石蜡包埋三维胶质瘤神经球培养的免疫组织化学评价胶质瘤生物标志物

摘要

作为3d 培养体生长的神经球是研究胶质瘤生物学的有力工具。在这里, 我们提出了一个执行免疫组织化学的协议, 同时保持三维结构的胶质瘤神经球通过石蜡嵌入。这种方法可以描述胶质瘤神经球的性质, 如干细胞和神经分化。

摘要

胶质瘤蛋白表达分析与胶质瘤病理学研究有关。许多蛋白质被描述为生物标志物, 在诊断、预后、分类、肿瘤进展状态和细胞分化状态等方面都有应用。这些生物标志物的分析也有助于表征胶质瘤患者和胶质瘤模型产生的肿瘤神经球 (ns)。肿瘤 ns 提供了一个有价值的体外模型来评估不同的特征, 从中获得, 并能更准确地反映胶质瘤生物学。在这里, 我们描述了一个详细的方法来分析生物标志物在肿瘤 ns 使用免疫组织化学 (ihc) 石蜡嵌入肿瘤 ns。

引言

胶质瘤是根据世界卫生组织¹的表型和基因型特征分类的中枢神经系统的主要实体瘤。这种分类包括司机突变的存在或不存在, 这些突变代表了一个有吸引力的生物标志物^{来源 2}。生物标志物是生物特性, 可以测量和评估, 以表明正常和病理过程, 以及药理反应的治疗干预³。生物标志物可以在胶质瘤的肿瘤组织和细胞中检测到, 使其能够在不同的方面进行生物表征。胶质瘤生物标志物的一些例子包括突变的异氰酸酯脱氢酶 1 (idh1), 这是一种与预后较好相关的低度胶质瘤的突变酶特征⁴。突变 idh1 常与 tp53 和α-地中海贫血综合征 x-连锁 (atrx) 失活突变结合表达, 定义了特定的胶质瘤亚型 4^,5。atrx 失活突变也发生在44% 的儿童高级胶质瘤 ^2,6, 并已与攻击性肿瘤和基因组不稳定^6,7。此外, 在组织内 h3 基因 h3f3a 或 hist1hb 基因 1, 6 中, 根据 k27m 突变的存在或不存在, 在亚组中对小儿弥漫性内脑桥胶质瘤 (dipg) 进行分化。因此, 分子特征的引入允许将胶质瘤作为单独的实体进行细分、研究和治疗, 这将更允许为每个亚型开发更有针对性的疗法。此外, 生物标志物的分析可用于评估不同的生物过程, 如凋亡⁸、自体吞噬⁹、细胞周期^{进展 10}、细胞增殖¹¹和细胞分化¹².

基因工程动物模型, 窝藏人类癌症中存在的遗传病变是至关重要的信号路径的研究, 调解疾病的进展。我们的实验室已经实施了使用睡眠美容 (sb) 转相酶系统, 以开发基因工程小鼠模型的胶质瘤窝藏特定的突变, 重述人类胶质瘤亚型^13,14。这些基因工程小鼠模型用于生成肿瘤衍生 ns, 使其能够在三维系统中进行体外研究, 反映了原位¹⁵肿瘤中存在的显著特征。此外, 将 ns 移植到小鼠体内可以产生继发性肿瘤, 这些肿瘤保留原发肿瘤的特征, 并模仿相应原发肿瘤¹⁵的组织病理学、基因组和表型特性。

在无血清培养中, 具有干细胞特性的脑肿瘤细胞可以得到丰富, 在表皮生长因子 (egf) 和成纤维细胞生长因子 (fgf) 的存在下, 它们可以作为单一细胞衍生的菌落 (如 ns 培养) 生长。在这种选择性培养系统中, 大多数分化或分化的细胞会迅速死亡, 而干细胞则分裂并形成细胞簇。这使得 ns 培养保持胶质瘤肿瘤的特点^16,17,18。胶质瘤 ns 可用于评估肿瘤生物学的几个方面, 包括分析生物标志物, 在诊断, 预后, 分类, 肿瘤进展状态, 细胞分化状态, 细胞分化状态。在这里, 我们详细介绍了生成胶质瘤 ns 的协议, 并将3d 培养物嵌入石蜡中, 用于 ihc 染色。固定和嵌入胶质瘤 ns 的一个优点是, 与传统的细胞旋旋法相比, ns 的形态保持得更好,其中胶质瘤 ns 受到细胞离解的压力操纵, 并变得扁平。此外, 嵌入抑制任何内源性荧光体表达从基因工程肿瘤 ns, 使染色整个荧光光谱。该方法的总体目标是通过石蜡包埋过程保存胶质瘤细胞的三维结构, 并利用免疫组织化学对胶质瘤神经球进行表征。

研究方案

这里描述的所有方法都已得到密歇根大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。

1. 从小鼠模型衍生出的脑肿瘤神经球的产生

1. 在解剖过程之前, 准备神经干细胞培养基 (nsc 培养基: dmem/f12 与 1x b27 补充剂, 1x n2 补充, 1x 诺康和12倍药/抗真菌的 yic-yacce 补充人类重组 egf 和基本 fgf 在浓度为 20 ngml 每个)。在 1.5 ml 管中填充300μl 的 nsc 介质, 并为以后的工作做好准备。
2. 选择有大肿瘤的老鼠。
   注: 如果质粒或病毒注射编码荧光素, 则可通过生物发光监测肿瘤的大小。通常, 大肿瘤具有 > 10^{6 光子}的生物发光.
3. 对小鼠进行过量的异氟醚安乐死: 注入用异氟醚的纸巾, 并在安乐死室中引入组织, 避免与小鼠直接接触, 以防止刺激。等待, 直到老鼠不显示踏板反射 (通常 5-10)。斩首鼠标和解剖大脑, 如卡利内斯库等人所述.^13岁
4. 如果肿瘤是荧光的, 使用配备荧光灯的解剖显微镜来识别大脑中的肿瘤质量。用精细的钳子, 从正常的脑组织解剖肿瘤 (通常直径5-7 毫米)。
5. 将解剖的肿瘤与 nsc 介质 (步骤 1.1) 放在 1.5 ml 管中。通过施加温和的压力, 用适合微离心管壁的一次性塑料钉将肿瘤均质。
6. 要分离细胞团块, 在37°c 下加入1毫升的无酶解离培养基, 孵育5分钟。
7. 通过70μm 的电池过滤器过滤细胞悬浮液, 并用20毫升的 nsc 介质清洗过滤器。
8. 以 300 x 克离心 5分钟, 将上清液切好, 并根据颗粒的大小将颗粒重新悬浮到 nsc 介质中6毫升或15毫升。
9. 将肿瘤细胞悬浮液放入 t-25 或 t-75 培养瓶, 并在37°c 时在空气和 5%_co2的气氛的组织培养孵化器中培养。
10. 3天后, 将健康悬浮的 ns 转移, 并将其重新装入 t-25 或 t-75 组织培养瓶。如有必要, 向区域性中添加更多的 nsc 媒体。
    注: 通常会有混合的细胞群, 有的会死, 有的会坚持, 有的会形成将漂浮在媒体中的 ns "

2. 维护和传递 ns

注: 防止过度生长, 并将细胞保持在相对较高的密度。融合是由球体大小决定的 (大球体的黑色中心意味着过度生长)。ns 的生长速度将取决于用于产生肿瘤的癌基因。

1. 一旦 ns 培养物达到融合, 将培养物收集在无菌离心管中, 并以 300 x g 的速度将 ns 颗粒收集5分钟。
2. 丢弃上清液, 加入细胞分离溶液的1毫升, 并将移液器重新悬浮颗粒。
3. 在37°c 下孵化 5分钟, 每2分钟闪烁一次管, 以帮助细胞离解。
   注: 当 ns 达到融合时, 它们通常在宏观上被视为白色的小球体。为了确保细胞离解, 至少所有可见的 ns 都必须消失。
4. 加入5毫升 hbss 1x 和移液器几次。颗粒细胞在 300 x g 5分钟内丢弃上清液。在5毫升的 nsc 介质中重新悬浮颗粒, 辅以重组 egf 和基本 fgf。
5. 在空气为95%、co2 为5% 的组织培养孵化器中, 在 t-75 烧瓶中加入1毫升细胞, 并在 t-75 烧瓶_中培养。
6. 每3天添加生长因子 (egf 和基本 fgf)。如果介质变浅橙色, 而细胞尚未融合, 请更换介质。要做到这一点, 离心 ns 在 300 x g 4分钟, 并在 nsc 介质中重新暂停与生长因子补充。
   注: 根据颗粒形成的大小, 细胞可能需要分裂成更多的烧瓶。

3. 长期储存的冷冻 ns

1. 当 ns 培养变得融合时, 如步骤 2.1-2.4 中所述, 分离细胞。一旦颗粒被重新悬浮在 hbss 中, 取出一个并对细胞进行计数。
2. 以 300 x g 离心细胞 4分钟, 并尽可能去除上清液。
3. 在冷冻介质中重新悬浮颗粒 (热失活 fbs, 10% dmso)。建议每瓶每瓶每瓶冷冻 1 x¹⁰ 6 和 3 x 10^{6 个细胞}。
4. 根据需要将重新悬浮的细胞分成尽可能多的冷冻细胞, 然后先将小瓶转移到冰中, 然后转移到-20°c, 然后转移到-80°c, 最后第二天再冷却到液氮储存容器。

4. 肿瘤的固定

1. 在 t-25 瓶中培养肿瘤 ns 2-3天, 直到细胞融合 (~ 3 x^{10 6 细胞})。从至少一个 t-25 融合的烧瓶中收集肿瘤 ns 在一个15毫升的锥形管中。在 300 x g 的颗粒5分钟。
2. 重新悬浮颗粒在1毫升的10% 福尔拉林, 并保持在室温下 10分钟 (rt) 1 毫升, 加入5毫升的 1x hbss 和颗粒细胞如步骤3.2 所做的那样。重复此步骤一次。
3. 将含有颗粒的15毫升锥形管放在冰上。

5. 肿瘤 ns 的石蜡嵌入

1. 在2% 温热液体琼脂糖的500μl 中重新悬浮清洗后的 ns 颗粒, 通过移液轻轻混合。
2. 立即将琼脂嵌体 ns 放在冰上, 直到琼脂糖聚合。取下窝藏 ns 的琼脂糖件。将与 ns 一起聚合的琼脂糖片放入盒式磁带进行组织处理 (图 2)。
3. 继续进行组织处理 (使用自动石蜡处理器) 和石蜡嵌入 (使用嵌入站)。

6. 石蜡嵌入 ns 的切片

1. 将水浴设置为 42°c, 并使用两个油漆刷小心地将刀片插入微胶卷上, 以确保其平整。仅使用此刀片进行修剪。
2. 将石蜡块放在微孔上。使用非优势手, 按下位于左侧的杠杆, 控制每个部分的厚度。按下到指示厚度为30微米的第二个停止点。
3. 开始修剪块 (即, 删除多余的石蜡), 用右手转动粗糙的手轮, 直到到达样品的表面。此时, 松开控制修剪厚度的杠杆, 使其达到10μm 或5μm。当到达样品表面时, 停止修剪。
4. 在冰盒里装满冰, 加装足够的水, 这样当石蜡块放在冰上时, 水就会像石蜡块周围的膜一样, 保护它不直接接触冰面。在冰上培养石蜡块20分钟。
5. 丢弃旧刀片, 并插入一个新的进行切片。用纱布干块, 然后把它放在微管上。
6. 用非优势手, 获得一对弯曲的钳子, 将用于拉石蜡丝带。在右手附近放一把潮湿的油漆刷, 用来将石蜡丝带转移到水浴中。开始分, 用右手快速转动粗糙的手轮。使用左手的钳子按住石蜡丝带。
7. 使用潮湿的油漆刷将石蜡丝带转移到水浴中。
8. 使用钳子的曲线, 通过表面上将钳子放在两个石蜡截面之间, 然后轻轻地将两个部分推开, 将横截面分开。
   注: 此运动应完全位于石蜡部分的表面。不要按下该部分。
9. 使用潮湿的油漆刷将分离的石蜡部分推到带正电荷的粘附显微镜幻灯片上。
10. 在将幻灯片存放在幻灯片箱中之前, 请让幻灯片在化学引擎盖内过夜。幻灯片的存储取决于所执行的污渍类型。

7. 石蜡包埋 ns 的免疫组织化学 (ihc)

1. 将幻灯片放入金属机架中, 在60°c 下孵育 20分钟, 将石蜡熔化。
2. 在 rtrt 补液列车中孵育幻灯片: 3x 二甲苯 5分钟, 100% 2倍乙醇 2分钟, 95% 2倍乙醇 2分钟, 70% 1x 乙醇 2分钟, 1x 去离子水 2分钟, 然后将滑梯保存在自来水中, 直到回收抗原, 因为干燥会导致非特异性抗体结合。
3. 在125°c 和90°c 下, 在柠檬酸缓冲液 (10 mm 柠檬酸, 0.05% 非离子洗涤剂, ph 6) 中对滑块进行37秒和90°c 的培养。让它们冷却, 然后用蒸馏水冲洗幻灯片5次。
4. 在 rt 中培养幻灯片, 在 0.3% h2o2 中, 30分钟.
5. 在洗涤缓冲液中清洗幻灯片 3次 (tbs 中的洗涤剂 0.025), 搅拌温和5分钟。
6. 用阻滞剂 (10% 马血清, tbs 中 0.1% bsa) 在 rt 上对幻灯片进行2013年代。
7. 在4°c 的加湿室内用稀释溶液中制备的原生抗体 (tbs 中为 0.1% bsa) 将滑块在加湿室中过夜。在洗涤缓冲液中清洗幻灯片 3次, 用温和搅拌5分钟。
8. 用稀释溶液中制备的生物素化二级抗体在 rt 上对幻灯片进行1小时的培养。在洗涤缓冲液中清洗幻灯片 3次, 用温和搅拌5分钟。
9. 用阿维丁-生物素酰化辣根过氧化物酶复合物在黑暗中将幻灯片在 rt 中培养30分钟。在洗涤缓冲液中清洗幻灯片 3次, 用温和搅拌5分钟。
10. 在 rt_使用db-h 2o2 基板品牌在这里加氢2-5。
11. 用自来水冲洗3次。将滑块 (1-2. s) 浸入血红素溶液中进行反染色, 并在自来水中彻底冲洗, 直至清除。
12. 将幻灯片脱水如下: 在蒸馏水中孵育 2分钟, 在80% 乙醇中浸渍 3次, 在95% 乙醇中孵育 2次, 每次 2分钟, 在100% 乙醇中孵育 2次, 每次 2分钟, 最后在二甲苯中孵育 3次, 每次3分钟。
13. 用基于二甲苯的安装介质覆盖幻灯片, 让滑块在 rt 的平面上干燥, 直到它们准备好进行成像。      注: 如果进行 3, 3 '-二胺酶 (dab) 染色, 幻灯片可以存储在 rt。然而, 如果进行免疫荧光染色, 幻灯片应存储在黑暗中-20°c, 以减少光漂白。

结果

为了监测肿瘤的发展和评估肿瘤是否达到生成 ns 所需的大小, 我们使用生物发光分析了肿瘤发出的发光。这使得通过荧光素酶的发光信号研究幼崽的转导效率和肿瘤进展 (图 1a和1b)。当肿瘤大小达到 1 x 10 7 光子/ponss\ cm/sr (图 1b) 时, 大脑可以被处理为 ns 生成.该系统的另一个优点是, ...

讨论

本文详细介绍了一种对石蜡嵌入胶质瘤 ns 进行免疫组织化学的通用和可重复的方法, 该方法保持了原位生长在大脑中的肿瘤细胞的特征三维结构。与使用镀金或塑料表面的细胞相比, 该技术具有以下优点: i) 保存 ns 的三维结构;ii) 在分析蛋白质表达之前, 避免细胞离解的应激;(iii) 从基因工程肿瘤 ns 中淬火任何内源性荧光体表达, 从而在荧光光谱中进行染色;和 iv) 长期储存。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated microtome blade HP35	Thermo Scientific	3150734
Microtome RM 2135	Leica	MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-aldrich	HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated	Dako	E0432	IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT	Biocare medical	BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
N-27 Supplement	ThermoFisher	A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
AGAROSE LE	GoldBio	A-201-1000
Genesee Sc. Corporation	Olympus 15 ml	21-103
Genesee Sc. Corporation	TC-75 treated Flask	25-209
Genesee Sc. Corporation	TC-25 treated Flask	25-207
DMEM/F12	Gibco	11330-057	NS media
HBSS	GibcoTM	14175-103	balanced salt solution
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse