植物組織からの有機酸を定量化するためにキャピラリー電気泳動を使用した：テストケースを調べます<em&gt;コーヒーノキアラビカ</em&gt;種子

要約

この記事では、無料の帯状キャピラリー電気泳動を用いて植物材料からの有機酸の検出および定量するための方法を提示しています。コーヒー種子中の有機酸濃度の二次発酵の効果を決定するこの方法の潜在的なアプリケーションの例が提供されます。

要約

カルボン酸は、一つ以上の末端カルボキシル（COOH）官能基を含む有機酸です。短鎖カルボン酸（SCCAs; 3〜6個の炭素を含有するカルボン酸）、そのようなリンゴ酸やクエン酸などは、それらが細胞呼吸で機能し、細胞の健康の指標として役立つことができる多くの生物学的システムの適切な機能に重要です。食品中に、有機酸の含有量は、酸味又は「酸」味をもたらす増加SCCAレベルと、味に大きな影響を与えることができます。このため、有機酸濃度の迅速な分析のための方法は、食品及び飲料産業に特に重要です。しかし、残念ながら、SCCAの定量化のために使用されるほとんどの方法は、高価で、クロマトグラフィーおよび/または質量分析解析に続いて、危険な試薬を用いたサンプルの誘導体化を必要とする時間のかかるプロトコルに依存しています。この方法は、組織の検出および定量化のための別の方法を詳述しますフリーゾーンキャピラリー電気泳動（CZE）を用いて植物材料と食品試料からANIC酸は、単に、キャピラリー電気泳動（CE）と呼ばれます。 CZEは、検出の下限（0.005ミリグラム/ ml）でSCCAsを測定するための費用対効果の高い方法を提供します。この記事では、植物試料からSCCAsの抽出と定量化について詳しく説明します。提供される方法は、コーヒー豆からSCCAsの測定に焦点を当てているが、提供される方法は、複数の植物をベースとする食品材料に適用することができます。

概要

Carboxylic acids are organic compounds containing one or more terminal carboxyl functional groups, each attached to an R-group containing one or more carbons (R-C[O]OH). Short chain, low molecular weight carboxylic acids (short chain carboxylic acids, SCCAs) containing between one and six carbons, are essential components of cellular respiration, and function in several biochemical pathways necessary for cell growth and development. SCCAs play critical roles in cellular metabolism¹, cell signaling², and organismal responses to the environment (such as antibiosis³). Because of this, SCCAs can serve as useful indicators of disruptions to cellular metabolism, plant stress responses^4,5, and fruit quality^6,7. To date, SCCAs have been quantified primarily through chromatographic techniques such as high performance liquid chromatography (HPLC) or gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS). While these methods, are capable of achieving very low limits of detection, they can be expensive, require the derivatization of target SCCAs using caustic and/or toxic reagents, and include lengthy separation runs on the GC or HPLC. Because of this, interest in the use of free zonal capillary electrophoresis (CZE), which does not require sample derivatization, to quantify organic acids has steadily increased⁸.

Free zonal capillary electrophoresis (CZE) is a chromatographic separation methodology that, due to its high number of theoretical plates, speed, and relative ease-of-use, is increasingly replacing both GC-MS and high-pressure liquid chromatography as an analytical method for the quantification (particularly for quality control purposes) of anions, cations, amino acids, carbohydrates, and short chain carboxylic acids (SCCAs)^8,9,10. CZE-based separation of small molecules, including SCCAs, is based two primary principles: the electrophoretic movement of charged ions in an electrical field established across the buffer filling the capillary; and the electro-osmotic movement of the entire buffer system from one end of the capillary to the other, generally towards the negative electrode. In this system, small molecules move towards the negative electrode at varying speeds, with the speed of each molecule determined by the ratio of the net charge of the molecule to the molecular mass. As the movement of each individual molecule in this system is dependent on the charge state of the molecule and the overall rate of electro-osmotic flow (which is itself based on the ion content of the buffer used to fill the capillary), the buffer pH and ionic composition heavily impact the degree to which molecules can be efficiently separated using CZE. Because of this, SCCAs, with their relatively high charge-to-mass ratios, are ideal targets for CZE-based separation. Metabolites separated using CZE can be detected using a variety of methods, including UV absorbance, spectral absorbance (which is generally performed using a photo-diode array [PDA]), and/or mass spectroscopy (CE-MS or CE-MS/MS)⁸. The diversity of separation and detection methods provided by CZE makes it an extremely flexible and adaptable technique. Because of this, CZE has been increasingly applied as a standard method of analysis in the areas of food safety and quality^11,12, pharmaceutical research¹³, and environmental monitoring^13,14.

Capillary electrophoresis has been used to detect and quantify short chain carboxylic acids for nearly two decades¹³. The resolving power (particularly for small, charged molecules), short run time, and low per sample cost of CZE analyses make CZE an ideal technique for the separation and quantification of SCCAs¹³. This method presents a protocol to utilize CZE to measure the concentration of organic acids from plant tissues. Example data was generated through the successful implementation of this protocol to measure the change in organic acid levels in coffee seeds following a secondary fermentation treatment. The protocol details the critical steps and common errors of CZE-based separation of SCCAs, and discusses the means by which this protocol can be successfully applied to quantify SCCAs in additional plant tissues.

プロトコル

1.試料の調製

1. 短鎖カルボン酸（SCCA）抽出のためのサンプルを組み立てます。十分なサンプルが処理後に残ることを保証するために、一度にコーヒー種子の1.0グラムを準備します。
   1. 試料を粉砕工程に先立って凍結させた場合には、凍結/解凍の損傷およびサンプルの酸化を防止するために、処理全体凍結組織を維持します。研削に必要なだけのように冷凍庫またはサブゼロストレージからサンプルを削除します。
   2. Flashは研削サンプリングする直前に液体窒素中で新鮮なサンプルを凍結します。液体窒素で予め充填されたモルタルでそれらを置くことによって、サンプル処理、フラッシュ凍結サンプルを最小化します。
   3. すぐに生成、またはフラッシュ-20ºCで液体窒素とストア内の凍結や分析まで-80ºC以下の液体試料を分析します。分析の前に、ストレージから凍結試料を除去し、解凍することができます。液体試料の場合の処理​​のために（3.5）に進みます。
2. アプロを着用液体窒素を使用する前に（安全眼鏡、手袋、白衣を含む）個人用保護具をpriate。
3. セラミック乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で均一に微粉末（ すなわち、均一な粒子サイズの）にトリプルグラインド組織サンプル。
   注：均一な粒子サイズを達成するSCCA抽出効率を最大化するために不可欠です。
   1. モルタルを予め冷やし、試料を添加する前に、液体窒素で乳棒。サンプルが追加される液体窒素の小容量で満たされたモルタルを保管してください。
   2. 取鍋を使用して、サンプルを完全に水没するモルタルに十分な液体窒素を追加します。
   3. 液体窒素に、そのような葉や焙煎したコーヒーなどの簡単グラウンドサンプルを、追加して、円形の研削運動を使用してつぶします。液体窒素レベルは、それがかろうじてサンプルをカバーポイントまで減少したときに、サンプルを粉砕し始めます。
   4. このような、サンプルを粉砕するのは難しい追加sの生のコーヒー種子、液体窒素に、研削前に（液体窒素激しく沸騰を停止するまで、または）それらは10から30秒間フリーズすることができます。垂直破砕の動きを使用して、より小さな断片に組織を破壊し、その後、円形研削運動を使用して粉砕し、完全な組織。
   5. サンプルは3回の合計を接地されるように、手順を繰り返し、2倍1.3.2-1.3.4。一般的に、研削の3連続ラウンドは小麦粉様のコンシステンシーを有する粉末にサンプルを削減します。
   6. 粉状の稠度が達成されない場合、手順を繰り返し1.3.2-1.3.4試料が均一小さい粒径の粉末に還元されるまで（抽出効率は、粒子サイズに反比例します）。
4. ガラスバイアルまたは1.5ml微量遠心管に粉末を転送します。すぐに粉砕後、下流の処理を開始します（推奨）、またはサンプルまで-80ºCで保存サンプルは、抽出のための準備ができています。
   1. サンプルは、前に保存されなければならない場合分析は、500mgのアリコート（または液体試料のための500μlのアリコート）とストレージのための複数の管の中の分割にサンプルを分割します。これらは、試料組成を変化させ、負の将来のサンプル測定値に影響を与える可能性があるとして、繰り返し凍結/解凍サイクルにサンプルをかけることは避けてください。

2.有機酸標準品

1. 関心のSCCAsのための本格的な基準を組み立てます。これらは、SCCA濃度を決定する際に使用するための外部および内部標準溶液を作成するために使用されます。コーヒー試料を内部標準として関心とアジピン酸の酸としてクエン酸、リンゴ酸、酢酸、および乳酸が含まれるため。
   1. 選択された内部標準は、試料中の天然に見出され、サンプルプロファイルにおける他のピークとの標準がないことを共溶出されていないことを確認してください確認してください。
   2. （instのを実行するためのセクション4を参照してください興味のある各SCCAのための標準曲線を実行し、各SCCAのための線形応答範囲を決定ructions）。試料中で測定される各SCCAのための標準曲線を実行することを確認します。
      注：標準曲線は、緩衝液またはサンプルの背景がアッセイされるいずれかで実行することができます。第二の場合（「標準添加」）において、それぞれの標準曲線の点のピーク面積の値は、サンプルのバックグラウンドを取り除く減算することによって決定されます。
   3. 事前ラベルSCCA酸名、濃度、およびアッセイの日に必要なすべてのチューブやガラス製品。
2. 標準の準備中に精度を確保するために、メスフラスコを用いて、既知濃度（10 mg / mlで）で各標準のためのストック溶液を準備します。
   1. ストック溶液のための所望の濃度を達成するために、超純水（18.2MΩ）で固体SCCA標準（クエン酸及びリンゴ酸）を溶解させます。
      1. 10 mlの容量フラスコに標準100mgを添加することによっての10mg / mlのストック溶液を作成します。 Dに超純水で10mlラインにメスフラスコを埋めます酸をissolve。
      2. 酸標準のより低い濃度を作成するか、または静かに溶液中に、アジピン酸のような、難溶解SCCA標準を駆動するためにフラスコを加熱します。
   2. 所望の濃度を達成するために、超純水の液相酸標準（酢酸および乳酸）を希釈します。
      1. 超純水5mlでメスフラスコを事前に記入してください。フラスコに（ベンダーが提供酸濃度を用いて計算）を10mg / mlの溶液を調製するのに十分な酸を添加し、次いで10 mlの溶液の最終容量をもたらすために十分な水を加えます。
3. キャップ裏地ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）と、清浄な15mLのガラス管に各原液を転送し、プラスチックパラフィンフィルムで密封します。ストック溶液は、1週間4ºCで密閉管中で保存することができます。
   1. 原液がprepar後に冷蔵された場合SCCA基準は使用前に溶液から沈殿していないことを確認してくださいエーション。ドライブは、穏やかな加熱により溶液中に戻って沈殿します。
4. SCCA抽出液を準備します。試料中の検出のために十分な濃度（0.05 mg / mlで）の内部標準が含まれます。すべてのサンプルを取り出すための十分な解決策を準備します。
   1. 超純水中の0.05 mg / mlでの内部標準ストック溶液を希釈することによってSCCA抽出溶液50mlを調製します。水49.75ミリリットルに内部標準ストック溶液（10mg / ml）250μlのを追加します。
   2. 抽出液を希釈する必要がある場合は、最終濃度が定量限界内に入るように、（検出可能なを与えるではなく、過飽和、ピーク、下記5.2.2を参照）、抽出液中の内部標準濃度を調整します希釈後のCEシステム（0.05 mg / mlで）。
   3. （ すなわち、各実験シリーズのために）抽出の各シリーズの新鮮な抽出溶液を準備します。
5. 標準曲線のサンプルを準備します少なくとも5点の最小値を使用して、関心のSCCAsのための（適切な希釈系列）、。用いる標準曲線濃度が所定のSCCAための線形応答範囲にあることが必要であり、試料中の予想されるSCCA濃度にまたがります。
   1. サンプル中の内部標準の定量化を可能にするために、標準曲線のソリューションの選択された内部標準が含まれます。内部標準ピークの同定を補助し、抽出効率（項6）を計算するために使用されます。
   2. 上記の測定された濃度に各SCCAを希釈（0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mg / mlで;、上記の2.4.2を参照）を超純水を使用して、新しいマイクロ遠心チューブに（各濃度/標準曲線ポイントに1つ）。各標準曲線濃度ポイントの溶液1mlを準備します。各濃度点はすべての4つの酸標準と正しい濃度の内部標準が含まれていることを確認してください。
   3. 各セットのための新しい標準カーブポイントを準備します試料のキャピラリー電気泳動システム上で実行されます。標的組織（セクション3）からSCCAsの抽出を次のように発生するであろう、分析まで4ºCで標準曲線SCCAサンプルを保持します。

3.有機酸抽出

1. 各サンプルについて少なくとも1つのチューブを調製する前標識試料管は、抽出されます。
2. ストレージから抽出するサンプルを削除し、抽出のための材料を計量しながら氷の上に置きます。
3. SCCA抽出のために試料100mgを秤量。
   1. 各サンプルを計量した後、清浄な1.5ミリリットルのマイクロチューブに組織を移します。変動性を低減することができるように、ターゲット質量に近いサンプルの量を測定します。
   2. 検出されたSCCAsの量は、試料質量（以下、6.5.2を参照）を用いて正規化されるように、測定した各サンプルの質量を追跡します。
4. すべてのサンプルを計量した後、抽出溶液の1ミリリットル（ウォートを追加R +試料管のそれぞれにステップ2.4から内部標準混合物）。 （100±5 mgの組織のための1ミリリットル、この場合には）すべての抽出で同じ組織塊に抽出溶液の比率を保持します。 10秒間ボルテックスでよく混ぜます。
5. サンプルは、1時間室温で静置します。この時間の間に、ステップ3.4のように各チューブを15分毎に混ぜます。
6. 抽出の1時間後、サンプルを最後に1回混ぜると微量にサンプルチューブを移します。 4℃で遠心分離標本は、10分間10,000×gでは、固体材料（細胞壁、粒子状物質など ）を沈殿させました。
   1. 液体試料を処理する場合、簡単に遠心操作を混ぜ、内部標準の適切な濃度を追加します。遠心分離の後、固体試料からの抽出物と同一の液体試料を扱います。
   2. 彼らが実行して検出キット（ステップ4.6）でバッファまたはEMPある緩衝系のpH範囲と互換性があることを確認するためにサンプルのpHをチェックloyed。試料の体積は、通常、非常に小さいように、pHをpH試験紙を使用してモニターすることができます。
7. 注射器に取り付けられたディスクフィルター（3.8）を使用して、サンプルをフィルタリングするために準備します。
   注：各フィルタが正しく上清を転送する前に、注射器に接続されていることを保証することによって、サンプルの損失を防ぎます。 （標準曲線のサンプルを含む）、分析される各サンプルのディスクフィルターを装備した1注射器を準備します。
8. サンプルを遠心分離し、シリンジフィルターを製造した後、0.2μmシリンジフィルターを備えた3 mlシリンジに各試料からの上清を移します。各サンプルの新しいフィルタと注射器を使用してください。 CEシステム上で実行する前に、標準曲線サンプルおよびバッファコントロールを含むすべてのサンプルを、フィルター。
9. きれいなマイクロチューブに直接サンプルをフィルタリングします。ろ過後、ろ液を含むチューブを閉じ、シリンジ/フィルタ装置を廃棄します。
10. すぐにフィルタリングのサンプルを配置SCCA検出のためのCEシステムへ。 4℃で一晩またはストアサンプル。サンプルを一晩保存する場合、ガス交換およびサンプル蒸発を防ぐためにプラスチックパラフィンフィルムで管を密封します。
    1. サンプルは、フィルタリング後の日よりも長く保存されなければならない場合、-20ºCで液体窒素や凍結でフラッシュ凍結を抽出します。解凍後、しかし、（ステップ3.6のように）必要に応じて、各サンプルは、沈殿物の形成及びフィルタのために検討されていることを確認してください。

4. SCCA検出ファイル名を指定して実行を設定

1. programming-と制御ソフトウェア固有の詳細については、CEのユーザマニュアルを参照してください。
2. SCCAの検出のためにキャピラリー電気泳動（CE）サンプルバイアルを準備します。清潔、および欠陥のない、バイアルを適切に標識されていることを確認します。
3. 使用前にCEバイアルのキャップを洗浄し、乾燥させます。
   1. 超純水に浸漬し、それらを一晩浸漬させることにより、キャップを洗ってください。キャップを浸漬した後、ソーク捨てます解をると、超純水で2回以上のキャップをすすぎます。
   2. 転送は、リントフリーティッシュを敷いたきれいな乾燥表面にキャップをすすぎ、空気乾燥にそれらを可能にします。キャップは圧力の失敗を回避するために、使用前に完全に乾燥していることを確認します。
4. 誤ってバイアルの首に試料をはねないように注意しながら、各CEバイアルにサンプルの1ミリリットルを転送します。転送後、各バイアルにCEキャップを置きます。
   1. 超純水を使用して、CEバイアルに直接：100希釈が必要な場合は、コーヒー種子サンプル1:10 1に希釈します。 1より大きい希釈液の場合：100、ピペッティングエラーを回避するために、中間希釈を作成します。
5. CEバイアルにステップ2.5から標準曲線液（1.0ミリリットル）を転送することにより、各標準曲線のポイントの1つのバイアルを準備します。転送後、各チューブをキャップ。
6. ペレットT 90 mlの超純水を含有するビーカーにNaOHを0.04gのを添加して可能にすることにより、水酸化ナトリウム（NaOH）の0.1 M溶液を調製しますO溶かします。 100ミリリットルのメスフラスコに0.1 M NaOH溶液を移し、100mlに全量を。
7. クリーンCEバイアルとキャップに0.1 M NaOH溶液の1ミリリットルを追加します。
8. CEシステム上で実行するためのサンプルのバッチごとのCEバッファバイアルを準備します。分離キットが入手可能であるか、またはカスタム・バッファは^13を使用することができます。
   1. 緩衝溶液とキャップを開始する1ミリリットルで1バイアルを準備します。
   2. 1ミリリットルの緩衝液とキャップを実行しているのそれぞれに3バイアルを準備します。サンプルおよび標準曲線の点の各バッチの前に、またはいずれか早い方35サンプル、後にランニングバッファーを交換してください。
   3. 超純水1mlで3つの追加のバイアルを記入し、各バイアルをキャップ。
   4. キャップ付き1空の「廃棄物」バイアルを準備します。
9. ステップ4.8で説明したバイアルを準備した後、キャピラリー電気泳動sysのバッファトレイにバッファや水、並びに（ステップ4.8.2-5から）廃棄物のバイアルを含むバイアルをロードテム、製造業者の使用説明書¹⁵あたりとして。慎重にオートサンプラーのプログラミングのための各バイアルの位置に注意してください。
10. 標準曲線の点と、製造業者の説明書に記載されるように、入口サンプルトレイにアッセイされるサンプルを含むバイアルを含むバイアルをロードします。 （手順以下の4.11.1を参照のこと）オートサンプラープログラミングに各バイアルの位置に注意してください。
11. コンディショニングと試料の分離方法を準備し（これらのためのプログラムは、それぞれ、 表1および2に提供されている）、および命令を操作する楽器ごとにサンプルシーケンスファイルを作成します。 表2に詳述分離方法を使用します。0.2分間イニシエータ（20 PSI）でカラムをすすぎます。 （0.09分間カラムにサンプル（0.5 PSI）を注入し、12分間、20キロボルトで別々の試料は、0.5分間のNaOH（20 PSI）でリンスし、0.5分間加速器（20 PSI）でリンスし、そして最後に水で洗い流し20 psi）で0.5分間。
    1. USICE制御ソフトウェアをngの（ すなわち、ワークリストを、サンプルが分析される順序を詳細リストファイル、及び方法は、各サンプルを分離するために使用される）は、サンプル実行シーケンスを記述する「配列」スプレッドシート・インタフェースを使用して。スプレッドシート上の各行は、サンプルの実行に対応し、1つのデータファイルを生成します。
       1. シーケンスファイルを書き込むときに、サンプルがサンプリングトレイに正しい位置を使用して同定されていることを確認してください。各データファイルは、以前のファイルを上書きするからソフトウェアを防止するために、固有の名前を持っていることを確認してください。試料分離方法を含む配列の実行前に独立したシーケンスとしてプログラムCEキャピラリーコンディショニングが実行されます。
    2. SCCAサンプルが続く標準曲線のソリューションを使用して実行サンプルシーケンスを、開始し、標準曲線のソリューションのセカンドランで終了。これは、サンプルの分析中に生じる任意の信号損失の程度の計算を可能にします。

    
    表 1： キャピラリー電気泳動^Aを介して短鎖カルボン酸を分離するための毛細管を調製するために使用されるコンディショニング方法プログラム。

    
    表 2：キャピラリー電気泳動^Aを介して短鎖カルボン酸を分析するために使用される分離方法のプログラム。

    5. SCCA検出を実行し実行とデータ収集

    1. キャピラリーコンディショニングの実行を開始します。カラムはサンプル分離のための準備が整う前に、キャピラリーを2回または3回を調整するように期待しています。カラムコンディショニングは、 表1に記載したように、簡潔に述べる。行う1分間、0.1MのNaOH（20 PSI）でカラムを洗い流し、水（20 PSI）でリンスされるべきであるために1分、10分、30キロボルトで0.5分、別々のアクセラレータのアクセラレータ（20 PSI）ですすい0.5分間イニシエータ（20 PSI）ですすぎ0.5分間、0.1MのNaOH（20 PSI）でカラムを洗浄し、最後に0.5分間水（20 PSI）でカラムをすすぎます。
       1. 各サンプルのシーケンスの実行に先立ってキャピラリーを調整。分離電圧は、実行を通して一定で保持し、フォトダイオードアレイトレース上の平らなベースラインを観察することによって、適切な空調を実現。
    2. コンディショニングの後、（ すなわち、クリック）ソフトウェアに「コントロール」メニューを開いて選択することにより、試料分離を開始し、「実行順序を。」適切な分離を確保するために、フォトダイオードアレイ（PDA）のトレースを監視します。
       1. 最初のトレースを観察し、それがフラットなベースラインときれいに解決さ（ベースラインの解像度）、個々の酸のピークを持っていることを確認してください。オーバーロードされたサンプルは、長いピーク尾、またはピークテーリングが表示され、（ 図1）に希釈する必要があります。

    
    図1：PDAの比較は、過負荷サンプルを強調トレース分析物濃度が増加するにつれて、個々のピークの形状が非対称になることを開始することができます。 （A）は0.05mg / mlで、酢酸は、明確に定義された、左右対称のピークを示します。 （b）は、0.07 mg / mlで、および（C）0.10 mg / mlで、ピークテール形（矢印）への酢酸の濃度が増加します。このピークテーリングは、試料が過負荷になっていることをよく示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    3. シーケンスの実行の終了時に、CE分析ソフトウェアの時にデータファイル1を開いて、ピークを統合します。
       1. サンプルピークを統合します。
          1. 最初のファイルを開きます。ランの最初の3分を排除する自動積分ステップを設定する（ 表1に記載した通りであり、電圧、したがって、カラム流量の方向は、反転されます）。同じメニューでは、トレース内のバックグラウンドノイズから酸ピークを分離し、選択性の適度に高いレベルを提供するために、50台の最小ピーク幅と100単位（またはメーカーのデフォルト設定）のピーク面積をピーク選択基準を設定します。
       2. 手動で適切なピーク積分を確保するために、各PDAトレースのピークの境界とベースラインを確認してください。不適切に統合されたピーク（ すなわち、自動化されたソフトウェアによって二つの別々のピークとして統合されている若干の非対称SSCAピーク）は手動で再統合する必要があります。
    4. 統合後は、面積率のレポートを表示し、ハイライト表示して、面積パーセントレポートをコピーし、別のスプレッドシートに貼り付けます。フルランピークreporを構築するために、各サンプルについて繰り返し単一のピークを表す各行とトン（分離がうまく機能している場合、すなわち 、それぞれのピークが単一の化合物が含まれている必要があります）。

    6.データ解析

    1. （5.4）で構築したスプレッドシートを使用して、分析用のデータを準備します。内部標準を含む、標準曲線の点のそれぞれに対して酸標準を標識することにより、分析を開始します。
    2. そのサンプル中の内部標準の保持時間によって、試料中の各ピークの保持時間を分割して各ピークの保持指標を計算します。各試料中の目的のピークを同定するために、得られた保持指標によって設定されたデータをソートします。
    3. 関心のある各酸のピークを識別した後、外部標準曲線ポイントを使用して、各酸のための標準曲線を構築します。
       1. SCCA基準の各濃度についてピーク面積を決定することによって、各SCCA規格の規格（濃度）曲線を作成し、XAの濃度をプロットy軸上のピーク面積対XIS。各SCCA標準曲線のための線形回帰をプロットし、スロープ式（Y = MX + B）を定義します。
       2. 定量化が最も正確に標準曲線の直線範囲内で行われているような線形回帰のR ²値は0.90以上であることを確認してください。
    4. ピーク面積（上記6.3.2で計算される）標準曲線の線形回帰ラインの傾きの方程式を用いて、試料中の所定のSCCAための酸濃度を計算します。簡単に言えば、その酸の標準曲線の回帰直線の傾きによって与えられた酸のための観測されたピーク面積を分割します。
       1. 内部標準（ステップ6.5）を使用して、処理中のサンプル損失のためのステップ6.4で算出された生の濃度値を修正してください。
    5. 内部標準を使用して、各サンプルの補正係数を算出します。
       1. 内部標準（ すなわち、KNOの実際の濃度を割りWN量は、試料中の内部標準（ すなわち、量は、内部標準の標準曲線の傾きの式を用いて計算した）の観測値によって）、実験の開始時に添加しました。この補正係数によって、試料中の各SCCAの生の濃度値を乗算します。
       2. 内部標準は、サンプルの質量の変動を補正するために、抽出に用いた試料の質量SCCA濃度補正分けます。この計算は、次に、所定の試験（ミリグラム/ mgで、MG / G、G / G 等の適切な単位に変換することができ、試料の質量あたりの分析物の量（この例では、MGグラウンドコーヒー当たりミリグラムSCCA）を得）。
    6. （[液体試料用] [固体や液体試料用]質量または体積のいずれかに正規化）SCCA濃度を算出した後、実験デザインや興味の質問の要求に従って統計分析のために、これらの値を使用します。

結果

このプロトコルは、正常緑色コーヒー種子のSCCA量の種子処理の影響を測定するために利用されています。この実験では、6の処置であった： ロイコノストック飽和微生物懸濁液は、歪みの増殖培地中GCP674（1）水にGCP674微生物の水性懸濁液（2）、酢酸および乳酸の水溶液（0.15と0.4 pseudomesenteroides MG /）は、それぞれML（3）使用済みのM1増殖培地処理（4）を...

ディスカッション

任意の分析技術と同様に、大幅に生成されたデータの品質と信頼性に影響を与えることができるいくつかの重要な要因があります。まず、凍結/融解サイクルの最小値と、効率的にサンプルを処理することが重要です。凍結融解の繰り返しは、処理や分析の前に、試料の化学組成を妥協することができます。第二に、一貫して均等にすべてのサンプルにこのプロトコルのステップを適用するこ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ceramic Moarter and Pestle	Coorstek	60310
Beckman Coulter P/ACE MDQ CE system	Beckman Coulter	Various
Glass sample vials	Fisher Inc.	033917D
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Inc.	02-681-5
LC/MS grade water	Fisher Inc.	W6-1	Milli-Q water (18.2 MΩ.cm) is also acceptable
15 ml glass tube/ Teflon lined cap	Fisher Inc.	14-93331A
Parafilm M	Fisher Inc.	13-374-12
CElixirOA detection Kit pH 5.4	MicroSolv	06100-5.4
BD Safety-Lok syringes	Fisher Inc.	14-829-32
17 mm Target Syringe filter, PTFE	Fisher Inc.	3377154
32 Karat, V. 8.0 control software	Beckman Coulter	285512
capillary electrophoresis (CE) sample vials	Beckman Coulter	144980
caps for CE vials	Beckman Coulter	144648
Liquid Nitrogen	N/A	N/A	Liquid nitrogen is available from most facilities services