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Method Article
In this manuscript, periodate oxidation and glutaraldehyde cross-linking methods for covalent immobilization of antibodies on paper discs are presented. The binding activity of immobilized antibodies was evaluated. Based on these results, a glutaraldehyde cross-linking method was used to develop a novel paper-based immunoassay for immunoglobulin G (IgG) detection.
このレポートでは、セルロース濾紙グレード1号(メディアフローろ紙)ディスクやグレード番号113(高速フローろ紙)ディスク上の捕捉抗体の共有結合固定化するための2つの方法を提示します。抗体は、それらの上に固定される前に、これらのセルロース紙ディスクは、シランカップリング技術によりアミン官能基がグラフトしました。過ヨウ素酸酸化およびグルタルアルデヒド架橋方法は、セルロース紙ディスク上に捕捉抗体を移植するために使用しました。固定化後のその標的への捕捉抗体の最大結合能力を確保するために、過ヨウ素酸ナトリウム、グルタルアルデヒド、及び紙ディスクの表面上の捕捉抗体の様々な濃度の影響を調べました。過ヨウ素酸酸化法と比較した場合、グルタルアルデヒド架橋剤を介してアミン官能化セルロースペーパーディスク上にコーティングされた抗体は、標的への増強された結合活性を示しました。。 (マウス参照血清中の)IgGは、グルタルアルデヒドを介して共有結合的に固定化された抗体のアプリケーションをテストするために、本研究で基準ターゲットとして使用しました。新たな紙ベースの、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)の開発に成功し、IgGの検出のために検証されました。この方法では、機器を必要とせず、それは、IgGの100ng / mlのを検出することができます。高速フローフィルタ紙媒体流ろ紙より感受性でした。このアッセイのインキュベーション期間は短く、少量の試料を必要としました。この裸眼、比色イムノアッセイは、従来のELISAを用いて同定される他の標的を検出するために拡張することができます。
ポイント・オブ・ケア検査(POCT)診断の研究では、治療のための新しい戦略の開発、個別化医療、ホームケアの1のために重要です。彼らは、安価なアクセス、およびユーザ2によく知られているとして、セルロース紙は広く、イムノアッセイでのプラットフォームとして使用されています。また、セルロース紙の多孔質構造は、付加的なエネルギーの影響を与えることなく、液体の流れを駆動するための電力を有しています。ペーパークロマトグラフィーは、最初1952年に発明されたときに紙ベースのバイオ分析のレコードは早ければ20 世紀に発見することができ、最も一般的な例は、妊娠と糖尿病テストストリップとしてイムノクロマトグラフィー検査3、です。これらのテストは、比較的高速な分析時間と安価な分析4を提供します 。それらの単純さのために、これらの従来の紙ストリップテストは、広くPOCT診断5で使用されてきました。
測色6を含む検出方法、電気化学7、及び電気化学発光8の方法は、生体試料中の標的を測定することが報告されています。これらの定量的な方法に加えて、セルロース紙に抗体を固定化するための信頼できる方法はまた、診断用デバイスの開発のために重要です。非特異的吸着は、固定化後のその標的への最大結合容量を確保するために、紙ベースのデバイス9,10の表面上に抗体を修飾するための主な戦略です。しかし、以前の研究 セルロース紙に吸着された抗体は、40%の繊維11から脱着することができることを示しました。したがって、セルロースへの抗体の直接吸着は、再現性のある結果12を提供することはできません。紙の表面上にグラフトされた抗体の共有結合固定化は、効果的な紙ベースのバイオアッセイ13を開発する代替的な方法です。種々の方法は、セルロース14,15の変形のために報告されています。理想的には、抗体が固定化12後に元の機能を維持する必要があります。カルボニルは、1-シアノ-4-ジメチルアミノテトラフルオロボレート16と組み合わせます。 1-フルオロ-2-ニトロ-4- azidobenzene UVベースの活性化戦略17、18を介し。キシログルカン修正19に基づく化学酵素戦略。 1,4-フェニレンジイソチオシアネートの連結剤20;ヘテロ酸化21クリックケミストリー22;そしてカチオン性ポルフィリン23は、共有セルロース紙に生体分子を固定化するために使用されています。キトサン修飾紙は、それが豊富で27生体適合性であるため、紙ベースimmunodevices 24-26を開発するために使用されてきました。キトサンは、カチオンであり、アニオン性セルロース27に強力に接着します。捕捉抗体は、キトサンコーティングおよびグルタルアルデヒド架橋を介して紙の上に固定されています。過ヨウ素酸酸化はCAPTをグラフトするための別の方法でありますセルロース紙28上のURE抗体。この方法では、過ヨウ素酸ナトリウムは、アルデヒド基に直接セルロース1,2-ジヒドロキシ(エチレングリコール)基に変換するために紙の上にスポットします。アルデヒド基は、次いで、多糖類および抗体28の間に共有結合を形成するために使用されます。製造が簡単であるが、完全に過ヨウ素酸ナトリウムを洗い流すことが困難です。未洗浄の過ヨウ素酸ナトリウムは、抗体の活性および安定性に影響を与える、セルロース紙に固定化された抗体のさらなる酸化を引き起こすことができるNが - (3-ジメチルアミノプロピル) - Nエチルカルボジイミド塩酸塩およびN-ヒドロキシスクシンイミド架橋剤をも使用されています共有ナノファイバーベースのアッセイ29の開発のための電界紡糸ポリL-乳酸および酢酸セルロースナノファイバー上に抗体を固定化します。
この研究では、シランカップリング技術はcellulos上のアミン官能基をグラフトするために使用されました電子ペーパーディスク。この技術は、イムノアッセイにおいて最大垂直フロースルーを可能にする、元の孔径、ウィッキング、及びセルロース濾紙の濾過速度を維持するのに役立ちます。シランカップリング技術は、広く生体分子を用いてさらに修飾に続いて第二級アミン基を有する基板表面を官能化するためにバイオセンサーに使用されています。マトリックス表面上のアミン基のグラフトは、有機官能性シラン剤とマトリクス基板30の-OH基との縮合反応を含みます。セルロース紙ディスクは3-アミノプロピルトリメトキシシラン(APS)31を介して、シランカップリングによってアミノ基で官能化しました。これは、2つの異なる方法を使用して共有結合固定化捕捉抗体が続きました。第一の方法は、アミン官能化セルロースペーパーディスクに素酸酸化捕捉抗体の結合を含んでいました。第二の方法は、キャプチャを添付し、架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用antibodiアミン基官能化セルロースペーパーディスクにエス。捕捉抗体の存在は、蛍光分子イメージャーを用いて、ウサギ抗ヒトIgGのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)で確認しました。抗ウサギIgGヤギに対するウサギ抗ヒトIgG-FITCの結合活性は、ペルオキシダーゼ基質により評価しました。過ヨウ素酸ナトリウム、グルタルアルデヒド、および捕捉抗体の様々な濃度の影響を調べました。固定化捕捉抗体の適用試験は正常IgG血清の検出により行いました。
セルロース紙ディスク上の1グラフトのアミン官能基
アミン官能化セルロースペーパーディスク上の抗体の2.共有固定化
2つの異なる方法によって抗体の1.共有結合固定化を図。過ヨウ素酸酸化を介してアミン官能化セルロース紙ディスク上に固定化することができる。抗体。炭水化物残基は、アルデヒド官能基を生成する過ヨウ素酸ナトリウムで酸化しました。次に、酸化された抗体は、アミン官能化セルロースペーパーディスクにロードした。B。抗体は、その後、グルタルアルデヒドを介してアミン官能化セルロースペーパーディスク上に固定化しました。アミン官能化セルロースペーパーディスクは、紙ディスクにアルデヒド基を導入するために0.05%グルタルアルデヒド溶液に浸漬しました。洗浄後、抗体は、アルデヒド官能ペーパーディスクにロードした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
IgGの検出のための3紙ベースELISA
紙ベースのELISA FOの図2.略図R IgGを検出。キャプチャ抗体は、共有結合、グルタルアルデヒドを介して、アルデヒド官能化セルロースペーパーディスク上に固定化しました。セルロース紙ディスクを、ブロッキング緩衝液でブロックしました。ターゲットIgGは、次にHRPコンジュゲート信号の抗体のローディングに続いて、ディスクに添加しました。最後に、TMB及び過酸化水素の混合溶液は、カラー読み出しのため、各ペーパーディスクにロードした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. フーリエ変換は、未処理およびAPS処理されたメディアフローフィルター平方紙(A)と高速フローフィルター平方紙(B)。Aの赤外(FTIR)スペクトルを変換します。未処理のメディアフローフィルタの正方形の紙のためのスペクトルは、APS処理されたメディアフローフィルタ...
非修飾セルロースペーパーディスク上のアフィニティー精製したヤギ抗マウスIgG-Fcの捕捉抗体の直接コーティングは、IgG濃度を検出するために行きました。結果は、捕捉抗体のさらなる固定が再現性のために必要とされることを示しました。シラン化技術は、正常セルロースペーパーディスク34にアミン官能基を導入するために使用されました。 APSの濃度は、抗体の固定化に影響を?...
The authors have nothing to disclose.
This work was financially supported by the Ministry of Education, Singapore through the Translational and Innovation Grant (MOE2012-TIF-2-G-009).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cellulose filter paper, Grade1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
Cellulose filter paper, Grade113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich, Singapore | T1255 | >96% |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
Skimmed milk powder | Louis François | Packed by Kitchen Capers, Singapore | |
Tris base | Promega | H5135 | |
Sodium periodate | Merck | 106597 | |
Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
KH2PO4 | Merck | 104873 | |
NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
NaOH | Merck | 106462 | |
HCL | Merck | 100317 | |
phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl |
Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution | 1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
Rabbit anti-human IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
Mouse reference serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/mL |
HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
Equipment | |||
Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
Fluorescence molecular imager | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
Oven | NUVE FN500 | N/A | |
Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
Image J | RGB, free download | N/A |
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