デジタル ホログラフィー顕微鏡 (DHM) を用いた低濃度で微生物の定量化

要約

デジタル ホログラフィー顕微鏡法 (DHM) は、50 〜 100 倍焦点と明視野顕微鏡に匹敵する解像度よりも厚い実行画像サンプルを後処理により体積手法です。ここで DHM はカウントの識別に使用する、および低密度と光学密度計測、プレート カウント、直接カウントと比較して非常に微生物を追跡します。

要約

正確に検出し、まばらな細菌のサンプルを数える医療診断、他の惑星や太陽系の衛星にロボット ミッションによる生体検出、食品、飲料、医薬品加工業の多くのアプリケーションには。現在、文化のめっきや落射蛍光顕微鏡によるスパース細菌サンプルがカウントされます。培養皿を必要とする長いインキュベーション時間 (数日数週間から)、および広範な染色とサンプルの濃度、落射蛍光顕微鏡が必要です。ここでは、軸外デジタル ホログラフィー顕微鏡法 (DHM) を使用して、非常に希薄文化 (100 10⁴セル/mL) 中の細菌を列挙する方法を示します。まず、カスタムの DHM の建設は、建物の低コスト計測器についての詳細と一緒に議論されています。ホログラフィーの原理は、説明、およびビデオにする必要がありますどのくらいの時間を推定する統計モデルを使用計測器の光学特性と (表 2) の細菌の溶液の濃度を基にセルを検出します。.10 セルのビデオ検出⁵10⁴10³、および 100 細胞/mL、非再建されたホログラムを使用してリアルタイムに示されて。振幅と位相像の再構成は、オープン ソースのソフトウェア パッケージを使用して示されています。

概要

非常に希薄サンプルで正確な細菌数の決定は多くのアプリケーションで重要である: 少数の例は水と食品品質解析^1,2,3;血液、髄液、または喀痰^4,5で病原体の検出滅菌水⁶; を含む医薬品の生産オープン海堆積物^7,8,9などの低栄養環境で環境社会分析。木星や土星、特にヨーロッパ^10、11エンケラドス^12,13,の氷衛星における現存する微生物生命の検出に対する興味も高まっています¹⁴、地下の液体の海を持っている知られています。別の惑星で現存する生命を発見する 1978 年バイキング以来ミッションがないので、技術と細菌の同定と宇宙ミッション¹⁵時にカウントの楽器の開発を制限されています。

プレート カウントの伝統的な方法は、時々 環境系統種の少数を表すことができます、人為的セルのみを検索 < 1¹⁶。プレートは、ひずみに応じて最大の成功のため数日あるいは数週間の培養が必要です。落射蛍光顕微鏡は、主として迅速かつ正確な生菌のためのゴールド スタンダードとしてプレート カウントを交換してください。核酸ラベリング酸蛍光染料 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole 二塩酸塩 (DAPI)、SYBR グリーン アクリジン オレンジなど核酸に結合する、典型的な染料^17,18,19、多くの研究を使用してグラムの蛍光インジケーター サイン^{20,21,22,23,24}。1 mL あたり 10 ~⁵セルの検出 (Lod) の制限につながる前濃度ステップなしのこれらのメソッドを使用しています。LoD の改善がろ過を使用して可能です。液体試料は真空フィルター、膜、通常ポリカーボネートと理想的に黒背景を減らすために。低バック グラウンド染料のような上記の DNA 汚れはフィルター²⁵に直接適用することがあります。正確な目でカウント、10 ~⁵セルがフィルターは、試料 1 mL あたり 10 ~⁵セルよりもさらに希釈を意味ごとに必要な重要なサンプル ボリュームを収集およびフィルタ リングする必要があります。レーザー スキャン デバイスは、フィルターのすべての領域を体系的に調査し、mL²⁶あたり 10 ~²セルに至るまでの検出限界を迫り、カウントに必要なセルの数を減らすために開発されています。しかし、これらはほとんどの研究室で利用いただけません、高度なハードウェアだけでなくソフトウェア粒子を観察専門家の確認を許可するが細菌および残骸ではない必要があります。

参考のため敗血症大人通常開始で症状を示す < 100 細胞/mL の血とで乳児の < 10 セル/mL。大人からの血液は 10 mL と乳児、1 mL から。PCR 法が PCR 阻害成分血液^27,28人間と非病原性植物 DNA の存在によって抑制されます。新興技術のさまざまな、にもかかわらず文化より農村地域や発展途上国を中心に血流感染症の診断のゴールド スタンダードのまま。他の惑星上の生命の検出、熱力学的計算は生命およびこうして予想可能なバイオマスのエネルギー予算を見積もることができます。1-100 細胞/mL は、ヨーロッパ²⁹熱力学的に合理的であると予想されます。それは容易に水溶液の大量の細胞の非常に小さい数字の検出が重要な未解決問題であることこれらの数字から見ることができます。

本稿で示す 10 の濃度でセラチアとシェワネラ oneidensis (野生型および非運動性変異) の検出⁵10⁴10³、および軸オフを使用して 100 細胞/mLデジタル ホログラフィー顕微鏡 (DHM)。DHM の利点は従来の光学顕微鏡では高解像度での厚いサンプル ボリュームの同時イメージング-この実装では試料室は 0.8 mm 厚。これらのサンプル室に ± 50 μ m の公差の精密加工アルミ金型からポリジメチルシロキサン (PDMS) のソフト リソグラフィーにより建設されました。これは高倍率びきょわたってフィールドの深さの約 100 倍改善を表します。DHM はまた、光路長 (屈折率と膜厚の製品) の測定を可能にする定量的な位相情報を提供します。細菌や酵母の細胞周期および細菌乾燥質量^30,31,32; の計算を監視するために使用されている DHM と類似の技術散乱の違いは、菌株³³を区別するためにも使用する可能性があります。

使用楽器は具体的には以前に発行された^34,35微生物で使用するため、その設計と建設を示したし、説明。水溶液は絶えずシリンジ ポンプを介して 0.25 μ L のボリュームのサンプル室に供給されます。流量は、サンプル全体のボリュームのイメージを確保するために、カメラのフレーム レートによって決まります。統計の計算は、特定の濃度で細胞のかなりの数を検出するためにイメージを作成する必要がありますサンプル ボリュームの数を予測します。

セル検出用ホログラムの振幅と位相の画像に再構築不要であった。生のホログラムの解析を行った。これは膨大な計算リソースとディスク領域を節約できます: 500 Mb のホログラム映像 1-2 Tb 再建されたときになります。ただし、深さ、ホログラムが希望の種を表すことを確認するためのサンプルの再構築に関する説明を行います。DHM の重要な機能は、強度と画像の位相の両方を監視する機能です。(ほとんどの生物細胞) など強度のほぼ透明な生物は、フェーズで明確に表示されます。ラベル無料テクニック、染料を使用していません。これは、可能な宇宙飛行用、染料はミッションの条件を生き残ることはできませんので dvantage と -さらに重要な-エンコードするため DNA または RNA を使用可能性があります地球外生物を操作するを想定できません。また、北極や南極、染料がリモートの場所に持参することは困難かもしれないし、収納時が低下するなど極端な環境での作業のための利点です。GitHub (シャンプー) を利用したオープン ソース ソフトウェア パッケージを使用してまたは ImageJ を用いた画像の位相と振幅に再構築が実行されます。

プロトコル

1。 成長と列挙体の細菌

注: これは、ほぼすべての菌株の適切な媒体 ³⁶ で栽培に適用。例では、我々 は 3 系統を使用: 一般的な簡単な個人ラボひずみ; として セラチアより小さく、高運動性環境負担、シェワネラ oneidensis 氏 1。検出を比較するには、対非運動性細胞、変異体 シェワネラ 非運動性、Δ 運動 FlgM、また使用されます比較 ³⁷。ホストゲノム スープ (LB) ですべての株が栽培されています

。

1. 準備滅菌 LB 培地 (蒸留水 1 リットルあたり: バクト トリプトンを 10 g、5 g バクト酵母、10 g 塩化ナトリウム; フィルターまたはオートクレーブ)。標準 100 mm 径 LB 寒天培地プレート (同じ培地を加えて 1 リットル当たり 15 グラムの寒天レシピ; オートクレーブ (121 ° C、20 分) を殺菌し、注ぐときに処理するために十分に涼しい) を準備します。冷蔵庫の中、板を格納します
。
2. 実験前日シード 5 6 mL の " マスター " 培地から新鮮な細菌のコロニーは、正しい滅菌とバイオ技術を使用して。〜 12 h. インキュベーション時間はひずみと成長率に依存するため、30 ° C でシェーカー (120 rpm) で孵化させなさい。実験では、12 時間孵化する シェワネラ 系統ただし、セラチア 8 時間後に文化は半ば対数増殖に展示されるように収穫が
。
3. 実験の日かかる細菌の吸光光度読書 (外径 ₆₀₀) 0.6 〜 0.7 の範囲内であると予想される文化をマスターします。それは (前に確認した)、対数増殖期のはずです。場合 5 mL の培地には、サブカルチャー 100 μ L 中間ログ フェーズに細胞の成長を許可するとします
。
4. マスターのサンプルを取る文化し、アクアマリーン Hausser のカウントを使用して直接商工会議所のセルをカウントします。生きていると死んでいるセルが列挙されます。
   1. マイクロ ピペットと転送室に原液文化の 10 μ L のサンプルを抽出します
   。
   2. (40 X 63 X、NA 0.7 - 0.8) 高ドライ客観的顕微鏡下の画像相コントラストを使用して
   。
   3. は、少なくとも 20 の正方形と平均の細菌をカウントします
      。 注: は、正方形とだけそれらを越え、上部と左境界 (または下と右場合) 内に完全にある細菌だけをカウントします。正方形はいくつかの行で区切られた、境界としていずれかを選択します
   。 希釈係数 x
   4. 20 の平均として計算濃度の正方形。数濃度のためによく働かない直接注 < 10 ⁷/mL
   。
5. コロニー形成のカウントの文化のシリアル希薄を作るユニット (CFU)。生きた細胞のみが列挙されます。
   1. 0.9% 生理食塩水と選択した細菌性のサンプルのそれぞれのシリアル希薄を作るソリューションです。細菌溶液 20 μ L を転送し、180 μ L の生理食塩水で希釈します。最低濃度が 10 〜 ³ セル/mL になるまでを繰り返します
   。
   2. 希薄示唆された少なくとも 2 つを取る 100 μ L が 10 ³ と 10 の ⁴/mL — と適切な固体媒体プレートのプレート。滅菌スプレッダーで拡散します。各希釈の少なくとも 3 の複製を実行します
   。
   3. コロニーの成長まで、または一晩あなたの細菌のための適切な温度で孵化させなさい
   。
   4. のコロニーをカウントし、コロニー形成単位 (CFU) (x の希釈倍率のコロニー数) によるとを計算するボリューム メッキ/CFU/mL を =。平均 CFU 複製します
   。

2。DHM の高希釈試料の調製

1. マスターのシリアル希薄を作る文化 DHM とポスト DHM カウントの LB メディア プレートのコロニー形成単位 (1.4.4 1.4.1 - 参照)。録音を行っている人は各測定サンプルの濃度を認識せずに実行するには、この二重盲。
   1. は、実験中に細胞の濃度がかなり変更されませんので、10-15 mL 最小媒体を (必要に応じて) 運動を奨励するが、細胞分裂を阻害するのに細菌を希釈します。0.9% 生理食塩水またはより具体的運動媒体があります。たとえば、大腸菌 を使用している場合、運動中は EDTA ³⁸ を含める必要があります。これらの例では 0.9% 生理食塩水を使用します
   。

3。DHM 動画の記録

1. 関心の希薄化の約 10 mL 滅菌注射器を使用すると、プルします
。
2. は、DHM 試料室滅菌器具を使用し、チューブに注射器を接続します
   。 注: カスタムメイド流体チャンバーが計測器の光学パスを通して試料の一貫した流れを許可するために竣工しました。詳細については、結果 を参照してください。実験前に試料室のすべてのコンポーネントは、オートクレーブによる滅菌する必要があります
。
3. フロー継続的にシリンジ ポンプを使用して試料室を通して注射器からサンプル
   。 注: 適切な流量が異なります路寸法、目的のスループットとデータ取得制限します
。
4. は、サンプルは、サンプル室に流れるとは、適切なフレーム レートで連続してホログラムを取得します。どのログ データ分析 (プロトコル セクション 4) 中に後で使用する各画像の時間をキャプチャ時刻スタンプ ファイルが作成されます。常温 (23 ° C) すべてのホログラムを取得します。カメラの製造元によって提供される事前に C++ 実行可能ファイルを実行してホログラムを記録します
   。 注: 適切なフレーム レートは、流量を選択によって異なります。この実験のため細菌が視覚化されるようにフレーム レートを使用することは勧め > 楽器を越えた 2 倍 ' s 視野
。
5. DHM を通じてフローするサンプルの全体の 10 mL の十分な時間を許可します
。 細菌が育っていない予防接種実験の間に死んでいることを確認して
6. 豊かに過ごしたメディア ポスト DHM イメージ キャプチャの 100 μ L でメディア プレート。滅菌スプレッダーと広がり、適切な温度で 24 時間インキュベート現在のコロニーをカウントします
。

4。細胞密度および検出限界の計算

1. 取得したホログラムの動画と細菌の存在のデータを分析します。
   1. は、ホログラムの時系列の中央のピクセル値を計算し、ホログラムで固定アーティファクトを除去するために、各画素からこの平均値を減算します。これが ImageJ で次の手順を実行することによって行われる場合があります:
      1. 32 ビット (イメージ型 32 ビット) に変換する
      2. 計算する中央値 (画像スタック Zproject メディアン)
      3. スタック (の残りの部分から中央値を減算Process-ImageCalculator-Subtract)
   2. 目に見える風通しの良いリングとフォーカスでセルの数をカウント手動で。これは、ImageJ でポイント ツールでオブジェクトを指して、
   。
   3. ホログラムの各シリーズ (ホログラム取得時に記録されて) タイムスタンプ ファイル伴われます。使用イメージ時点で励起されたサンプルの合計金額を計算するタイム スタンプ ファイルをキャプチャーした
   。
2. イメージ サンプルの総量で検出されたセルの合計数で割って細胞密度を計算します。正確な統計量のための 5 から 10 フレームを平均します
。

5。画像の振幅と位相を再構成

1. 選択代表ビデオ フレームごと 10 200 セルを持つ。生 (減算、中央) ホログラムを読み込む復元ソフトウェア (例: 伝搬 ImageJ 数値 ³⁹;シャンプー [GitHub]).
   1. を用いた ImageJ、OD 数値伝搬数値回折へ
   。
   2. プロンプトで実際または仮想イメージを選択し、正弦波騒音機能にフーリエ マスクを描画します
   。
   3. 復興距離を入力して振幅と位相での適切な z 手順を再構築します
   。
2. 中央 4.1.1 のようにノイズを低減する振幅データを減算します
。
3. 3 d プロット データ キューブまたは投影。プラグインに移動 — ボリューム ビューアーします
。

結果

結果は、DHM によって、非常に低いレベルでの生活、死んで細菌を検出する能力を示す必要があります。細菌カウント数はピープル ハウザー カウント室とプレート カウントを使用して得られた結果と一致してはずです。標準的な統計的手法は、様々 な細菌濃度の異なる検出法の精度についての情報を提供します。

ディスカッション

ホログラムの数値復元: ホログラムの数値復元、角度スペクトル法 (ASM) が使用されます。DHM のグリーン関数とホログラムの畳み込みが含まれます。特定焦点面での映像の複雑な波面は、次のようにフーリエ畳み込み定理を用いて計算できます。

(1)

どこ

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Yeast	BD Biosciences	212750
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7710	Many options for purchase
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
10 cm Petri dishes	VWR	10053-704
15 mL culture tubes	Falcon (Corning Life Sciences)	352002	Loose-capped
Petroff-Hauser chamber	Electron Microscopy Sciences	3920
10 mL syringes	BD Biosciences	309604	Luer-Lok tip not necessary
Male Luer to 1/16” barbed fitting	McMaster-Carr	51525K291
Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow	Nalgene	8000-0004	Sold by length, purchase accordingly
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000
Sample Chamber	Custom	n/a	See Materials Section
Holographic Microscope	Custom	n/a	See Wallace et al.
Open-source software	Custom	https://github.com/bmorris3/shampoo