Avaliação de biomarcadores em Glioma por imuno-histoquímica na parafina Glioma 3D Neurosphere culturas

Resumo

Neurospheres crescidos como 3D culturas constituem uma poderosa ferramenta para estudar a biologia de glioma. Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar a imuno-histoquímica, mantendo a estrutura 3D de glioma neurospheres através da incorporação de parafina. Esse método permite a caracterização das propriedades de glioma neurosphere como stemness e diferenciação neural.

Resumo

Análise da expressão da proteína no glioma é relevante para vários aspectos no estudo da sua patologia. Inúmeras proteínas têm sido descritas como biomarcadores com aplicações no diagnóstico, prognóstico, classificação, estado de progressão do tumor e estado de diferenciação da célula. Essas análises de biomarcadores também são úteis para caracterizar o tumor neurospheres (NS) gerados a partir de pacientes de glioma e modelos de glioma. Tumor NS fornecem um modelo valioso em vitro para avaliar diferentes características do tumor do qual eles são derivados e podem com mais precisão o espelho glioma biologia. Aqui nós descrevemos um método detalhado para analisar biomarcadores em tumor NS usando imuno-histoquímica (IHC) tumor de parafina NS.

Introdução

Gliomas são tumores sólidos primários do sistema nervoso central, classificadas por suas características fenotípicas e genotípicas de acordo com a Organização Mundial de saúde¹. Esta classificação incorpora a presença ou ausência de mutações do motorista, que representam uma fonte atraente de biomarcadores². Biomarcadores são características biológicas que podem ser medidas e avaliadas para indicar processos normais e patológicos, bem como respostas farmacológicas para uma intervenção terapêutica³. Biomarcadores podem ser detectados no tecido do tumor e células derivadas de glioma, permitindo a sua caracterização biológica em diferentes aspectos. Alguns exemplos de biomarcadores de glioma mutante isocitrato desidrogenase 1 (IDH1), uma enzima mutante característica de gliomas de baixo grau associadas a melhor prognóstico⁴. IDH1 mutado é expressa frequentemente em combinação com TP53 e síndrome de deficiência de alfa-talassemia/mental ligada ao X (ATRX)-Inactive mutações, definindo um glioma específico de subtipo^4,5. ATRX-inactivar as mutações também ocorrem em 44% dos gliomas de alto grau pediátrica^2,6 e têm sido associadas com tumores agressivos e instabilidade genômica^6,7. Além disso, pediátricas gliomas Pontinas intrínsecas difusas (DIPG) são diferenciadas em subgrupos de acordo com a presença ou ausência de uma mutação K27M no gene de histona H3 H3F3A, ou no gene^1,HIST1H3B/C⁶. Portanto, a introdução de caracterização molecular permite a subdivisão, estudo e tratamento de gliomas como entidades separadas, o que permitirá mais o desenvolvimento de mais direcionados a terapias para cada subtipo. Além disso, a análise de biomarcadores pode ser usada para avaliar diferentes processos biológicos, tais como apoptose⁸, autofagia⁹, de progressão do ciclo celular¹⁰, proliferação de célula¹¹e diferenciação celular¹² .

Modelos de animais geneticamente modificados que abrigam as lesões genéticas presentes em cânceres humanos são fundamentais para o estudo da sinalização de caminhos que medeiam a progressão da doença. Nosso laboratório implementou o uso do sistema de transposase beleza dormindo (SB) para desenvolver modelos de rato geneticamente modificados de glioma abrigando mutações específicas que recapitular glioma humano subtipos^13,14. Estes modelos de rato geneticamente modificados são usados para gerar tumor derivado NS, que permitem estudos em vitro em um sistema 3D, espelhamento principais características presentes nos tumores in situ¹⁵. Além disso, o transplante de orthotopical de NS em ratos pode gerar tumores secundários que retêm características do tumor primário e imitam as propriedades fenotípicas, genômicas e histopatológicas do tumor primário correspondente¹⁵.

Em cultura livre de soro, células de tumor cerebral com propriedades de célula-tronco podem ser enriquecidas, e na presença de fatores de crescimento epidérmico (EGF) e fatores de crescimento do fibroblasto (FGF), eles podem ser crescidos como colônias única derivado de células, tais como culturas de NS. Neste sistema de cultura seletiva, a maioria das células de diferenciação ou diferenciados rapidamente morrer, Considerando que as células-tronco dividir e formar os grupos celulares. Isto permite a geração de uma cultura de NS que mantém glioma tumor características^16,17,18. Glioma NS pode ser usado para avaliar diversos aspectos da biologia do tumor, incluindo a análise de biomarcadores que têm aplicações em diagnóstico, prognóstico, classificação, estado de progressão do tumor e estado de diferenciação da célula. Aqui, detalhamos um protocolo para gerar glioma NS e incorporar as culturas 3D em parafina a ser usado para coloração de IHC. Uma vantagem da fixação e incorporação de glioma NS é que a morfologia do NS é mantida melhor em comparação ao convencional cytospin método¹⁹, no qual glioma NS estão sujeitos à manipulação estressante para dissociação da célula em tornam-se achatados. Além disso, a incorporação sacia qualquer expressão de fluoróforo endógena de tumor geneticamente NS, permitindo que a coloração em todo o espectro fluorescente. O objectivo geral deste método é para preservar a estrutura 3D de células de glioma através de uma processo de incorporação de parafina e permitir a caracterização de glioma neurospheres usando imuno-histoquímica.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Michigan e institucional Cuidado Animal.

1. geração de Neurospheres de Tumor de cérebro derivado de um modelo de Mouse

1. Antes do procedimento de dissecação, preparar a mídia de células-tronco neurais (NSC Media: DMEM/F12 com 1 suplemento de x B27, 1 x N2 suplemento, 1 x normocin e 1 x antibiótico/antimicótico suplementado com humano recombinante EGF e basic-FGF em concentrações de 20 ng/mL cada). Encher um tubo de 1,5 mL com 300 µ l de mídia NSC e reservar para mais tarde.
2. Selecione um rato com um grande tumor.
   Nota: O tamanho de um tumor pode ser monitorado por bioluminescência se o plasmídeo ou vírus injetado codifica luciferina. Geralmente, um grande tumor tem uma bioluminescência de > 10⁶ fótons/s/cm²/sr.
3. Eutanásia o mouse com uma overdose de isoflurano: infundir um papel de tecido com isoflurano e introduzir o tecido em uma câmara de eutanásia, evitando o contato direto com os ratos para evitar a irritação. Espere até que os ratos não mostram um reflexo pedal (geralmente 5-10 min). Decapitar o mouse e dissecar o cérebro conforme descrito em Calinescu et al ¹³.
4. Se os tumores são fluorescentes, use um dissecação microscópio equipado com uma lâmpada fluorescente para identificar a massa tumoral dentro do cérebro. Com a pinça fina, disse o tumor (geralmente de 5 a 7 mm de diâmetro) no tecido cerebral normal.
5. Coloque o tumor dissecado no tubo de 1,5 mL com mídia NSC (etapa 1.1). Homogeneizar o tumor com um pilão de plástico descartável que se encaixa as paredes do tubo microcentrifuga aplicando uma pressão suave.
6. Para dissociar as touceiras de célula, adicione 1 mL de mídia livre de enzima dissociação e incubar durante 5 min a 37 ° C.
7. Filtrar a suspensão através de um filtro de célula 70 µm e lavar o filtro com 20 mL de mídia NSC.
8. Centrifugar a 300 x g por 5 min, decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 6 mL ou 15 mL de mídia do NSC, dependendo do tamanho da pelota.
9. Placa da suspensão de células de tumor em um frasco de cultura T-25 ou T-75 e cultura a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos, com uma atmosfera de 95% de ar e 5% CO₂.
10. Depois de 3 dias, transferir o NS suspenso saudável e re-placa-los em um frasco de cultura de tecidos T-25 ou T-75. Se necessário, adicione mais mídia NSC para a cultura.
    Nota: Normalmente, haverá uma população mista de células, alguns estarão mortos, alguns vão ter aderido e algumas vão ser formando NS que irá flutuar na mídia

2. manutenção e passagem do NS

Nota: Prevenir o crescimento excessivo e manter as células em densidade relativamente alta. Confluência é determinada pelo tamanho de esferas (pretos centros de grandes esferas supercrescimento de média). A taxa de crescimento do NS dependerá as oncogenes usados para gerar tumores.

1. Uma vez que a cultura de NS alcançou a confluência, pelota o NS a 300 x g por 5 min e coletar a cultura num tubo de centrífuga estéril.
2. Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 mL da solução de desprendimento de célula Pipetar para Ressuspender o pellet.
3. Incube a 37 ° C por 5 min, passando rapidamente o tubo cada 2 min para ajudar a dissociação de célula.
   Nota: Quando NS alcançar confluência, eles podem ser normalmente vistos macroscopicamente como pequenas esferas brancas. Para assegurar a dissociação de célula, pelo menos todos os NS visíveis deve ter desaparecido.
4. Adicionar 5 mL de HBSS 1 x e pipeta várias vezes. Pellet de células a 300 x g, durante 5 min. descartar o sobrenadante. Ressuspender o pellet em 5 mL de mídia NSC suplementada com recombinante EGF e basic-FGF.
5. Adicione 1 mL de células para 15 mL de NSC mídia e cultura num balão de T-75 a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos, com uma atmosfera de 95% de ar e 5% CO₂.
6. Adicione fatores de crescimento (EGF e basic-FGF) a cada 3 dias. Se a mídia se transforma luz laranja e as células ainda não são confluentes, mudar os meios de comunicação. Para fazer isso, centrifugar o NS a 300 x g, durante 4 min e ressuspender em mídia NSC suplementada com fatores de crescimento.
   Nota: Dependendo do tamanho da pelota formado, células podem precisar ser dividido em mais balões.

3. NS de congelamento para armazenamento a longo prazo

1. Quando a cultura NS se tornar confluente, dissocia as células como descrito nos passos 2.1-2.4. Uma vez que o sedimento foi re-suspenso em HBSS, retirar uma alíquota e contar as células.
2. Centrifugar as células em 300 x g, durante 4 min e remover o máximo possível do líquido sobrenadante.
3. Ressuspender o pellet em congelamento mídia (FBS inactivados por calor, 10% DMSO). É aconselhável congelar entre 1 x 10⁶ e 3 x 10⁶ células por frasco por mL.
4. Divida as células re-suspensas em tantas cryovials como necessários e lentamente arrefecer os frascos pela primeira transferi-las para gelo, então a-20 ° C, então a-80 ° C e, finalmente, no dia seguinte para um recipiente de armazenamento de nitrogênio líquido.

4. fixação do Tumor NS

1. Tumor de cultura NS num balão de T-25 por 2-3 dias até que as células são confluentes (~ 3 x 10⁶ células). Recolha o tumor NS em um tubo cônico de 15 mL de um frasco confluente menos de um T-25. Pelota a 300 x g por 5 min.
2. Ressuspender o pellet em 1 mL de formol a 10% e manter à temperatura ambiente (RT) por 10 min. adicionar 5 mL de 1 x HBSS e as células como feito no passo 3.2 de Pelotas. Repita essa etapa mais uma vez.
3. Coloque o tubo cônico de 15 mL, contendo a pelota no gelo.

5. parafina incorporação de Tumor NS

1. Ressuspender o pellet NS lavado em 500 µ l de 2% de agarose líquido morno e misture suavemente pipetando.
2. Coloca imediatamente o NS de agarose-incorporado no gelo até se polimeriza a agarose. Retire o pedaço de agarose abrigando o NS. Coloque o pedaço de agarose polimerizado com o NS na gaveta para tecido de transformação (Figura 2).
3. Continuar com o processamento do tecido (usando um processador automático de parafina) e incorporação de objetos (usando uma estação de encaixe) de parafina.

6. corte de parafina NS

1. Definir o banho-maria a 42 ° C e coloque a lâmina sobre o micrótomo com cuidado, usando dois pincéis para certificar-se de que está nivelado. Use esta lâmina apenas para aparar.
2. Coloque o bloco de parafina no micrótomo. Com a mão não dominante, pressione a alavanca localizada no lado esquerdo que controla a espessura de cada seção. Pressione para a segunda parada que indica uma espessura de 30 µm.
3. Começar a aparar o bloco (i. e., removendo o excesso parafina) girando a roda de mão grossa com a mão direita até atingir a superfície da amostra. Neste ponto, solte a alavanca que controla a espessura guarnição a 10 μm ou 5 μm. Pare de aparar quando a superfície da amostra é alcançada.
4. Preencher uma caixa de gelo com gelo e adicione água suficiente apenas para que quando o bloco de parafina é colocado no gelo, a água atua como um filme em torno do bloco de parafina, protegendo-o de tocar diretamente o gelo. Incube o bloco de parafina no gelo por 20 min.
5. Descarte a lâmina velha e inserir um novo para a corte. Bloco seco usando gaze, coloque-o sobre o micrótomo.
6. Com a mão não dominante, obter um par de pinças curvas que serão usados para puxar a fita de parafina. Manter um pincel úmido perto da mão direita, que será usado para transferir a faixa de opções de parafina para banho. Começar a seção girando a roda de mão grossa com a mão direita em um rápido ritmo. Use a pinça na mão esquerda para segurar a fita de parafina.
7. Use o pincel úmido para transferir a fita de parafina para o banho de água.
8. Use a curva da pinça para separar as seções superficialmente colocando a pinça entre as duas secções de parafina, e pressionando as duas seções fora delicadamente.
   Nota: Este movimento deve ser totalmente sobre a superfície da seção de parafina. Não pressione a seção.
9. Use o pincel úmido para empurrar as seções separadas de parafina em corrediças do microscópio de adesão carregadas positivamente.
10. Permitir que os slides para secar durante a noite dentro de uma capa de química antes de armazená-los em caixas de slide. O armazenamento de slides depende do tipo de mancha realizada.

7. imuno-histoquímica (IHC) de parafina NS

1. Derreta parafina colocando os slides em uma cremalheira do metal e incubando-os a 60 ° C por 20 min.
2. Deparaffinize os slides de incubação em um trem de reidratação em RT: 3x xileno por 5 min, 100% de etanol x 2 para 2 min, etanol a 95% x 2 para 2 min, etanol a 70% 1 x por 2 min e 1 x água desionizada para 2 min. Hereon, manter as lâminas em água da torneira até a recuperação do antígeno , como secagem causará a ligação do anticorpo específico.
3. A incubar em tampão citrato (ácido cítrico de 10mm, 0,05% de detergente não-iônico, pH 6) a 125 ° C por 30 s e 90 ° c, durante 10 s. Deixe-as arrefecer e, em seguida, enxágue as lâminas 5 vezes com água destilada.
4. Incube em RT em 0,3% H₂O₂ por 30 min.
5. Lave as lâminas 3 vezes no tampão (0.025% de detergente na TBS) por 5 min com agitação suave de lavagem.
6. A incubar em RT com bloqueio de solução (soro de cavalo de 10%, 0,1% BSA em TBS) por 30 min.
7. A incubar durante a noite a 4 ° C, numa câmara umidificada com anticorpo primário, preparado em solução de diluição (0,1% BSA em TBS). Lave as lâminas 3 vezes no buffer para 5 min com agitação suave de lavagem.
8. Incube os slides no RT para 1 h com anticorpo secundário biotinilado, preparado em solução de diluição. Lave as lâminas 3 vezes no buffer para 5 min com agitação suave de lavagem.
9. Incube em RT no escuro por 30 min com peroxidase de rábano avidina-biotinilado complexo. Lave as lâminas 3 vezes no buffer para 5 min com agitação suave de lavagem.
10. Incubar as lâminas com DAB-H₂O₂ substrato marcas aqui durante 2-5 min à RT
11. Lavar 3 vezes com água da torneira. Mergulho (1-2 s) as lâminas em solução de hematoxilina de counterstain e enxague bem em água corrente até a clareira.
12. Desidratar os slides como segue: incubar em água destilada por 2 min, mergulhe 3 vezes em 80% de etanol, incubar em etanol a 95% 2 vezes por 2 min cada, incubar em etanol 100% 2 vezes por 2 min cada e finalmente em xilol 3 vezes por 3 min cada.
13. Lamela dos slides com um meio de montagem baseada em xileno e deixe-os secar sobre uma superfície plana em RT até que estejam prontos para a imagem latente.       Nota: Se executar 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) coloração, as lâminas podem ser armazenadas no RT No entanto, se a mancha da imunofluorescência é executada, slides devem ser armazenados no escuro a-20 ° C para reduzir a foto-branqueamento.

Resultados

Para monitorar o desenvolvimento do tumor e avaliar se o tumor tiver atingido o tamanho necessário para gerar NS, analisamos a luminescência emitida por tumores usando a bioluminescência. Isso permite que o estudo da eficiência de transdução nos filhotes e progressão do tumor pelo sinal da luminescência de luciferase (Figura 1A e 1B). Quando o tamanho do tumor atinge um sinal de 1 x 10⁷ fótons/s/cm2/RS (

Discussão

Neste artigo, detalhamos um método versátil e pode ser reproduzido para realizar a imuno-histoquímica na parafina glioma NS, que mantêm a estrutura 3D característica de células de tumor crescendo no cérebro em situ. Esta técnica possui as seguintes vantagens sobre usando células chapeadas em vidro ou superfícies de plástico: eu) preservação da estrutura 3D do NS; II) evitando stress de dissociação de célula antes da análise da expressão da proteína; III) têmpera de qualquer expressão de fluo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated microtome blade HP35	Thermo Scientific	3150734
Microtome RM 2135	Leica	MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-aldrich	HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated	Dako	E0432	IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT	Biocare medical	BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
N-27 Supplement	ThermoFisher	A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
AGAROSE LE	GoldBio	A-201-1000
Genesee Sc. Corporation	Olympus 15 ml	21-103
Genesee Sc. Corporation	TC-75 treated Flask	25-209
Genesee Sc. Corporation	TC-25 treated Flask	25-207
DMEM/F12	Gibco	11330-057	NS media
HBSS	GibcoTM	14175-103	balanced salt solution
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse