Biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3D tümörü Neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi

Özet

3D kültürler yetiştirilen Neurospheres tümörü biyoloji eğitim için güçlü bir araç oluşturur. Burada parafin katıştırma üzerinden tümörü neurospheres 3D yapısını koruyarak immünhistokimya gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem, tümörü neurosphere özellikleri stemness ve sinirsel farklılaşma gibi karakterizasyonu sağlar.

Özet

Tümörü ifadede protein analizi onun patoloji çalışma çeşitli yönlerini ilgilidir. Çok sayıda protein tanı, prognoz, sınıflandırma, tümör ilerleme durumunu ve hücre farklılaşması devlet uygulamaları ile biyolojik olarak tarif edilmiştir. Bu biyolojik analizleri de tümörü hasta ve tümörü modelleri üretilen tümör neurospheres (NS) karakterize etmek kullanışlıdır. Tümör NS hangi onlar türetilmiştir ve daha doğru olabilir ayna gliyom biyoloji tümör farklı özelliklerini değerlendirmek için değerli vitro modeli sağlar. Burada biz biyolojik tümör NS içinde analiz etmek için ayrıntılı bir yöntem tarif parafin gömülü tümörle NS immünhistokimya (IHC) kullanarak.

Giriş

Gliomas tarafından fenotipik ve genotypic özellikleri¹Dünya Sağlık Örgütü göre sınıflandırılmış merkez sinir sisteminin birincil solid tümör vardır. Bu sınıflandırma varlığı ya da yokluğu biyolojik²çekici bir kaynağı temsil sürücü mutasyonlar içermektedir. Biyolojik ölçülen ve terapötik müdahale³farmakolojik yanıtlarının yanı sıra normal ve patolojik işlemleri belirtmek için değerlendirilen biyolojik özellikleri vardır. Biyolojik tespit tümör doku ve hücreleri tümörü türetilmiş, farklı açıdan biyolojik onun karakterizasyonu etkinleştirme. Mutasyona uğramış isocitrate dehidrogenaz 1 (IDH1), bir mutant enzim daha iyi prognoz⁴ile ilişkili alt-sınıf gliomas karakteristik gliyom biyolojik bazı örnekler. Mutasyona uğramış IDH1 sık sık TP53 ve alfa-talasemi/mental retardasyon sendromu X'e (ATRX) ile birlikte dile getirdi-mutasyon ihracı, belirli bir gliyom tanımlama alt tür^4,5. ATRX ihracı mutasyonlar da Pediatrik yüksek kalitede gliomas^2,%6 44'ortaya çikmaktadir ve agresif tümörler ve genomik istikrarsızlık^6,7ile ilişkili bulunmuştur. Buna ek olarak, Pediatrik diffüz içsel pontine gliomas (DIPG) bir K27M mutasyon histon H3 gen H3F3A veya HIST1H3B/C gen^1,6olup göre alt gruplar farklı. Bu nedenle, alt bölümü, çalışma ve gliomas tedavisi daha daha fazla gelişimi sağlayacak ayrı varlıklar olarak Moleküler Karakterizasyonu giriş izni hedefli tedaviler her alt türü için. Buna ek olarak, biyolojik analizini apoptosis⁸, autophagy⁹, hücre döngüsü ilerleme¹⁰, hücre proliferasyonu¹¹ve hücre farklılaşması^{12 gibi farklı biyolojik süreçlerin değerlendirmek için kullanılabilir} .

İnsan kanser mevcut genetik lezyonlar liman genetiği hayvan modelleri hastalık ilerleme aracılık yolları sinyal çalışması için kritik önem taşımaktadır. Bizim Laboratuvar insan gliyom alt türlerinden^13,14özetlemek belirli mutasyonlar yataklık gliyom genetiği fare modelleri geliştirmek için uyku Güzellik (SB) transposase sistemi hayata geçirdi. Bu genetik fare modelleri vitro çalışmalar 3D sisteminde etkinleştirmek tümör kaynaklı NS oluşturmak için kullanılır, tümör içinde in situ¹⁵' te yansıtma belirgin özellikleri mevcut. Ayrıca, NS orthotopical nakli fareler içine özelliklerini birincil tümör korumak ve karşılık gelen birincil tümörün¹⁵histopatolojik, genomik ve fenotipik özellikleri taklit ikincil tümörler oluşturabilirsiniz.

Kültür, serum-Alerjik Beyin tümör hücreleri kök hücre özellikleri ile zenginleştirilmiş ve epidermal büyüme faktörleri (EGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) huzurunda onlar NS kültürler gibi tek hücre kaynaklı koloniler olarak yetiştirilir. Kök Hücre Böl ve hücresel kümeleri oluşturur, ancak bu seçici kültür sistemi içinde en ayırt edici veya farklılaşmış hücreler hızla, ölmek. Bu tümörü tümör Özellikler^16,17,18tutar bir NS kültür üretimi sağlar. Tümörü NS tümör biyolojisi, tanı, prognoz, sınıflandırma, tümör ilerleme durumunu ve hücre farklılaşma durumu da biyolojik analizi de dahil olmak üzere çeşitli yönlerini değerlendirmek için kullanılabilir. Burada, tümörü NS oluşturmak ve 3D kültürler parafin içinde kullanılmak üzere embed için bir protokol ayrıntılı IHC boyama için. Sabitleme ve tümörü NS gömme bir NS morfolojisi daha iyi hangi gliyom NS hücre ayrılma için stresli işleme tabi tutulur ve basık haline geleneksel cytospin yöntemi¹⁹' a, göre korunur üstünlüktür. Buna ek olarak, gömme genetiği tümör NS, floresan spectra boyama etkinleştirme herhangi bir endojen fluorophore ifadeden quenches. Bu yöntem genel işlem katıştırma parafin ile tümörü hücreleri 3D yapısını korumak ve karakterizasyonu tümörü neurospheres immünhistokimya kullanarak etkinleştirmek için hedeftir.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Michigan Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. nesil bir fare modelinden türetilmiş Beyin tümör Neurospheres

1. Diseksiyon yordamı önce sinir kök hücre ortam hazırlamak (NSC medya: DMEM/F12 özel sayı: 1 x B27, 1 x N2 ek, 1 x normocin ve 1 x antibiyotik/insan rekombinant EGF ve basic-FGF konsantrasyonları 20 ng/mL her yönü ile antimycotic). 1.5 mL tüp NSC medya 300 µL ile doldurun ve daha sonrası için saklıdır.
2. Bir fare ile büyük bir tümör seçin.
   Not: plazmid veya virüs enjekte biyoluminesans kodlar Eğer bir tümör boyutu bioluminescence tarafından izlenebilir. Genellikle, büyük bir tümör > 10⁶ fotonlar/s/cm²/sr biyolüminesans var.
3. Fare ile bir doz aşımı isoflurane ötenazi: kağıt mendil isoflurane ile demlemek ve tahriş önlemek için fare ile doğrudan temas kaçınarak doku euthanization odasında tanıtmak. Fareler pedal refleks (genellikle 5-10 dk) gösterme kadar bekleyin. Fare başını kesmek ve beyin Calinescu vd içinde açıklandığı gibi incelemek ¹³.
4. Tümör floresan, floresan lamba ile donatılmış diseksiyon mikroskop içinde beyin tümörü kitle tanımlamak için kullanın. İyi forseps ile normal beyin dokusundan (genellikle 5-7 mm çapında) tümör incelemek.
5. NSC medya (adım 1.1) ile 1,5 mL tüp disseke tümör yerleştirin. Hafif basınç uygulayarak microcentrifuge tüp duvarlara uyan bir tek kullanımlık plastik havaneli ile tümör lunaparkçı.
6. Hücre kümeleri ayırmak için enzim-Alerjik ayrışma ortamının 1 mL ekleyin ve 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya
7. Hücre süspansiyon 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve süzgeç NSC medya 20 mL ile yıkayın.
8. 300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi, süpernatant dikkatle boşaltmak ve Pelet 6 mL veya 15 mL NSC medya, Pelet büyüklüğüne bağlı olarak yeniden askıya alma.
9. Tümör hücre süspansiyon bir T-25 veya T-75 kültür şişesi ve kültür bir doku kültürü kuluçka 37 ° C'de % 95'i hava ve % 5 CO₂bir atmosfer ile plaka.
10. 3 gün sonra sağlıklı askıya alınmış NS aktarmak ve onları yeniden T-25 veya T-75 doku kültürü şişesi plakası. Gerekirse, daha fazla NSC medya kültür için ekleyin.
    Not: Genellikle bir nüfus hücre olacak, bazı ölü olacak, bazı yapıştırılır ve bazı medya yüzen NS oluşturan

2. koruma ve NS Passaging

Not: aşırı büyüme önlemek ve nispeten yüksek yoğunluklu hücreleri korumak. İzdiham küreler boyutu (siyah merkezlerinin büyük küre ortalama büyüme) tarafından belirlenir. NS büyüme hızının tümörler oluşturmak için kullanılan oncogenes bağlı olacaktır.

1. Bir kez NS kültür confluency ulaştı, steril santrifüj tüpü kültüründe toplamak ve NS 300 x g 5 min için de cips.
2. Süpernatant atmak, hücre dekolmanı çözümü 1 mL ekleyin ve pipet Pelet yeniden askıya alma.
3. Tüp flicking 5 min için 37 ° C'de hücre ayrılma yardımcı olmak için her 2 dk kuluçkaya.
   Not: NS confluency ulaştığınızda, onlar genellikle macroscopically küçük beyaz küreler görülebilir. Hücre ayrılma sağlamak için en azından tüm görünür NS kayboldu gerekir.
4. HBSS 1 5 mL ekleyin x ve pipet birkaç kez. 5 dakika süreyle 300 x g Pelet hücreleri süpernatant atmak. Pelet NSC medya rekombinant EGF ve temel FGF ile 5 ml yeniden askıya alma.
5. Hücre 1 mL NSC medya ve kültür T-75 şişesi bir doku kültürü kuluçka 37 ° C'de 15 mL % 95'i hava ve % 5 CO₂atmosferiyle ekleyin.
6. Büyüme faktörleri (EGF ve temel FGF) her 3 günde ekleyin. Ortam ışık dönüşürse turuncu ve hücreleri henüz konfluent değil, medya değiştirmek. Bunu yapmak için 300 x g 4 dk için de NS santrifüj kapasitesi ve yeniden büyüme faktörleri ile desteklenmiş NSC medya askıya alma.
   Not: oluşan Pelet boyutuna bağlı olarak, hücre daha fazla şişeler bölmek gerekebilir.

3. uzun süreli depolama için NS dondurma

1. NS kültür konfluent olduğunda hücreleri 2.1-2.4 adımlarda açıklandığı gibi ayırmak. Pelet HBSS içinde yeniden askıya alınmış edildikten sonra bir aliquot çıkarmak ve hücreleri saymak.
2. 300 x g 4 dk için hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant mümkün olduğu kadar kaldırın.
3. Medya (ısı-inaktive FBS, % 10 DMSO) dondurma Pelet yeniden askıya alma. 1 x 10⁶ ve 3 x 10 mL başına şişe başına⁶ hücre arasında dondurmak için tavsiye edilir.
4. Çok cryovials ve yavaş yavaş şişeleri soğumasını gerekli olarak yeniden askıya alınmış hücrelerde tarafından ilk buz için aktarmadan sonra -20 ° c sonra-80 ° C ve nihayet bir sıvı azot saklama kabı için ertesi gün bölün.

4. tümör NS fiksasyonu

1. Kültür tümör T-25 şişesi 2-3 gün kadar hücreleri konfluent NS (~ 3 x 10⁶ hücre). Tümör NS bir 15 mL konik tüp bir en az bir T-25 konfluent şişesi toplamak. 300 x g 5 min için de cips.
2. Pelet 1 mL % 10 formalin yeniden askıya alma ve oda sıcaklığında (RT) 1 x HBSS 10 dk. eklemek 5 mL için tutmak ve adım 3.2 yapılır gibi hücreleri cips. Bu işlemi bir kez daha tekrarlayın.
3. Buzda Pelet içeren 15 mL konik tüp yerleştirin.

5. parafin tümör NS katıştırma

1. Yıkanmış NS Pelet % 2 sıcak sıvı özel 500 µL içinde yeniden askıya alma ve karışımı yavaşça pipetting tarafından.
2. Hemen özel polymerizes kadar özel katıştırılmış NS buza koyun. NS barındıran özel parça kaldırın. Kaset (Şekil 2) işleme doku için NS ile polimerli özel parça yerleştirin.
3. (Bir otomatik parafin işlemci kullanarak) doku işleme devam etmek ve (bir gömme istasyonunu kullanarak) katıştırma alkol.

6. NS parafin gömülü kesit

1. Su banyosu 42 ° C-ayarla ve dikkatlice o dümdüz edildi emin olmak için iki boya fırçaları kullanarak microtome üzerinde bıçak ekleyin. Bu bıçak sadece kırpma için kullanın.
2. Parafin blok üzerinde microtome yerleştirin. Sigara dominant el ile her bölümün kalınlığını denetler sol tarafta bulunan kolu üzerinde bastırın. 30 µm kalınlık gösterir ikinci durdurmak için tuşuna basın.
3. Blok kesme başlar (i.e., aşırı parafin kaldırma) örnek yüzeyine ulaşılana kadar sağ eli ile kaba el çarkı çevirerek. Bu noktada, döşeme kalınlığı 10 mikron veya 5 mikron kontrol kolu bırakın. Örnek yüzeyinin ulaşıldığında kısaltma kesin.
4. Bir buz kutusu buz ile doldurun ve parafin blok buz üzerinde yerleştirildiğinde, su doğrudan buz dokunmaktan korumak parafin blok etrafında bir film gibi davranan sadece yeteri kadar su ekleyin. Parafin blok 20 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
5. Eski bıçak atmak ve kesit için yeni bir tane ekleyin. Kuru blok gazlı bez kullanarak sonra yere microtome.
6. Sigara dominant el ile parafin şerit çekmek için kullanılan Kıvrımlı pensler çifti elde edilir. Parafin şerit su banyosu aktarmak için kullanılan sağ yakınındaki bir nemli boya fırçası tut. Başlamak bölümüne hızlı bir sağ eli ile kaba el çarkı çevirerek pace. Forseps sol el parafin şerit tutmak için kullanın.
7. Islak boya fırçası parafin şerit su banyosu aktarmak için kullanın.
8. Forseps eğrisi bölümleri yüzeysel forseps iki parafin kesitler arasında yerleştirerek, daha sonra iki bölüm uzağa hafifçe iterek tarafından parçalayın için kullanın.
   Not: Bu hareket tamamen parafin bölüm yüzeyinde olmalıdır. Aşağı üstünde belgili tanımlık parça bastırmayın.
9. Pozitif yüklü yapışma mikroskop slayta ayrı parafin kesitler itmek için nemli boya fırçası kullanın.
10. Bunları slayt kutularına saklamak önce kuru gecede bir kimyasal başlık içinde slaytlara izin. Slaytlar depolanmasını gerçekleştirilen leke türüne göre değişir.

7. immünhistokimya (IHC) parafin gömülü NS

1. Parafin bir metal raf slaytlar yerleştirip onlara 20 dk 60 ° C'de kuluçka eritebilir.
2. Slayt kuluçka RT bir rehidrasyon Tren içinde tarafından deparaffinize: 3 x 5 min için ksilen, %100 2 x etanol için 2 dk, %95 2 x etanol için 2 dk, %70 1 x etanol için 2 dk ve 1 x 2 dk. Hereonu, deiyonize su musluk suyu antijen alma kadar slaytları tutmak , kurumasını olarak neden olur non-spesifik antikor bağlama.
3. Sitrat arabellek (10 mM sitrik asit, %0.05 non-iyonik deterjan, pH 6) 125 ° c 30 için slaytları kuluçkaya s ve 90 ° c 10 s. Onları soğumasını sonra slayt 5 kez distile su ile durulayın.
4. RT, Slaytlar %0,3 H₂O₂ 30 dk içinde kuluçkaya.
5. 3 kez nazik ajitasyon ile 5 min için arabellek (TBS % 0,025 deterjan) yıkama içinde slaytlar yıkayın.
6. RT, slaytlar 30 dk için çözüm (% 10 at serum, TBS % 0,1 BSA) engelleme ile kuluçkaya.
7. Gecede 4 ° C'de oksijen odasında slaytlar ile birincil antikor seyreltme çözüm (TBS % 0,1 BSA) hazırlanan kuluçkaya. 3 kez nazik ajitasyon ile 5 min için arabellek yıkama içinde slaytlar yıkayın.
8. RT, Slayt 1 h için biotinylated ikincil antikor seyreltme çözümde hazırlanan ile kuluçkaya. 3 kez nazik ajitasyon ile 5 min için arabellek yıkama içinde slaytlar yıkayın.
9. RT, slaytlar avidin-biotinylated horseradish peroksidaz karmaşık ile 30 dk için karanlıkta kuluçkaya. 3 kez nazik ajitasyon ile 5 min için arabellek yıkama içinde slaytlar yıkayın.
10. DAB-H₂O₂ substrat markalar burada için 2-5 dk RT. az slaytlarla kuluçkaya
11. 3 kez dokunun su ile durulayın. (1-2 s) hematoksilen çözüm counterstain için slaytları daldırma ve takas kadar musluk suyu iyice yıka.
12. Slaytları aşağıdaki gibi kurutmak: 2 min için distile suda kuluçkaya, % 80'i etanol içinde 3 kez daldırma, % 95 etanol 2 min için 2 kez kuluçkaya, % 100 etanol 2 dk her, için 2 kez kuluçkaya ve sonunda 3 dakika için 3 kez ksilen içinde.
13. Coverslip ksilen tabanlı montaj orta ile slaytlar ve koyup RT, düz bir yüzeye kadar görüntüleme için hazır kuruyuncaya kadar bırakın.       Not: 3, 3'-boyama, diaminobenzidine (DAB) gerçekleştirme slaytları RT. saklanabilir Ayirt boyama gerçekleştirilirse, ancak, slaytlar karanlıkta fotoğraf beyazlatma azaltmak için-20 ° C'de muhafaza edilmelidir.

Sonuçlar

Değer biçmek Eğer tümör NS üretmek için gereken boyuta ulaştı ve tümör gelişimi izlemek için bioluminescence kullanarak tümör tarafından yayılan ışıma analiz ettik. Bu luciferase (Şekil 1A ve 1B) ışıldama sinyal ile iletim verimliliği pups ve tümör ilerleme çalışma sağlar. 1 x 10⁷ fotonlar/s/cm2/sr (Şekil 1B) bir sinyal tümör boyutu er...

Tartışmalar

Bu makalede, hangi içinde beyin içinde in situbüyüyen tümör hücreleri karakteristik 3D yapısını korumak immünhistokimya parafin gömülü gliyom NS, gerçekleştirmek için çok yönlü ve tekrarlanabilir bir yöntem ayrıntı. Bu teknik cam veya plastik yüzeyler kaplama hücreleri kullanarak üzerinde aşağıdaki avantajları vardır: Ben) NS; 3D yapısını korunması II) protein ifade analiz önce hücre ayrılma stresinin önlenmesi; III) genetiği tümör NS, floresan spectra boyama etkinleşti...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated microtome blade HP35	Thermo Scientific	3150734
Microtome RM 2135	Leica	MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-aldrich	HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated	Dako	E0432	IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT	Biocare medical	BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
N-27 Supplement	ThermoFisher	A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
AGAROSE LE	GoldBio	A-201-1000
Genesee Sc. Corporation	Olympus 15 ml	21-103
Genesee Sc. Corporation	TC-75 treated Flask	25-209
Genesee Sc. Corporation	TC-25 treated Flask	25-207
DMEM/F12	Gibco	11330-057	NS media
HBSS	GibcoTM	14175-103	balanced salt solution
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse