Évaluation de biomarqueurs dans les gliomes par immunohistochimie sur la paraffine 3D gliome Neurosphère Cultures

Résumé

Neurospheres cultivés comme 3D cultures constituent un outil puissant pour étudier la biologie de gliome. Nous présentons ici un protocole pour effectuer l’immunohistochimie en conservant la structure 3D de gliome neurospheres par enrobage de paraffine. Cette méthode permet la caractérisation des propriétés neurosphère gliome tels que stemness et différenciation neurale.

Résumé

Analyse de l’expression de la protéine dans les gliomes est pertinente pour plusieurs aspects dans l’étude de sa pathologie. Nombreuses protéines ont été décrits comme biomarqueurs avec des applications dans le diagnostic, le pronostic, classement, état de la progression tumorale et état de différenciation cellulaire. Ces analyses de biomarqueurs sont également utiles pour caractériser les tumeurs neurospheres (NS) produit de patients de gliome et modèles de gliome. NS de tumeur fournissent un modèle précieux in vitro pour évaluer les différentes caractéristiques de la tumeur d'où ils proviennent et peuvent mieux miroir gliome biologie. Nous décrivons ici une méthode détaillée pour analyser des biomarqueurs dans la tumeur NS à l’aide de l’immunohistochimie (IHC) sur tumeur paraffine NS.

Introduction

Les gliomes sont des tumeurs solides primaires du système nerveux central classées selon leurs caractéristiques phénotypiques et génotypiques selon l' organisation mondiale de la santé¹. Cette classification comprend la présence ou l’absence de mutations de pilote, qui représentent une source attrayante de biomarqueurs². Biomarqueurs sont des caractéristiques biologiques qui peuvent être mesurés et évalués pour indiquer les processus normaux et pathologiques, ainsi que des réponses pharmacologiques à une intervention thérapeutique à³. Biomarqueurs peuvent être détectées dans les tissus tumoraux et cellules de gliome, ce qui permet sa caractérisation biologique sous différents aspects. Quelques exemples de biomarqueurs de gliome muté isocitrate déshydrogénase 1 (IDH1), une enzyme mutante caractéristique des gliomes de bas-grade associés meilleur pronostic⁴. IDH1 muté s’exprime souvent en combinaison avec TP53 et alpha-thalassémie/mental retardation syndrome lié à le X (ATRX)-inactivation des mutations, définissant un gliome spécifique du sous-type^4,5. Mutations inactivant ATRX également se produisent dans 44 % des gliomes de haut grade pédiatriques^2,6 et ont été associées à des tumeurs agressives et instabilité génomique^6,7. En outre, pédiatriques diffus intrinsèques pontines gliomas (DIPG) sont différenciés en sous-groupes selon la présence ou l’absence d’une mutation de K27M dans le gène H3F3A de l’histone H3, ou dans le gène HIST1H3B/C^1,6. Par conséquent, l’introduction de la caractérisation moléculaire permet la subdivision, étude et le traitement des gliomes comme des entités distinctes, ce qui permettra le développement de plus de plus des traitements pour chaque sous-type ciblés. En outre, l’analyse de biomarqueurs peut servir à évaluer les différents processus biologiques tels que l’apoptose⁸autophagie⁹, cycle cellulaire progression¹⁰, cellule prolifération¹¹et la différenciation des cellules¹² .

Des modèles animaux issus du génie génétique qui hébergent les lésions génétiques présentes dans les cancers humains sont essentiels pour l’étude de la signalisation des voies qui véhiculent la progression de la maladie. Notre laboratoire a mis en place l’utilisation du système transposase Sleeping Beauty (SB) pour développer des modèles de souris génétiquement modifiées de gliome hébergeant des mutations spécifiques qui récapitulent gliome humain sous-types^13,14. Ces modèles de souris génétiquement modifiées sont utilisées pour générer des dérivées de tumeurs NS, qui permettent des études in vitro dans un système 3D, mise en miroir des traits saillants présent dans les tumeurs in situ¹⁵. Aussi, la greffe d’orthotopical de NS chez la souris peut générer des tumeurs secondaires qui conservent les caractéristiques de la tumeur primitive et imitent les propriétés phénotypiques, génomiques et histopathologiques des tumeur primitive correspondante¹⁵.

Dans la culture sans sérum, cellules de tumeur du cerveau avec des propriétés de cellules souches peuvent être enrichies, et en présence de facteurs de croissance épidermiques (EGF) et facteurs de croissance fibroblastiques (FGF), ils peuvent être cultivés comme colonies de culture cellulaire unique comme cultures de NS. Dans ce système de culture sélective, la plupart des cellules de différenciation ou différenciées rapidement mourir, alors que les souches cellules se divisent et forment des amas cellulaires. Cela permet la génération d’une culture de NS qui maintient les gliomes tumeur caractéristiques^16,17,18. Gliome NS peut servir à évaluer plusieurs aspects de la biologie tumorale, y compris l’analyse de biomarqueurs qui ont des applications dans le diagnostic, le pronostic, classement, état de la progression tumorale et état de différenciation cellulaire. Ici, nous détaillons un protocole pour générer des gliomes NS et intégrer les cultures 3D en paraffine à utiliser pour la coloration de IHC. Un des avantages de la fixation et l’incorporation de gliome NS, c’est que la morphologie de la Nouvelle-Écosse est mieux maintenue par rapport au conventionnel cytospin méthode¹⁹, dans laquelle gliome NS sont soumis à des manipulations stressantes pour la dissociation cellulaire et deviennent aplaties. En outre, enrobage étanche toute expression de fluorophore endogène de tumeur génétiquement NS, ce qui permet une coloration dans les spectres de fluorescence. L’objectif général de cette méthode consiste à préserver la structure 3D des cellules de gliome par une paraffine intégrant les processus et permettre la caractérisation des gliomes neurospheres par immunohistochimie.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Michigan.

1. génération de Brain Tumor Neurospheres provenant d’un modèle de souris

1. Avant l’intervention de dissection, préparer des cellules souches neurales médias (Media NSC : DMEM/F12 avec 1 supplément de x B27, 1 x N2 supplément, 1 x normocin et 1 x antibiotique/antimycosiques additionné humaine recombinante EGF et basic-FGF à des concentrations de 20 ng/mL de chaque). Remplir un tube de 1,5 mL avec 300 µL de médias NSC et réserver pour plus tard.
2. Sélectionnez une souris avec une grande tumeur.
   Remarque : La taille d’une tumeur peut être surveillée par bioluminescence si le plasmide ou virus injecté encode luciférine. Habituellement, une grande tumeur a une bioluminescence de > 10⁶ photons/s/cm²/sr.
3. Euthanasier la souris avec une surdose d’isoflurane : infuser un papier de soie à l’isoflurane et introduire le tissu dans une chambre de l’euthanasie, en évitant tout contact direct avec les souris pour éviter les irritations. Attendez que les souris ne montrent pas un réflexe de pédale (habituellement 5-10 min). Décapiter la souris et disséquer le cerveau tel que décrit dans Calinescu et al. ¹³.
4. Si les tumeurs sont fluorescentes, utilisez un microscope à dissection équipé d’une lampe fluorescente pour identifier la masse de la tumeur dans le cerveau. Avec une pince fine, disséquer la tumeur (habituellement 5-7 mm de diamètre) du tissu cérébral normal.
5. Placer la tumeur disséquée dans le tube de 1,5 mL avec les médias de NSC (étape 1.1). Homogénéiser la tumeur avec un pilon en plastique jetable qui s’insère dans les parois du tube microcentrifuge en appliquant une légère pression.
6. Pour dissocier les amas de cellule, ajouter 1 mL de médias sans enzymes dissociation et incuber pendant 5 min à 37 ° C.
7. Filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule 70 µm et laver la crépine avec 20 mL de médias de la NSC.
8. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 6 ou 15 mL de médias de NSC, selon la taille de la pastille.
9. Plaque de la suspension de cellules de tumeur dans un flacon de culture T-25 ou T-75 et de la culture à 37 ° C dans un incubateur de culture de tissus avec une atmosphère de 95 % air et 5 % de CO₂.
10. Après 3 jours, transférer le NS suspension sain et re-plaque eux dans une fiole de culture de tissus T-25 ou T-75. Si nécessaire, ajoutez plus de médias NSC à la culture.
    Remarque : Il n’y aura généralement une population mixte de cellules, certains seront morts, certains seront sont conformés et certains vont se former NS qui vont flotter dans les médias

2. Comment entretenir et passage de la NS

NOTE : Éviter la prolifération et maintenir les cellules à une densité relativement élevée. Confluence est déterminée par la taille des sphères (centre noir de grandes sphères surcroissance moyenne). Le taux de croissance de la NS dépendra des oncogènes utilisés pour générer des tumeurs.

1. Une fois que la culture de NS a atteint confluence, percevoir la culture dans un tube à centrifuger stérile et pellet le NS à 300 g pendant 5 min.
2. Jeter le surnageant, ajouter 1 mL de la solution de détachement cellulaire et pipette pour remettre en suspension l’extrait concentré.
3. Incuber à 37 ° C pendant 5 min, effleurant le tube toutes les 2 min pour aider la dissociation cellulaire.
   Remarque : Quand NS rejoindre confluence, ils peuvent être généralement vus macroscopiquement comme des petites sphères blanches. Afin d’assurer la dissociation cellulaire, au moins tous les NS visibles doit avoir disparu.
4. Ajouter 5 mL de HBSS 1 x et la pipette plusieurs fois. Culot de cellules à 300 g pendant 5 min. éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans 5 mL de médias de NSC additionné de recombinants EGF et basic-FGF.
5. Ajouter 1 mL de cellules à 15 mL de NSC médias et la culture dans une fiole de T-75 à 37 ° C dans un incubateur de culture de tissus avec une atmosphère de 95 % air et 5 % de CO₂.
6. Ajouter des facteurs de croissance (EGF et basic-FGF) tous les 3 jours. Si les médias se tourne lumière orange et les cellules ne sont pas encore confluentes, changer les médias. Pour ce faire, centrifuger le NS à 300 g pendant 4 min et remettre en suspension dans les médias de NSC additionnés de facteurs de croissance.
   Remarque : Selon la taille de la pastille formée, cellules devrez peut-être être scindé en plusieurs flacons.

3. gel NS pour le stockage à long terme

1. Quand la culture NS devienne confluente, dissocier les cellules comme décrit aux points 2.1 à 2.4. Dès que le plomb a été re-suspendu dans HBSS, enlevez une partie aliquote et compter les cellules.
2. Centrifuger de cellules à 300 g pendant 4 min et retirer autant que possible du liquide surnageant.
3. Resuspendre le culot dans la congélation des médias (FBS inactivés par la chaleur, 10 % DMSO). Il est recommandé de geler entre 1 x 10⁶ et 3 x 10⁶ cellules / flacon / mL.
4. Diviser les cellules cryovials autant au besoin et lentement refroidir les coupes remises en suspension par la première de les transférer à la glace, puis à-20 ° C, puis à-80 ° C et enfin le lendemain à un conteneur de stockage d’azote liquide.

4. fixation de la tumeur NS

1. Tumeur de culture NS dans une fiole de T-25 pendant 2 ou 3 jours jusqu'à ce que les cellules sont confluentes (~ 3 x 10⁶ cellules). Recueillir tumeur NS dans un tube conique 15 mL un flacon confluentes moins d’un T-25. Pellet à 300 x g pendant 5 min.
2. Resuspendre le culot dans 1 mL de formol 10 % et conserver à température ambiante (RT) pendant 10 min. ajouter 5 mL de 1 x HBSS et les cellules comme fait à l’étape 3.2 de granule. Répétez cette étape une fois de plus.
3. Placer le tube conique 15 mL contenant le culot sur la glace.

5. paraffine plongement de tumeur NS

1. Resuspendre le culot de NS lavé dans 500 µL d’agarose liquide chaud de 2 % et mélanger doucement en pipettant également.
2. Placer immédiatement la NS d’agarose incorporé sur la glace jusqu'à ce que l’agarose polymérise. Retirer la pièce de l’agarose hébergeant le NS. Placer l’éprouvette d’agarose polymérisé avec le NS dans la cassette pour tissus traitement (Figure 2).
3. Continuer avec le traitement de tissus (à l’aide d’un processeur de paraffine automatique) et de paraffine embedding (à l’aide d’une station d’encastrement).

6. la section de la Nouvelle-Écosse de paraffine

1. Mettre le bain d’eau à 42 ° C et insérez la lame sur le microtome soigneusement à l’aide de deux pinceaux pour s’assurer que c’est de niveau. Utiliser cette lame que pour tailler.
2. Placez le bloc de paraffine sur le microtome. Avec la main non dominante, appuyez sur le levier situé sur le côté gauche qui contrôle l’épaisseur de chaque section. Appuyez sur pour la deuxième étape qui indique une épaisseur de 30 µm.
3. Commencer à tailler le bloc (i.e., enlever la paraffine excès) en tournant le volant à main grossière de la main droite jusqu'à ce que la surface de l’échantillon est atteinte. À ce stade, relâcher le levier qui contrôle l’épaisseur garniture à 10 μm ou 5 μm. Arrêter de tailler quand la surface de l’échantillon est atteint.
4. Remplir une glacière avec de la glace et ajouter juste assez d’eau pour que lorsque le bloc de paraffine est placé sur la glace, l’eau agit comme un film autour du bloc de paraffine, protégeant de toucher directement la glace. Incuber le bloc de paraffine sur la glace pendant 20 min.
5. Jeter la lame usagée et insérer un nouveau pour la coupe. Bloc sec à l’aide de gaze, puis placez-le sur le microtome.
6. Avec la main non dominante, obtenir une paire de pinces courbées qui serviront à tirer sur le ruban de la paraffine. Garder un pinceau humide près de la main droite, qui sera utilisé pour transférer le ruban de paraffine au bain-marie. Commencer à section en tournant le volant à main grossière de la main droite à un rapide rythme. Utilisez la pince dans la main gauche pour maintenir le ruban de la paraffine.
7. Le pinceau humide permet de transférer le ruban de paraffine au bain-marie.
8. La courbe de la pince permet de séparer les sections en superficiellement plaçant la pince entre deux sections de paraffine, puis en poussant les deux sections de suite doucement.
   Remarque : Cette motion doit être entièrement sur la surface de la section de la paraffine. N’appuyez pas vers le bas sur la section.
9. Utilisez le pinceau humide pour pousser les sections séparées de paraffine sur lames de microscope d’adhérence chargés positivement.
10. Laisser les lames sécher pendant la nuit à l’intérieur d’une hotte chimique avant leur stockage dans des boîtes de diapositive. Le stockage des lames dépend du type de tache effectuée.

7. l’immunohistochimie (IHC) de paraffine NS

1. Faire fondre la paraffine en plaçant les diapositives dans un support en métal et incuber à 60 ° C pendant 20 min.
2. Déparaffiner les diapositives par incubation dans un train de réhydratation à RT : 3 x xylène pendant 5 min, 100 % d’éthanol x 2 pour 2 min, éthanol à 95 % x 2 pour 2 min, éthanol à 70 % x 1 pendant 2 minutes et 1 x eau déionisée pour 2 min. point, garder les lames dans l’eau du robinet jusqu'à ce que la recherche d’antigène , comme le dessèchement provoquera des anticorps non-spécifiques.
3. Incuber les lames dans un tampon au citrate (acide citrique 10 mM, 0,05 % de détergent non ionique, pH 6) à 125 ° C pendant 30 s et à 90 ° C pendant 10 s. Laissez-les refroidir, puis rincer les lames 5 fois avec de l’eau distillée.
4. Incuber les lames à RT à 0,3 % H₂O₂ pendant 30 min.
5. Laver les diapositives 3 fois en mémoire tampon (0,025 % de détergent au SCT) pendant 5 min avec agitation douce de lavage.
6. Incuber les lames à RT avec bloquant la solution (sérum de cheval de 10 %, 0,1 % de BSA au SCT) pendant 30 min.
7. Incuber les lames pendant la nuit à 4 ° C dans une chambre humidifiée avec de l’anticorps primaire préparé en solution de dilution (0,1 % de BSA au SCT). Laver les diapositives 3 fois en mémoire tampon pendant 5 min avec agitation douce de lavage.
8. Incuber les lames à RT pendant 1 h avec l’anticorps secondaire biotinylé préparé en solution de dilution. Laver les diapositives 3 fois en mémoire tampon pendant 5 min avec agitation douce de lavage.
9. Incuber les lames à la RT dans l’obscurité pendant 30 min avec la peroxydase du raifort avidine-biotinylé complexe. Laver les diapositives 3 fois en mémoire tampon pendant 5 min avec agitation douce de lavage.
10. Incuber les lames avec DAB-H₂O₂ substrat marques ici pour 2 à 5 min à température ambiante.
11. Rincer 3 fois avec de l’eau du robinet. Tremper (1-2 s) des diapositives dans la solution de l’hématoxyline à contre-coloration et rincez-les soigneusement à l’eau du robinet jusqu'à la clairière.
12. Déshydrater les diapositives comme suit : incuber dans l’eau distillée pendant 2 min, 3 fois de plonger dans l’éthanol à 80 %, incuber dans l’éthanol à 95 % 2 fois pendant 2 min de chaque, incuber dans l’éthanol 100 % 2 fois pendant 2 min chacune et enfin dans le xylène 3 fois pendant 3 min chaque.
13. Lamelle couvre-objet les diapositives avec un support de montage à base de xylène et laissez-les sécher sur une surface plane à la droite, jusqu'à ce qu’ils sont prêts pour l’imagerie.       Remarque : Si vous effectuez 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) coloration, les lames peuvent être stockés à température ambiante. Toutefois, si immunofluorescence souillant est effectuée, diapositives doivent être conservés dans l’obscurité à-20 ° C pour réduire les photos-blanchiment.

Résultats

Pour suivre le développement de tumeurs et d’évaluer si la tumeur a atteint la taille nécessaire pour générer les NS, nous avons analysé la luminescence émise par des tumeurs à l’aide de bioluminescence. Ceci permet l’étude de l’efficacité de la transduction dans les chiots et la progression tumorale par le signal de la luminescence de la luciférase (Figure 1A et 1 b). Lorsque la taille de la tumeur atteint...

Discussion

Dans cet article, nous détaillons une méthode reproductible et polyvalente pour exécuter immunohistochimie sur gliomes de paraffine NS, qui maintiennent la structure 3D caractéristique des cellules tumorales qui poussent dans le cerveau in situ. Cette technique possède les avantages suivants par rapport à l’aide de cellules plaqués sur les surfaces en plastique ou de verre : J’ai) la préservation de la structure 3D de la Nouvelle-Écosse ; II) en évitant de stress de dissociation cellulaire avant ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated microtome blade HP35	Thermo Scientific	3150734
Microtome RM 2135	Leica	MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-aldrich	HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated	Dako	E0432	IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT	Biocare medical	BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
N-27 Supplement	ThermoFisher	A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
AGAROSE LE	GoldBio	A-201-1000
Genesee Sc. Corporation	Olympus 15 ml	21-103
Genesee Sc. Corporation	TC-75 treated Flask	25-209
Genesee Sc. Corporation	TC-25 treated Flask	25-207
DMEM/F12	Gibco	11330-057	NS media
HBSS	GibcoTM	14175-103	balanced salt solution
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse