Immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3D Glioma Neurosphere 문화에 의해 Glioma 바이오 마커의 평가

요약

Neurospheres 3D 문화로 성장 glioma 생물학을 공부 하는 강력한 도구를 구성 합니다. 여기 선물이 immunohistochemistry 파라핀 포함 통해 glioma neurospheres의 3 차원 구조를 유지 하면서 수행 하는 프로토콜. 이 메서드는 stemness 등 신경 분화 glioma neurosphere 속성의 특성을 수 있습니다.

초록

Glioma에 단백질 발현의 분석은 여러 가지 측면의 병 리의 연구에 관련이 있습니다. 수많은 단백질 생체 진단, 예 후, 분류, 종양 진행의 상태 및 세포 분화 상태에서 응용 프로그램으로 설명 했습니다. 생체의 이러한 분석은 또한 종양 neurospheres (NS) glioma 환자 및 glioma 모델에서 생성 된 특성을 유용 합니다. 종양 NS 모델을 귀중 한 생체 외에서 평가는 그들이 파생 되 고 미러 glioma 생물학을 더 정확 하 게 수 있습니다 종양의 다른 기능을 제공 합니다. 종양 NS 바이오 마커 분석 하는 자세한 방법을 설명 여기에 파라핀 포함 종양 NS immunohistochemistry (IHC)를 사용 하 여.

서문

Gliomas 중추¹세계 보건 기구 따르면 그들의 phenotypic genotypic 특성에 의해 분류의 기본 고체 종양입니다. 이 분류는 생체²의 매력적인 소스를 나타내는 드라이버 돌연변이의 유무를 통합 합니다. 생체 측정 하 고 치료 적 개입³약리 응답 뿐 아니라 정상 및 병 적인 프로세스를 나타내기 위해 평가 될 수 있는 생물 학적 특징입니다. 바이오 마커의 검출 될 수 있다 종양 조직에 셀 glioma에서 파생 된 다양 한 측면에서의 생물 학적 특성 사용. Glioma biomarkers의 몇 가지 예로 돌연변이 isocitrate 효소 1 (IDH1), 돌연변이 효소 더 나은 예 지⁴와 관련 된 낮은-학년 gliomas의 있습니다. IDH1 돌연변이 TP53 알파 thalassemia/정신 박약 증후군 X 연결 (ATRX)와 함께에서 자주 표현 된다-돌연변이 비활성화 특정 glioma 정의 하위^4,5. ATRX 비활성화 돌연변이 또한 소아 고급 gliomas^2,6 의 44%에서 발생 하 고 공격적인 종양 및 게놈 불안정성^6,7관련 된 되었습니다. 또한, 소아 확산 본질적인 pontine gliomas (DIPG)는 히스톤 H3 유전자 H3F3A, 또는 HIST1H3B/C 유전자^1,6K27M 돌연변이의 유무에 따라 하위 그룹에서 분화 된다. 따라서, 분자 특성의 소개 허용 세분, 연구, 그리고 더 더 개발 하면 별도 엔터티로 gliomas의 치료 대상으로 각 하위 형식에 대 한 치료. 또한, biomarkers의 분석 apoptosis⁸, autophagy⁹, 세포 주기 진행¹⁰, 셀 확산¹¹, 세포 분화^{12 등 다른 생물 학적 과정을 평가에 사용할 수 있습니다.} .

유전자 조작된 동물 모델 인간의 암 발생에 유전적 병 변의 항구는 질병의 진행을 중재 하는 통로 신호 하는 연구를 위한 중요 합니다. 우리의 실험실 glioma 은닉 인간의 glioma 하위^13,14정리 특정 돌연변이의 유전자 조작된 마우스 모델 개발에 잠자는 아름다움 (SB) transposase 시스템의 사용을 구현 했습니다. 이러한 유전자 조작된 마우스 모델 3D 시스템에서 생체 외에서 연구는 종양에서 파생 된 NS를 생성 하는 데 사용 됩니다, 그리고 미러링 현저한 특징 종양에 원래의¹⁵에 제시. 또한, 쥐로 NS orthotopical 이식 1 차 종양의 기능을 유지 하 고 해당 기본 종양¹⁵의 histopathological, 게놈, 및 phenotypic 특성을 모방 하는 이차 종양을 생성할 수 있습니다.

혈 청 무료 문화에서 뇌 종양 세포 줄기 세포 특성을 가진 농축 될 수 있다, 그리고 표 피 성장 인자 (EGF)과 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF), 존재 그들은 NS 문화 등 단일 세포 유래 식민지로 성장 될 수 있다. 이 선택적 문화 시스템에 대부분 차별화 또는 차별화 된 세포 급속 하 게 죽어, 반면 줄기 세포 분열과 세포 클러스터 형성. NS 문화 glioma 종양 기능^16,,1718유지를 생성 수 있습니다. Glioma NS 종양 생물학, 생체 진단, 예 후, 분류, 종양 진행의 상태 및 세포 분화 상태에서 응용 프로그램의 분석을 포함 한 여러 가지 측면을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 여기, 우리가 glioma NS를 생성 하 고 사용 되는 파라핀에 3D 문화를 포함 하는 프로토콜 세부 IHC 얼룩에 대 한. 담합 및 glioma NS 포함의 장점 중 하나는 NS의 형태는 유지 더 나은 기존의 cytospin 방법¹⁹, 어떤 glioma에서 NS 셀 분리에 대 한 스트레스가 조작에 복종 하 고 평평 하 게 될에 비해입니다. 또한, 유전자 조작된 종양 NS, 형광 스펙트럼에 걸쳐 얼룩 사용에서 생 fluorophore 식 냉각 포함. 이 방법의 전반적인 목표는 과정을 포함 한 파라핀 glioma 셀의 3 차원 구조를 유지 하 고 glioma neurospheres immunohistochemistry를 사용 하 여 특성을 사용 하입니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 미시간 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 뇌 종양 Neurospheres 마우스 모델에서 파생 된 세대

1. 해 부 절차 전에 신경 줄기 세포 미디어 준비 (NSC 미디어: 1 x B27 보충, 1 x N2 보충, 1 x normocin, 및 1 x 항생제/antimycotic 인간 재조합 EGF와 20 ng/ml 각 농도에서 기본적인 FGF 보충 DMEM/F12). NSC 미디어의 300 µ L와 1.5 mL 튜브를 나중을 위해 예약.
2. 큰 종양으로 마우스를 선택 합니다.
   참고: 종양의 크기 경우 플라스 미드 또는 바이러스 주입 인코딩합니다 소 생물 발광에 의해 모니터할 수 있습니다. 일반적으로, 큰 종양 > 10⁶ /sr 광자/s/c m²의 생물 발광을 있다.
3. Isoflurane의 과다와 함께 마우스를 안락사: isoflurane 티슈 페이퍼 고취와 자극을 방지 하기 위해 마우스와 직접 접촉을 피하고 euthanization 챔버에 조직 소개. 쥐 페달 반사 (일반적으로 5-10 분)을 표시 하지 않습니다 때까지 기다립니다. 목을 벨 마우스 및 Calinescu 외 에 설명 된 대로 뇌를 해 부 ¹³.
4. 형광 성 종양 인 경우 형광 램프를 장착 해 현미경을 사용 하 여 뇌 내 종양 질량을 식별. 좋은 집게와 정상적인 뇌 조직에서 종양 (보통 5-7 m m 직경)를 해 부.
5. NSC 미디어 (단계 1.1) 1.5 mL 튜브에 해 부 종양을 놓습니다. Microcentrifuge 튜브의 벽에 부드러운 압력을 적용 하 여 맞는 일회용 플라스틱 유 봉과 종양을 균질.
6. 해리 셀 덩어리, 분리 효소-무료 미디어의 1 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 품 어
7. NSC 미디어의 20 mL와 여과기를 세척 및 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.
8. 5 분 x 300g에 centrifuge, 상쾌한, 가만히 따르다 하 고 다시 6 mL 또는 펠 릿의 크기에 따라 NSC 미디어의 15 mL에 펠 릿을 일시 중단.
9. 종양 세포 현 탁 액 T-25 또는 T-75 문화 플라스 크 및 문화 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 95% 공기와 5% CO₂의 분위기 접시.
10. 3 일 후, 건강 한 중단된 NS를 전송 하 고 다시 T-25 또는 T-75 조직 배양 플라스 크에 접시. 필요한 경우 문화에 더 많은 NSC 미디어를 추가 합니다.
    참고: 일반적으로 세포의 혼합된 인구 있을 것입니다, 일부 죽은, 일부 준수 할 것입니다, 그리고 일부 매체에서 부동 것입니다 NS 형성 될 것 이다

2. 유지 및 NS를 뿌리고

참고: 자라 난 방지 하 고 상대적으로 높은 밀도에서 세포를 유지 한다. 합류는 구체 크기 (큰 분야 의미 자라 난 검은 센터)에 의해 결정 됩니다. NS의 성장 율 oncogenes 종양 생성 하는 데 사용에 따라 달라 집니다.

1. NS 문화에는 confluency에 도달 했습니다, 일단 메 마른 분리기 관에 문화를 수집 하 고 5 분 동안 300 x g에서 NS를 작은.
2. 삭제는 상쾌한 세포 분리 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 플라스틱 펠 릿을 다시 중단.
3. 튜브를 flicking 5 분 동안 37 ° C에서 셀 분리 수 있도록 매일 2 분을 품 어.
   참고: NS confluency에 도달, 그들은 볼 수 있습니다 일반적으로 거시적으로 작은 백색 분야. 보장 하기 위해 세포 분리, 적어도 모든 보이는 NS 사라진 해야 합니다.
4. HBSS 1의 5 mL을 추가 x 및 피 펫 여러 번. 5 분에 대 한 300 x g에서 펠 릿 세포는 상쾌한을 삭제합니다. 다시 재조합 EGF와 FGF 기본 보충 NSC 미디어의 5 ml에서는 펠 릿을 일시 중단 합니다.
5. 95% 공기와 5% CO₂의 분위기와 NSC 미디어 문화와 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 T-75 플라스 크에서 15 mL를 셀의 1 mL를 추가 합니다.
6. 3 일 마다 성장 인자 (EGF와 기본적인 FGF)를 추가 합니다. 미디어 가벼운 경우 오렌지와 셀 아직 confluent, 미디어를 변경 합니다. 이렇게 하려면 4 분에 대 한 300 x g에서 NS 원심 그리고 성장 인자를 보충 하는 NSC 미디어에 다시 일시 중단.
   참고: 형성 하는 펠 릿의 크기에 따라 셀 해야 더 플라스 크를 분할할 수 합니다.

3. 장기 저장을 위한 NS 동결

1. NS 문화 confluent 때, 해리 셀 단계 2.1-2.4에에서 설명 된 대로. 일단 펠 릿 HBSS 다시 정지 하고있다, 한 약 수를 제거 하 고 셀을 계산.
2. 4 분에 대 한 300 x g에서 세포를 원심 고는 상쾌한의 가능한 한 많이 제거 합니다.
3. 다시 미디어 (열 비활성화 FBS, 10 %DMSO)에 펠 릿을 일시 중단 합니다. 1 x 10⁶ mL 당 병 당 3 x 10⁶ 세포 사이 동결 하는 것이 좋습니다.
4. 얼음, 첫 번째 전송 하 여-20 ℃, 다음-80 ° C, 그리고 마지막으로 액체 질소 저장 컨테이너에 다음날 필요 하 고 천천히 튜브에 진정으로 많은 cryovials에 다시 정지 셀을 나눕니다.

4입니다. 종양 NS의 고정

1. 문화 종양 세포 confluent 때까지 2-3 일 동안 T-25 플라스 크에서 NS (~ 3 × 10⁶ 셀). 적어도 하나의 T-25 confluent 술병에서 종양 NS 15 mL 원뿔 튜브에서를 수집 합니다. 5 분 x 300g에 작은.
2. 다시 10% 포 르 말린의 1 mL에 펠 릿을 일시 중단 하 고 10 분 추가 5 ml 1 x HBSS의 실 온 (RT)에서 계속 작은 셀 3.2 단계에서 완료. 이 단계를 한 번 더 반복 합니다.
3. 얼음에 펠 릿을 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브를 놓습니다.

5. 파라핀 종양 NS의 포함

1. 다시 2% 따뜻한 액체 agarose의 500 µ L에 씻어 NS 펠 릿을 일시 중단 하 고 pipetting으로 부드럽게 혼합.
2. 즉시 얼음에 agarose 임베디드 NS를 두고는 agarose polymerizes 때까지. 은닉 NS agarose 조각을 제거 합니다. (그림 2)를 처리 하는 조직에 대 한 카세트에 NS와 생산 agarose 조각을 넣으십시오.
3. 조직 처리 (자동 파라핀 프로세서를 사용 하 여) 계속 하 고 파라핀 포함 (를 사용 하 여 포함 역).

6. 파라핀 끼워 넣어진 NS의 단면

1. 42 ° C에 물 목욕을 설정 하 고 신중 하 게 2 개의 페인트 브러쉬를 사용 하 여 파괴는 다는 것을 확인 하는 톰에 넣은 후. 이 블레이드를 사용 하 여 트리밍에 대해서만.
2. 톰에 파라핀 블록을 배치 합니다. 비 지배적인 손을 가진 각 섹션의 두께 제어 하는 왼쪽에 있는 레버를 아래로 누릅니다. 30 µ m 두께 나타내는 두 번째 중지를 누릅니다.
3. 블록을 트리밍 시작 (즉., 초과 파라핀 제거) 샘플의 표면에이 때까지 오른손으로 거친 손으로 바퀴를 선회 하 여. 이 시점에서, 레버는 트림 두께 10 μ m 또는 5 μ m를 제어 하십시오. 트리밍 샘플의 표면에 도달 하면 중지 합니다.
4. 얼음 얼음 상자와 파라핀 블록 얼음에 놓으면 물 파라핀 블록, 직접 얼음을 만지기에서 보호 필름 역할도 충분 한 물을 추가. 파라핀 블록 20 분 동안 얼음에 품 어.
5. 오래 된 블레이드를 삭제 하 고 단면에 대 한 새로운 하나를 삽입 합니다. 건조 블록 다음에 톰에 배치, 거 즈를 사용 하 여.
6. 비 지배적인 손을 가진 파라핀 리본을 당겨 하는 데 사용 될 곡선된 집게의 쌍을 가져옵니다. 오른손 물 목욕을 파라핀 리본을 전송 하는 데 사용 됩니다 근처 젖은 페인트 브러쉬를 유지 합니다. 빠른 오른쪽 손으로 거친 손으로 바퀴를 선회 하 여 섹션을 시작 속도. 왼쪽 손에 집게를 사용 하 여 파라핀 리본을.
7. 젖은 페인트 브러시를 사용 하 여 파라핀 리본 물 목욕을 전송.
8. 분리는 섹션 피상적으로 두 개의 파라핀 섹션 사이 집게를 배치 후 부드럽게 떨어져 두 개의 섹션을 추진 하는 집게의 곡선을 사용 합니다.
   참고:이 모션 파라핀 섹션의 표면에 완전히 해야 합니다. 누르지 마십시오 아래 섹션에.
9. 젖은 페인트 브러시를 사용 하 여 충전 된 접착 현미경 슬라이드에 분리 된 파라핀 섹션을 밀어.
10. 슬라이드 슬라이드 상자에 그들을 저장 하기 전에 화학 후드 안에 하룻밤 건조를 허용 합니다. 슬라이드 저장 수행 하는 얼룩의 종류에 따라 달라 집니다.

7. 파라핀 끼워 넣어진 NS의 Immunohistochemistry (IHC)

1. 금속 선반에 슬라이드를 배치 하 고 그들을 20 분 동안 60 ° C에서 배양 하 여 파라핀을 녹여.
2. RT에 리하이드레이션 기차에 부 화 하 여 슬라이드를 deparaffinize: 크 실 렌 5 분, 2 분, 2 분, 2 분, 2 분, Hereon에 대 한 이온된 수 x 1에 대 한 70 %1 x 에탄올에 대 한 95 %2 x 에탄올에 대 한 100 %2 배 에탄올 x 3 유지 항 원 복구까지 수돗물에 슬라이드 밖으로 건조로 일반적인 항 체 바인딩을 발생할 것입니다.
3. 시트르산 buffer (10 m m 구 연산 산 성, 비 이온 세제 0.05%, pH 6) 30 125 ° C에서에서 슬라이드를 품 어 s 10에 대 한 90 ° C에서 s. 진정, 그들이 다음 5 번 증류수와 슬라이드를 씻어.
4. 30 분 동안 0.3% H₂O₂ 에 RT에서 슬라이드를 품 어.
5. 워시 버퍼 (TBS에서 0.025% 세제) 부드러운 동요와 5 분 동안 세척에 3 번 슬라이드.
6. 30 분에 대 한 솔루션 (10% 말 혈 청, TBS에서 0.1 %BSA) 차단으로 RT에 슬라이드를 품 어.
7. 1 차적인 항 체 희석 솔루션 (TBS에서 0.1 %BSA) 준비와 습도 챔버에 4 ° C에서 하룻밤 슬라이드를 품 어. 3 번 부드러운 동요와 함께 5 분에 대 한 버퍼를 세척에 슬라이드를 씻어.
8. Biotinylated 이차 항 체 희석 솔루션에서 준비와 1 시간에 대 한 실시간에 슬라이드를 품 어. 3 번 부드러운 동요와 함께 5 분에 대 한 버퍼를 세척에 슬라이드를 씻어.
9. RT에서 슬라이드 avidin-biotinylated 양 고추냉이 과산화 효소 복잡 한와 함께 30 분 동안 어둠 속에 품 어. 3 번 부드러운 동요와 함께 5 분에 대 한 버퍼를 세척에 슬라이드를 씻어.
10. DAB H₂O₂ 기판 브랜드와 여기 실시간에 2-5 분에 대 한 슬라이드를 품 어
11. 수돗물으로 3 번을 씻어. (1-2 s) 되며 솔루션 counterstain, 슬라이드와 개간까지 수돗물에 그들을 철저 하 게 린스.
12. 다음과 같이 슬라이드를 탈수: 증류수 2 분 동안에 품 어, 80% 에탄올에 3 번을 찍어, 2 시간 2 분을 위한 95% 에탄올에서 품 어, 각, 2 분을 위한 2 시간 100% 에탄올에서 품 어 그리고 마지막으로 3 번 3 분에 크 실 렌에.
13. Coverslip 자일 렌 기반 설치 매체와 슬라이드 이미징에 대 한 준비가 될 때까지 RT에서 평평한 표면에 말리 고.       참고: 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) 얼룩, 수행 하는 경우 슬라이드에 저장 될 수 실시간 그러나, 면역 형광 염색 법을 수행 하는 경우 사진 표백을 줄이기 위해-20 ° C에서 어둠에 슬라이드를 저장 합니다.

결과

종양 개발 모니터링 및 평가 종양 NS를 생성 하는 데 필요한 크기에 도달 하면, 우리는 생물 발광을 사용 하 여 종양에 의해 방출 하는 발광 분석. (그림 1A , 1B) luciferase의 발광 신호에 의해 새끼 및 종양 진행에 변환 효율의 연구 수 있습니다. 종양 크기는 1 x 10⁷ 광자/s/cm2/sr (그림 1B)?...

토론

이 문서에서는, 우리 선발 immunohistochemistry 파라핀 끼워 넣어진 glioma NS에 수행 하기 위해 다양 하 고 재현할 수 방법 두뇌 제자리에서 성장 하는 종양 세포의 특성 3 차원 구조를 유지 하는. 이 기술은 유리 또는 플라스틱 표면에 도금 하는 셀을 사용 하 여 다음과 같은 이점을: 난) NS;의 3D 구조의 보존 ii) 단백질 표정;의 분석 하기 전에 셀 분리의 스트레스의 방지 3) 유전자 조작된 종양 NS, 사?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated microtome blade HP35	Thermo Scientific	3150734
Microtome RM 2135	Leica	MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-aldrich	HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated	Dako	E0432	IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT	Biocare medical	BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
N-27 Supplement	ThermoFisher	A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
AGAROSE LE	GoldBio	A-201-1000
Genesee Sc. Corporation	Olympus 15 ml	21-103
Genesee Sc. Corporation	TC-75 treated Flask	25-209
Genesee Sc. Corporation	TC-25 treated Flask	25-207
DMEM/F12	Gibco	11330-057	NS media
HBSS	GibcoTM	14175-103	balanced salt solution
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse