS中、50μMのステップ1.2.3から原液を希釈する。
   5. レドックスセンサーの酸化のためEBSS中50μMの過酸化水素と、測定中にマイクロ流体システムを介して細胞スフェロイドを培養する。
3. 実験3：開始およびスフェロイド内の細胞壊死のラベリング
   1. 補充したDMEM培地中で96ウェルプレートのアガロースゲルでコーティングされたウェル中の種子約400細胞（ 例えば、U251-MG-L106-Grx1-roGFP2の神経膠芽腫細胞）（手順のステップで説明1.1.1-1.1.3） 10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよびハイグロマイシンB（150 mg / mlで）。
   2. 5％のCO _2、37℃のインキュベーター内で約200〜300ミクロンの直径まで5-7日間スフェロイドを育てる。
   3. 細胞をインキュベート細胞壊死を誘導する培地中の1μMの濃度で3時間、ミトコンドリア電子伝達阻害剤であるロテノンでスフェロイド。さらに、壊死細胞を標識するための1mlの培養培地中で1μlの濃度で3時間、緑傷害性色素と共インキュベートする。
   4. 前顕微鏡に培養培地またはEBSSを用いて細胞スフェロイドを洗ってください。

2ライトシート調整

注：最良の結果を達成するためには、シート光のビームウエストは、対物レンズの焦点面にあることを保証しなければならない。ビームウェストの位置は、（ - 2.8手順2.5を参​​照）、キャピラリーに対して垂直な位置にシート光を観察することによって整列させることができる。

1. 文献に記載されているように、倒立顕微鏡を使用し、SPIMの励起モジュールをマウントします。 16、位置決めテーブルのベースプレートに（ 図1Aを参照）。
2. 1と顕微鏡を装備0X / 0.3または20X / 0.5顕微鏡対物レンズや顕微鏡の検出経路の適切なロングパスフィルタ（ 例えば、λ≥515 nm）を。
3. 顕微鏡の検出ポートに統合するカメラをマウントします。
4. 優先的に470nmの励起波長でレーザーまたはレーザーダイオードを並列にコリメートされたビームを使用し、SPIMモジュールに適用する。
5. シート光のビームウエストの軸調整のための垂直位置に光シートを転送する、90度の円柱レンズを回転させます。
6. サンプルホルダー内の蛍光色素で液体を含むキャピラリーを置きます。
7. 顕微鏡の位置決めテーブルに毛細管で試料ホルダーを取り付け、それを中心とし、シート光のビームウエストにフォーカスがあるされるように、キャピラリの位置を合わせる。
8. シリンドリカルレンズ自体の軸方向の位置の変化によってビームウエストを調整します。広告の後にレンズを引き返すjustment。

3セルスフェロイドアプリケーションおよび顕微鏡フィードの同期

1. 600ミクロン×600ミクロンの内側断面および120μmの壁の厚さとは別に、または長方形のホウケイ酸ガラスキャピラリー¹⁶内のグループにおける細胞スフェロイドを置きます。細胞スフェロイドの適用のための2つの技術が成功することが証明されている。
   1. 親指と中指で直立空のキャピラリーを取り、あなたの人差し指で上部開口を密閉する。その周囲の液体（EBSSまたは培地）における細胞スフェロイドの下部開口の近くを持参してください。上部の開口部から人差し指を離します。その中の細胞スフェロイドを持つ液体は毛管力によって、すぐに浸されます。キャピラリーのそれぞれの直立した状態で重力により充填キャピラリー内の回転楕円体の位置を調整します。
   2. 代わりに、ピペッティングを経由して毛細血管への細胞スフェロイドを適用します。介護THAしてくださいピペットの先端の開口トン毛細管の内径の大きさ一方、以下、一方では、スフェロイドの大きさのために十分な大きさと。
2. 顕微鏡検査のための特別なサンプルホルダーに、その中に回転楕円体と毛細血管を配置します。
3. 顕微鏡の位置決めテーブルに毛細管とサンプルホルダーを取り付け、それを中心にして集中していることをこのような細胞回転楕円体の位置を合わせる。
4. 光学シート及び反射ミラーの位置と、シリンドリカルレンズを調整することにより、検出経路における顕微鏡対物レンズの焦点面との間のマッチングを設定し（ 図1Bの調整ねじを参照）。
5. マイクロメータねじを調整して屈折率及びfishtank効果を補償する対物レンズの開口数に応じて（ 図1Bを参照）。
   注：異なる屈折サンプルのインデックスとtを取り巻くメディア彼対物レンズは、対物レンズのシフトと焦点面のずれの差につながる。光シートは、対物レンズタレットによって移動されるので、光シート（対物レンズのシフトに相当）のシフトと焦点面の移動との間の不一致は、レバーアーム（ 図1Bを参照）によって補償される。マイクロメータねじは、対物レンズの開口数および屈折指数に応じて光のシートのずれを調整するために、上下のピンの間の距離を適合させるために使用される。

単一平面照明の図1（A）倒立顕微鏡の位置決めテーブルのベースプレートに取り付けられた単一平面照明モジュールの写真、（B）設定モジュールと焦点面と照射面との間のリフティングミスマッチ（fishtank効果）を補正する顕微鏡フィードの同期化。 Δzは_oは焦点面のずれや光シート_F対物レンズとΔzはのずれを示しています。インレーは毛細血管を含む回転楕円体の断面を示している。左：長方形のキャピラリー600ミクロン（壁120ミクロン）の内径。右：回転のために使用されるセットアップ。インナーラウンドキャピラリー（内径400μmの外径550μm）を、外側の長方形のキャピラリー内で回転させる。つの毛管との間の空間が液浸流体で満たされている。

動的液体環境での4。測定

注：前のプロトコルは、前の細胞スフェロイドが以前にインキュベートし、次いで、単純な重力によってキャピラリー内で所定の位置に保持された測定値に静的インキュベーションのために使用される。さらにfixatiを必要としない上。ただし、動的インキュベーションとは、したがって、動的な環境を取り込み動態を測定することが望ましいメディアを流れる中の測定のために、人は、このサブプロトコルを達成することができます。 4.5から4.9のサンプルに達する気泡を避けるために重要である、ステップ。

1. 内側のガラス表面への細胞スフェロイドの後の細胞接着を支持するために30分間FCSでキャピラリーを満たす。
2. 枯渇毛細血管内の残りのFCSコーティングは、少なくとも12時間、完全に乾くしましょう​​。
3. ステップ3.2で説明したように、FCSコーティングされたキャピラリーへの細胞スフェロイドを紹介。
4. 回転楕円体の細胞接着を引き起こすために追加の2-4時間、5％CO _2、37℃のインキュベーター内毛細血管のままにしておきます。
5. マイクロ流体システムの流入部分を設定します（ 図2を参照）。蛍光染料、薬剤または薬剤を含む培地で：チューブ（0.89ミリメートル内径）の流入を埋めるために、蠕動ポンプを使用してください。
6. 接気泡トラップへのマイクロ流体システムの流入部CT（ 図2を参照）。
7. まず流入管に気泡のない毛細管をクランプした後、ドレーンチューブにキャピラリーの反対側をクランプします。
8. チューン所望の値（ 例えば、37℃）の水浴の液温。
9. 希望のポンプ速度に蠕動ポンプを調整し（ 例えば、流速：9μL/分;ポンプ速度をキャピラリー中：25ミリメートル/分）。
10. 、受信者（オープンループ設定）での圧送液体のいずれかを収集し、そのソース（クローズド·ループ設定）に戻すことを養うか、蠕動ポンプ（タイトクローズドループ·セットアップ）のチューブに直接供給されています

図2マイクロ流体セットアップ（オープンループとタイトなクローズドループ）;インレイ：SPHのイルミネーション倒立顕微鏡に接続された光シートベースの蛍光顕微鏡を用いたマイクロキャピラリー内eroid。

5。データ収集と解析

1. レーザパワーと画像取得のための積分時間を設定する。
2. ステップ5.1で定義されたパラメータは、ネイティブ細胞または蛍光色素でインキュベート以降に蛍光タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトした10〜20 J / cm ^2のために50〜100 J / cm ²程度の光線量値を超えないように注意してください（詳細は参考文献12を参照）光毒性を避ける。
3. 光シートの厚さは約10μmであるように3次元データ解析のために望ましい= 5〜10μmでΔzのにzスタックのための増分を設定します。
4. 細胞スフェロイド内の焦点面を変化させることによって、単一の画像またはz-スタックの測定を実行します。

結果

実験1：化学療法薬とインキュベートした細胞のスフェロイド

以前にインキュベートしたMCF-7細胞スフェロイド（8μMドキソルビシン、6時間）のzスタックスキャンは、図3に示されている。それは、細胞取り込みおよびドキソルビシン¹⁷の分布とその分解物^18,19に関する詳細な情報を提供します。内側の回転楕円体領域に分解生成物...

ディスカッション

現在の原稿は、光シートまたは3次元細胞システム用に最適化され、単一の平面照明顕微鏡（SPIM）デバイス、 例えば、多細胞腫瘍球（MCTS）について説明します。 3つの例示的な用途は、（1）細胞増殖抑制剤の取り込みおよび（化学療法剤の有効性への寄与はまだ評価されたまま）の分解生成物への部分的変換、遺伝的にコード化されたグルタチオンセンサの使用時によりレドックス状...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtiter plate	Orange Scientific	4430100	For cell spheroid growing
Agarose	Carl Roth GmbH	3810.1	For cell spheroid growing
MCF-7 cell line	CLS Cell Lines Service GmbH	300273	Cell line
U251-MG-L106 cell line			Cell line
DMEM	Biochrom AG (Merck Millipore)	FG0435	Culture medium
DMEM/Ham's F-12	Biochrom AG (Merck Millipore)	FG4815	Culture medium
FCS	Biochrom AG (Merck Millipore)	S0615	Cell culture supplement
Penicillin/streptomycin	Biochrom AG (Merck Millipore)	A 2213	Antibiotics
Hygromycin B	PAA Laboratories	P02-015	Antibiotic
EBSS	Sigma-Aldrich Inc.	E3024	Cell culture supplement
Doxorubicin	Sigma-Aldrich Inc.	D1515	Fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity)
Green cytotoxicity dye	Promega GmbH	G8742	CellTox - fluorescent cytotoxicity dye
Rotenone	Sigma-Aldrich Inc.	R8875	Cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity)
Hydrogen peroxide (H2O2)	Sigma-Aldrich Inc.	95302	Reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity)
Capillary	VitroCom	8260-050	Sample preparation
Microscope	Carl Zeiss Jena	Axiovert 200M
AxioCam MRc CCD-camera	Carl Zeiss MicroImaging GmbH	426508-9901-000	CCD-camera
AxioVision data aquisition software	Carl Zeiss MicroImaging GmbH	version 4.8.2.
Laser diode	Pico Quant GmbH	LDH-P-C-470	Used with driver PDL800-B
Peristaltic pump	Ismatec Labortechnik	MS-1 Reglo	Re-calibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10
Silicone tubes	IDEX Health & Science GmbH	TYGON R3607