パラフィン埋め込まれた 3 D 神経膠腫 Neurosphere 文化に免疫組織化学による神経膠腫におけるバイオ マーカーの評価

要約

3 D 文化として成長した神経幹細胞は神経膠腫の生物学を勉強するための強力なツールを構成します。パラフィン包埋による神経膠腫細胞の 3次元構造を維持しながら免疫を実行するプロトコルをご紹介します。このメソッドは、幹細胞性など神経分化神経膠腫 neurosphere 特性評価できます。

要約

神経膠腫におけるタンパク質発現の解析、その病理学の研究ではいくつかの側面に関連しています。多くの蛋白質は、バイオ マーカー、診断、予後、分類、腫瘍の進行の状態や細胞分化状態のアプリケーションとして記載されています。これらのバイオ マーカーの分析また神経膠腫患者および神経膠腫モデルから生成された腫瘍細胞 (NS) の特性評価に便利です。腫瘍の NS は、そこから派生し、ミラー神経膠腫の生物学をすることができますより正確に腫瘍のさまざまな機能を評価するために貴重な生体外モデルを提供します。腫瘍 NS のバイオ マーカーを分析する詳細な方法について述べるここ NS パラフィン埋め込まれた腫瘍の免疫組織染色 (IHC) を使用します。

概要

神経膠腫は、プライマリ¹世界保健機関によると彼らの表現型と遺伝子型の特性によって分類される中枢神経系腫瘍です。この分類には、バイオ²の魅力的なソースを表すドライバー変異の有無が組み込まれています。バイオ マーカーは、生物学的特性、測定および薬理学的治療的介入³レスポンスと同様、正常および病的プロセスを示す評価することができます。バイオ マーカーを検出することができます腫瘍、神経膠腫由来細胞のさまざまな側面での生物学的特性を有効にします。神経膠腫のバイオ マーカーなどが変異イソクエン酸脱水素酵素 1 (IDH1) 変異体酵素より良い予後⁴に関連付けられている低学年の神経膠腫の特徴です。変異 IDH1 TP53 と α サラセミア ・精神遅滞症候群 X リンク (ATRX) との組み合わせで発現される-^4,5サブタイプの特定神経膠腫を定義する変異を不活化します。ATRX 不活性化突然変異はまた小児の悪性グリオーマ^2,6の 44% で発生し、積極的な腫瘍とゲノム不安定性^6,7に関連付けられています。さらに、組み込み小児びまん性橋グリオーマ (DIPG) は、ヒストン H3 遺伝子 H3F3A、または HIST1H3B/C 遺伝子^1,6K27M 突然変異の有無によるとサブグループで区別されます。したがって、分子特性の導入により細分化、研究、およびより多くの開発を使用すると、別のエンティティとして神経膠腫の治療標的療法各サブタイプ。⁸アポトーシス、オートファジー⁹、細胞周期進行¹⁰、細胞増殖¹¹、細胞分化^{12 などの別の生物学的過程を評価するバイオ マーカーの解析を使用ことができますさらに、}.

人間のがんに遺伝的病変を抱く遺伝子組み換えの動物モデルは、病気の進行を仲介するシグナリングパスの研究のために重要です。当研究室は、ひと神経膠腫サブタイプ^13,14を要約するだろう特定の突然変異をかくまっている神経膠腫の遺伝子組み換えマウス ・ モデルを開発する睡眠美容 (SB) トランスポザーゼ システムの使用を実装しています。これらの遺伝子改変マウスのモデルは、腫瘍由来の NS は、3 D システムでの in vitro研究を有効にするを生成するため使用され、腫瘍原¹⁵でミラーリングの顕著な特徴を提示します。また、マウスに NS の orthotopical 移植は、原発腫瘍の機能を保持し、対応する原発¹⁵の病理組織学的、ゲノム、および表現型特性を模倣する二次性腫瘍を生成できます。

無血清培養幹細胞性脳腫瘍細胞を濃縮することができますと表皮の成長因子 (EGF)、繊維芽細胞成長因子 (FGF) の存在下で彼らは、NS 文化などの単一細胞由来植民地として成長できます。この選択的培養システムでほとんど差別化や差別化された細胞急速には死ぬ、幹細胞は分割し、細胞集塊を形成するのに対し。これは、神経膠腫腫瘍機能^16,17,18を保持する NS 文化の生成可能です。神経膠腫の NS は、腫瘍生物学、バイオ マーカー、診断、予後、分類、腫瘍の進行の状態や細胞分化状態にアプリケーションの分析を含むいくつかの側面を評価する使用できます。ここでは、我々 の神経膠腫 NS を生成し、3 D の文化に使用されるパラフィン埋め込むプロトコル詳細 IHC 染色。修正とグリオーマ NS を埋め込みの利点の 1 つは NS の形態が、従来 cytospin 法¹⁹の神経膠腫で NS 細胞解離の操作をストレスにさらされ、扁平になると比較してより良いが維持されます。さらに、遺伝子組み換え腫瘍蛍光スペクトルにわたって染色の有効化、NS から内因性蛍光式を消光を埋め込みます。このメソッドの全体的な目標は、プロセスを埋め込むパラフィンによる神経膠腫細胞の 3 D 構造を維持し、免疫組織染色による神経膠腫細胞の特性です。

プロトコル

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ミシガン大学によって承認されています。

1. 脳腫瘍神経幹細胞に由来するマウス モデルの生成

1. 解剖手順の前に神経幹細胞メディアの準備 (NSC メディア: 1 x B27 サプリメント、1 つ x N2 の補足、1 x normocin、および 1 x 抗生物質/抗真菌遺伝子組換えヒト EGF や 20 ng/mL の濃度で basic FGF によって補足で DMEM/f12 キー)。NSC メディアの 300 μ L で 1.5 mL チューブを記入し、後でのために予約します。
2. 大きい腫瘍を持つマウスを選択します。
   注: プラスミッドまたはウイルス注入ルシフェリンをエンコードする場合、腫瘍のサイズは発光によって監視できます。大きな腫瘍は、> 10⁶光子/s/cm²/sr の発光を持ちます。
3. イソフルランの過剰摂取とマウスを安楽死させる: イソフルランとティッシュ ペーパーを注入し、炎症を防ぐためにマウスとの直接接触を避ける euthanization チャンバー内の組織をご紹介します。ペダル反射 (通常 5-10 分) を表示しない、マウスまで待ちます。マウスの首をはねるし、Calinescuらで説明するように、脳を解剖¹³。
4. 腫瘍は蛍光、脳内腫瘍を識別するために蛍光ランプを搭載した解剖顕微鏡を使用します。微細鉗子で正常な脳組織から腫瘍径 (通常 5-7 mm) を解剖します。
5. NSC メディア (手順 1.1) を 1.5 mL チューブに切り裂かれた腫瘍を配置します。穏やかな圧力を適用することによって、微量遠心チューブの壁にフィットする使い捨てプラスチック杵で腫瘍を均質化します。
6. 細胞塊を解離解離酵素無料メディアの 1 つの mL を追加し、37 ° C で 5 分間インキュベート
7. 細胞懸濁液を 70 μ m セル ストレーナー フィルターし、20 ml の NSC メディアのストレーナーを洗浄します。
8. 5 分間 300 × g で遠心、上清をデカント、6 mL やペレットのサイズに応じて、NSC メディアの 15 mL にペレットを再中断します。
9. 95% 空気と 5% CO₂の大気中の T-25 または T-75 培養用フラスコに組織文化のインキュベーターで 37 ° C で培養腫瘍細胞懸濁液をプレートします。
10. 3 日後健康的な中断された NS を転送、再 T-25 または T-75 培養フラスコにそれらをプレートします。必要に応じて、文化に NSC メディアを追加します。
    注: 通常細胞の混合された人口がある、いくつかは死んでいるだろう、いくつかが付いているが、いくつかはメディアに浮いている NS を形成します。

2. 維持と NS を継

注: は、増殖を防ぎ、比較的高密度の細胞を維持します。合流は、球のサイズ (大きい球平均増殖の黒センター) によって決定されます。NS の成長率は、腫瘍を生成に使用される遺伝子に依存します。

1. 一度 NS 文化の confluency に達している、滅菌遠心管中文化を収集し、5 分の 300 x g で NS をペレットします。
2. 上澄みを廃棄細胞剥離液の 1 mL を追加して、ピペットの餌を再停止します。
3. 細胞解離を支援する 2 分毎 5 分、チューブをフリックの 37 ° C で孵化させなさい。
   注: NS の confluency に達すると、通常見られる肉眼的小さな白球として。細胞解離を保証するために、少なくともすべての目に見える NS が消えている必要があります。
4. HBSS 1 5 ml x とピペット数回。300 x g で 5 分間細胞ペレットは、上澄みを廃棄します。再 NSC 培地組換え EGF と FGF の基本の 5 mL にペレットを中断します。
5. 95% 空気と 5% CO₂の大気と NSC メディアと文化 T-75 フラスコ培養のインキュベーターで 37 ° c で 15 mL にセルの 1 つの mL を追加します。
6. 3 日おきに成長因子 (EGF および basic FGF) を追加します。メディア ターン ライト オレンジとセルまだはない合流、メディアを変更します。これを行うには、4 分の 300 x g で NS を遠心し、再成長因子を添加した NSC メディアで中断します。
   注: セルは形成されるペレットのサイズ、に応じて詳細フラスコに分割する必要があります。

3. 長期保存用 NS を凍結

1. NS 文化がコンフルエントになったら、手順 2.1 2.4 で説明されているように細胞を切り離します。ペレットを再 HBSS で中断されたら、因数を削除し、セルをカウントします。
2. 4 分の 300 x g で細胞を遠心し、上清中の可能な限り削除します。
3. 再凍結媒体 (FBS の熱不活化、10 %dmso) でペレットを中断します。1 x 10 の⁶と 1 mL バイアルあたり 3 x 10 の⁶セル間を凍結することをお勧めします。
4. 最初氷にそれらを移すことによって-20 ° C にし、-80 ° C そして液体窒素貯蔵容器に次の日には、必要なとゆっくりとクールダウン バイアルして多くクリオバイアルで再浮遊細胞を分割します。

4. 腫瘍 NS の固定

1. 培養腫瘍細胞がコンフルエントになるまで 2-3 日の T-25 フラスコで NS (~ 3 x 10 の⁶セル)。少なくとも 1 つの T-25 合流フラスコから 15 mL の円錐管に腫瘍 NS を収集します。5 分間 300 x g でペレットします。
2. 10% ホルマリン 1 mL にペレットを再停止 10 分追加 5 ml 1 x HBSS の室温 (RT) で維持し、3.2 の手順で行われる細胞のペレットします。この手順をあと 1 回繰り返します。
3. 氷の上の餌を含んでいる 15 mL の円錐管を配置します。

5. パラフィン包埋腫瘍 NS の

1. 2% 暖かい液体 agarose の 500 μ L で再洗浄 NS ペレットを中断、ピペッティングで軽く混ぜます。
2. すぐに agarose 重合まで氷に agarose 埋め込まれた NS を配置します。NS をかくまっている agarose の部分を削除します。(図 2) を処理するティッシュのカセットに NS で重合 agarose の作品を配置します。
3. (自動パラフィン プロセッサを使用して) ティッシュの処理を続行し、埋め込み (埋め込み駅を使用して) パラフィンします。

6. NS のパラフィン包埋の区分

1. 風呂の水を 42 ° C に設定し、慎重に水平を確認する 2 つのペイント ブラシを使用してミクロトームの刃を挿入します。このブレードは、トリミングにのみ使用します。
2. ミクロトームのパラフィン ブロックを配置します。非利き手での各セクションの厚さを制御左側にあるレバーを押し下げます。30 μ m の厚みを示す 2 番目のストップ ボタンを押してください。
3. ブロックをトリミングを開始 (すなわち。、余分なパラフィンを削除) 試料の表面に到達するまで右手で粗のハンド ホイールを回すことによって。この時点で、トリムの厚さは 10 μ m または 5 μ m のいずれかを制御するレバーを放します。トリミングのサンプルの表面に達すると停止します。
4. 氷をアイス ボックスに入力し、パラフィン ブロックが氷の上に置くと、水が氷に直接触れるを防ぐ、パラフィン ブロックの周りの膜として機能するようだけで十分な水を追加します。20 分間氷の上のパラフィン ブロックを孵化させなさい。
5. 古いブレードを破棄し、区分のための新しいものを挿入します。ドライ ブロック、ミクロトームの上に置きます、ガーゼを使用しています。
6. 非支配的な手でパラフィン リボンを引くに使用されますカーブタイプ鉗子のペアを取得します。風呂の水にパラフィン リボンを転送する使用される右手の近くの湿ったペイント ブラシをしてください。高速で右手で粗のハンド ホイールを回すことによってセクションを開始ペース。パラフィン リボンを保持するのに左手で鉗子を使用します。
7. 湿気があるペイント ブラシを使用して、風呂の水にパラフィン リボンを転送します。
8. 表面的に 2 つのパラフィン切片の間に鉗子を配置し、離れて 2 つの部分を優しくプッシュによってセクションをバラバラにし、鉗子の曲線を使用します。
   注: この動き完全パラフィン セクションの表面にする必要があります。セクションを押さないでください。
9. 正荷電の接着顕微鏡スライド上に分けられたパラフィン切片をプッシュするのに湿ったペイント ブラシを使用します。
10. スライド ボックスでそれらを格納する前に化学のフードの中一晩乾燥してスライドを許可します。スライドの記憶域は、実行の汚れの種類に依存します。

7. 免疫 (IHC) パラフィン包埋 NS の

1. 金属ラックにスライドを配置し、20 分の 60 ° C にそれらをインキュベート パラフィンを溶かします。
2. RT で退避列車でスライドを deparaffinize: キシレン 5 分、2 分、2 分、2 分の 1 2 分 Hereon、脱イオン水 × 70% × 1 エタノール 95 %2 x エタノール 100 %2 x エタノール × 3 抗原検索まで水道水のスライドを維持、乾燥として非特異抗体の結合の原因となります。
3. クエン酸バッファー (10 mM クエン酸、0.05% 非イオン性洗剤、pH 6) 30 125 ° C でのスライドを孵化させなさい s、10 ° C、90 s。蒸留水で 5 回スライドを冷ます、すすぐ。
4. 30 分間 0.3% H₂O₂の RT でスライドを孵化させなさい。
5. 洗浄は洗浄液 (TBS で 0.025% 洗剤) 穏やかな攪拌を 5 分間で 3 回滑る。
6. RT でスライドをブロッキング溶液 (10% 馬血清、TBS に 0.1 %bsa) 30 分間インキュベートします。
7. 一次抗体希釈液 (TBS で 0.1 %bsa) の準備と一晩で 4 ° C 加湿チャンバー スライドを孵化させなさい。穏やかな攪拌と 5 分のためのバッファーを洗浄に 3 回スライドを洗います。
8. ビオチン化二次抗体の希釈液の調製と 1 h の RT でスライドを孵化させなさい。穏やかな攪拌と 5 分のためのバッファーを洗浄に 3 回スライドを洗います。
9. アビジン-ビオチン標識ペルオキシダーゼ複合を 30 分間暗闇の中で RT でスライドを孵化させなさい。穏やかな攪拌と 5 分のためのバッファーを洗浄に 3 回スライドを洗います。
10. 軽打 H₂O₂基板ブランドとここで室温 2-5 分のスライドを孵化させなさい
11. 3 回を水道水で洗い流してください。ディップ (1 〜 2 秒)、対比染色に、ヘマトキシリン液のスライドとクリアまで水道水でそれらをすすいでください。
12. 次のようにスライドを脱水: 2 分間蒸留水で孵化させなさい、80% エタノールで 3 回を浸し、2 回 2 分の 95% エタノールで孵化、2 回 2 分の 100% エタノールで孵化させなさいそして 3 回 3 分ずつのキシレンで。
13. Coverslip メディアをキシレン ベース マウントをスライド画像の準備ができるまで、RT で平らな面に乾燥して下さい。      注: 3, 3'-ジアミノベンジジン (軽打) 染色を行う場合、スライドで保存できます RT。ただし、免疫組織染色法を実行する場合のスライドする必要があります光退色を抑える-20 ° C で暗闇の中で格納されます。

結果

腫瘍の開発を監視および評価、腫瘍が NS を生成に必要なサイズに達した場合、生物発光を用いた腫瘍によって放出される発光を行った。これにより、(図 1Aと1 b) ホタルルシフェラーゼの発光信号で子犬と腫瘍の進行の伝達効率に関する研究。腫瘍の大きさは、1 x 10⁷光子/s/cm 2/sr (図 1B...

ディスカッション

この記事で詳細に説明してパラフィン埋め込まれた神経膠腫、NS で免疫組織化学を実行する汎用性と再現性のある方法脳原で成長している腫瘍細胞の特性の 3 D 構造を維持します。この手法は、ガラスやプラスチック表面にメッキのセルを使用して次の利点を所有している: 私) NS; の 3 D 構造の保全ii) 蛋白質の表現の分析前に細胞解離のストレスの回避iii) 遺伝子組み換え腫瘍蛍光スペ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated microtome blade HP35	Thermo Scientific	3150734
Microtome RM 2135	Leica	MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-aldrich	HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated	Dako	E0432	IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT	Biocare medical	BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
N-27 Supplement	ThermoFisher	A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
AGAROSE LE	GoldBio	A-201-1000
Genesee Sc. Corporation	Olympus 15 ml	21-103
Genesee Sc. Corporation	TC-75 treated Flask	25-209
Genesee Sc. Corporation	TC-25 treated Flask	25-207
DMEM/F12	Gibco	11330-057	NS media
HBSS	GibcoTM	14175-103	balanced salt solution
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse