Оценка биомаркеров в глиомы, иммуногистохимия на парафин врезанных 3D глиомы нейросферы культур

Резюме

Neurospheres выращивают как 3D культур являются мощным инструментом для изучения биологии глиомы. Здесь мы представляем протокол для выполнения иммуногистохимия при сохранении 3D структура глиомы neurospheres через встраивание парафина. Этот метод позволяет характеристика глиомы нейросферы свойств, таких как stemness и нейронных дифференциации.

Аннотация

Анализ выражения протеина в глиомы актуальна для ряда аспектов в изучении его патологии. Многочисленные белки были описаны как биомаркеров с приложениями в диагноз, прогноз, классификации, состояние прогрессии опухоли и состояния дифференцировки клеток. Эти анализы биомаркеров полезны также для характеристики опухоли neurospheres (NS) генерируется глиомы пациентов и глиомы модели. Опухоль NS обеспечивают ценный в vitro модель для оценки различных характеристик опухоли, из которого они являются производными и может более точно зеркало глиомы биологии. Здесь мы описываем метод подробный анализ биомаркеров в опухоли NS с помощью иммуногистохимия (IHC) на опухоли парафин врезанных NS.

Введение

Глиомы являются первичных твердых опухолей центральной нервной системы, классифицируются по их Фенотипические и генотипические характеристики согласно Всемирной организации здравоохранения¹. Эта классификация включает в себя наличие или отсутствие драйверов мутаций, которые представляют собой привлекательный источник биомаркеров². Биомаркеры являются биологические характеристики, которые могут быть измерены и оценены для обозначения нормальных и патологических процессов, а также фармакологических ответов на терапевтическое вмешательство³. Биомаркеры могут быть обнаружены в опухолевой ткани и клетки, полученные от глиомы, позволяя ее биологических характеристик в различных аспектах. Некоторые примеры глиомы крысы биомаркеров мутировавших isocitrate дегидрогеназа 1 (IDH1), мутант фермента, характерные для младших классов глиомы, связанные с лучше прогноза⁴. Мутировавшие IDH1 часто выражается в сочетании с TP53 и альфа талассемия/умственной отсталости синдром Х-хромосомой (ATRX)-инактивации мутации, определение конкретных глиомы подтип^4,5. ATRX-инактивации мутации также происходят в 44% педиатрических полноценного глиомы^2,6 и были связаны с агрессивными опухолями и геномная нестабильность^6,7. Кроме того педиатрических диффузных встроенные Понтийские глиомы (DIPG) продифференцируйте в подгруппах по наличие или отсутствие K27M мутации гена гистонов H3 H3F3A, или HIST1H3B/C ген^1,6. Таким образом, введение молекулярная характеристика разрешает подразделение, исследования и лечения глиомы как отдельные объекты, которые позволят более разработку более целенаправленных терапии для каждого подтипа. Кроме того анализ биомаркеров может использоваться для оценки различных биологических процессов, например апоптоз⁸, autophagy⁹, клеточный цикл прогрессии¹⁰, распространения клеток¹¹и дифференцировки клеток¹² .

Генетически модифицированные Животные модели, которые гавани генетических в человеческих раковых поражений являются критическими для изучения сигнальные пути, которые посредником прогрессирования заболевания. Наша лаборатория осуществляет использования системы Транспозаза Спящая красоты (SB) в разработке генетически модифицированные мыши модели глиомы, укрывательство специфических мутаций, которые пилки человека глиомы подтипы^13,14. Эти генетически модифицированные мыши модели используются для генерации опухоль производные NS, которые позволяют в vitro исследования в системе 3D, зеркального отображения характерных особенностей присутствует в опухоли в situ¹⁵. Кроме того orthotopical трансплантация NS в мышей может генерировать вторичные опухоли, которые сохраняют особенности первичной опухоли и имитировать гистопатологические, геномных и фенотипических свойств соответствующей первичной опухоли¹⁵.

Сыворотка свободной культуры мозге опухолевых клеток со свойствами стволовых клеток может быть расширен, в присутствии эпидермальный фактор роста (EGF) и факторы роста фибробластов (ФБП), их можно выращивать как единый колоний клеток, полученных как NS культур. В этой системе выборочной культуры большинство дифференциации или дифференцированных клеток быстро умирают, тогда как стволовые клетки разделяют и формируют сотовой кластеров. Это позволяет генерации NS культуры, которая поддерживает глиомы опухоли особенности^16,17,18. Глиомы NS может использоваться для оценки некоторых аспектов опухоли биологии, включая анализ биомаркеров, которые находят применение в диагностике, прогноз, классификации, состояние прогрессии опухоли и состояния дифференцировки клеток. Здесь, мы подробно протокол для создания глиомы NS и вставлять 3D культур в парафин используемый для окрашивания IHC. Одним из преимуществ установления и внедрения глиомы NS является, что морфология NS поддерживается лучше по сравнению с обычными cytospin метод¹⁹, в котором глиомы NS подвергаются стрессовым манипуляции для диссоциации клеток и стали плоскими. Кроме того внедрение утоляет любое выражение эндогенного Флюорофор от генетически опухоли NS, позволяя окрашивание через флуоресцентные спектров. Общая цель этого метода является сохранение 3D структура клеток глиомы через парафин, встраивание процесс и дать характеристику neurospheres глиомы, используя иммуногистохимия.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Мичиган.

1. поколение Neurospheres опухоли мозга, производных от модели мыши

1. Перед процедурой рассечение, подготовить нервных стволовых клеток СМИ (средства массовой информации НСК: DMEM/F12 с 1 x B27 дополнение, дополнение 1 x N2, 1 x normocin и 1 x антибиотик/противогрибковое дополнена человеческого рекомбинантного EGF и basic ФБП в концентрации 20 нг/мл каждый). Залейте 1,5 мл 300 мкл НСК СМИ и зарезервировать для позже.
2. Выберите мышь с большой опухоли.
   Примечание: Размер опухоли может контролироваться биолюминесценции если плазмида или вирус вводится кодирует люциферин. Как правило большой опухоли имеет биолюминесценции > 10⁶ фотоны/s/см²/sr.
3. Усыпить мышь с передозировкой изофлюрановая: наполнить папиросной бумаги с изофлюрановая и ввести ткани в euthanization камере, избегая прямого контакта с мышей для предотвращения раздражения. Подождите, пока мышь не показывать педали рефлекс (обычно 5-10 мин). Обезглавить мыши и вскрыть мозга, как описано в Кэлинеску и др. ¹³.
4. Если опухоли флуоресцентные, используйте рассечения микроскопа, оснащенного лампой дневного для определения массы опухоли в головном мозге. С тонкой щипцами вскрыть опухоли (обычно 5-7 мм в диаметре) от нормальной ткани мозга.
5. Место расчлененных опухоли в 1,5 мл тюбик с НСК СМИ (шаг 1.1). Однородный опухоль с одноразовые пластиковые пестик, который вписывается в стенах пробки microcentrifuge, применяя мягкое давление.
6. Чтобы разбить ячейки сгустки, добавляют 1 мл фермента бесплатно диссоциации СМИ и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C.
7. Фильтрации суспензии клеток через стрейнер ячейки 70 мкм и промойте ситечко с 20 мл НСК средств массовой информации.
8. Центрифуга на 300 g x 5 мин, сцеживаться супернатанта и вновь приостановить гранулы в 6 мл или 15 мл НСК СМИ, в зависимости от размера гранул.
9. Пластина суспензию опухолевых клеток в T-25 или T-75 колбу культуры и культуры при 37 ° C в инкубатор культуры ткани с атмосферой 95% воздуха и 5% CO₂.
10. После 3 дней передача здорового приостановлено NS и повторно пластины их в T-25 или T-75 колбу культуры ткани. Если необходимо, добавьте больше НСК СМИ к культуре.
    Примечание: Обычно будет смешанная популяция клеток, некоторые будет мертв, некоторые будут соблюдаться, и некоторые будут формировать NS, которая будет плавающей в средствах массовой информации

2. поддержание и пассированый NS

Примечание: Предотвратить разрастание и сохранить клетки в относительно высокой плотности. Слияние определяется размер сферы (черный центры среднего разрастание крупных сфер). Темп роста NS будет зависеть от онкогенов, используемый для создания опухоли.

1. После того, как NS культура достигла confluency, собирать культуру в стерильных пластиковых пробирок и Пелле NS на 300 x g за 5 мин.
2. Отменить супернатанта, добавить 1 мл раствора отряд клеток и Пипетка вновь приостановить гранулы.
3. Инкубируйте при 37 ° C за 5 мин, стряхивая трубку каждые 2 мин, чтобы помочь диссоциации клеток.
   Примечание: Когда NS достигают confluency, они обычно видно макроскопически как маленькие белые шары. Заверить диссоциации клеток, по крайней мере все видимые NS должна исчезли.
4. Добавьте 5 мл HBSS 1 x и пипетки несколько раз. Пелле клетки на 300 g x 5 мин отбросить супернатант. Вновь приостановите гранулы в 5 мл НСК СМИ с рекомбинантной EGF и основные ФБП.
5. Добавьте 1 mL клеток до 15 мл НСК средств массовой информации и культуры в T-75 колбу при 37 ° C в инкубатор культуры ткани с атмосферой 95% воздуха и 5% CO₂.
6. Добавите факторы роста (EGF и основные ФБП) каждые 3 дня. Если средства массовой информации превращает свет оранжевый и клетки еще не вырожденная, изменить средствами массовой информации. Чтобы сделать это, центрифуга NS на 300 g x 4 мин и вновь приостановить в НСК СМИ с факторами роста.
   Примечание: В зависимости от размера гранул сформирован, клетки может потребоваться разбить на более колбы.

3. Замораживание NS для длительного хранения

1. Когда NS культура становится вырожденная, разъединять клетки, как описано в шагах 2.1-2.4. Когда гранулы было вновь приостановлено в HBSS, удалите Алиготе и подсчитать количество ячеек.
2. Центрифуга клетки на 300 g x 4 мин и удалить как можно больше из супернатант.
3. Вновь приостановите Пелле в замораживания средств массовой информации (тепло инактивированная FBS, 10% ДМСО). Рекомендуется заблокировать между 1 x 10-⁶ и 3 х 10⁶ клеток на флакон мл.
4. Разделите снова приостановлено клетки столько криопробирки как необходимые и медленно остыть флаконы первой передачи их в лед, а затем до-20 ° C, затем до-80 ° C и, наконец, на следующий день в контейнер для хранения жидкого азота.

4. Фиксация опухоли NS

1. Культура опухоли NS в T-25 колбу для 2-3 дня до тех пор, пока клетки вырожденная (~ 3 х 10⁶ клеток). Соберите опухоли NS в 15 мл Конические трубки от наименее один T-25 вырожденная колбу. Окатышей на 300 g x 5 мин.
2. Вновь приостановить гранулы в 1 мл 10% формалина и держать при комнатной температуре (RT) на 10 минут добавить 5 мл 1 x HBSS и Пелле клетки, как это сделано в шаге 3.2. Повторите этот шаг еще раз.
3. Место 15 мл Конические трубки, содержащие гранул на льду.

5. Парафинотерапия встраивание опухоли NS

1. Вновь приостановить промывают Пелле NS в 500 мкл 2% теплую жидкость агарозы и осторожно перемешать, закупорить.
2. Сразу же место агарозы встроенный NS на льду до тех пор, пока polymerizes агарозы. Удалите часть агарозы укрывательство NS. Поместите полимеризованной агарозы кусок с NS в кассету для ткани, обработки (рис. 2).
3. Продолжить обработку ткани (с использованием процессора автоматический парафин) и парафина, встраивание (с помощью внедрения станции).

6. Вырезание от парафин врезанных NS

1. Установить ванну водой до 42 ° C и вставить лезвие на микротом, тщательно с использованием две кисти, чтобы убедиться, что он выровнен. Используйте этот блейд только для обрезки.
2. Поместите блок парафина на микротома. Недоминирующих рукой нажмите вниз на рычаг, расположенный на левой стороне, определяющее толщину каждого раздела. Нажмите для второй остановки, указывающее толщиной 30 мкм.
3. Начать, обрезка блока (т.е., удаление избыточного парафина), повернув колесо грубая рука с правой рукой, пока не достигнут поверхности образца. На данный момент отпустите рычаг, который управляет отделку толщиной до 10 мкм или 5 мкм. Остановите обрезки при достижении поверхности образца.
4. Заполните поле льда со льдом и добавить достаточно воды, так что когда парафин блок устанавливается на льду, вода действует как фильм вокруг блока парафин, защищая его от непосредственно прикосновение льда. Инкубируйте блоком парафина на льду за 20 мин.
5. Отказаться от старых лезвие и вставить новый для разрезания. Сухой блок с помощью Марли, затем поместить его на микротома.
6. Недоминирующих рукой получите пару Изогнутый пинцет, который будет использоваться для тянуть ленте парафина. Держите влажной кистью возле правой рукой, которая будет использоваться для передачи ленты парафина на водяной бане. Начать раздел, повернув колесо грубая рука с правой рукой в быстром темпе. Используйте щипцы в левой руке провести ленте парафина.
7. Использование влажной кистью для передачи ленты парафина на водяной бане.
8. Используйте кривой щипцы для развалится разделы поверхностно размещение щипцы между двумя парафиновых срезах, а затем осторожно нажав две секции прочь.
   Примечание: Это движение должно быть полностью на поверхности раздела парафина. Не нажимайте на секции.
9. Использование влажной кистью подтолкнуть разлученных парафиновых срезах на скольжениях микроскопа положительно заряженных адгезии.
10. Разрешить слайды для сухой ночлег перед их сохранением в слайд коробки внутри химические вытяжки. Хранения слайдов зависит от типа выполняется пятно.

7. иммуногистохимия (IHC) парафин врезанных NS

1. Расплава парафина, поместив слайды в металлический стеллаж и инкубации их на 60 ° C в течение 20 мин.
2. Deparaffinize слайды по инкубации в поезде регидратации в RT: 3 x ксилоле на 5 мин, 100% этанола 2 x 2 мин., 95% этиловом спирте 2 x 2 мин, этанол 70% 1 x 2 мин и 1 x деионизированной воды на 2 мин Ирэон, держите слайды в водопроводной воде до получения антигена , как высыхание вызовет неспецифической антитела связывая.
3. Инкубируйте слайды в буфере цитрат (10 мм лимонной кислоты, 0,05% неионные моющего средства, pH 6) при 125 ° C для 30 s и на 90 ° C для 10 s. Дайте им остыть, затем ополосните слайды 5 раз с дистиллированной водой.
4. Инкубируйте слайды в РТ в 0,3% H₂O₂ за 30 минут.
5. Вымойте слайды 3 раза отмывающего буфера (0,025% моющего средства в TBS) на 5 мин с нежным агитации.
6. Инкубируйте слайды на RT с блокировкой раствора (10% лошадь сыворотки, 0.1% BSA в TBS) за 30 мин.
7. Инкубируйте слайды на ночь при 4 ° C в камере увлажненный с основного антитела, подготовленный в разведении раствора (0,1% BSA в TBS). Вымойте слайды 3 раза отмывающего буфера на 5 мин с нежным агитации.
8. Инкубируйте слайды в РТ за 1 ч с биотинилированным вторичное антитело, подготовленный в разведении раствора. Вымойте слайды 3 раза отмывающего буфера на 5 мин с нежным агитации.
9. Инкубируйте слайды на RT в темноте за 30 минут с авидин биотинилированным пероксидаза комплекса. Вымойте слайды 3 раза отмывающего буфера на 5 мин с нежным агитации.
10. Инкубируйте слайды с DAB-H₂O₂ субстрата брендов здесь для 2-5 мин на RT.
11. 3 раза Промыть водопроводной воды. DIP (1-2 сек) слайды, в решение гематоксилином изображение и тщательно промойте их в водопроводной воде до очистки.
12. Обезвоживает слайды следующим: инкубировать в дистиллированной воде в течение 2 мин, окуните 3 раза в 80% этанола, инкубировать в 95% спирте 2 раза по 2 мин, инкубировать в 100% этиловом спирте 2 раза по 2 мин каждая и наконец в ксилоле 3 раза за 3 мин.
13. Coverslip слайды с средство на основе ксилол монтажа и дайте им высохнуть на плоской поверхности на RT, пока они не готовы для обработки изображений.       Примечание: Если выполнение 3, 3'-диаминобензидин (DAB) окрашивание, слайды могут храниться на RT. Однако если выполняется окрашивание иммунофлюоресценции, слайды должны храниться в темноте на 20 ° C до уменьшения обесцвечивания фото.

Результаты

Для мониторинга развития опухоли и оценить, если опухоль достигла размера, необходимого для создания NS, мы проанализировали люминесценции, испускаемых опухоли с помощью биолюминесценции. Это позволяет исследование эффективности трансдукции детенышей и прогрессии о...

Обсуждение

В этой статье мы подробно универсальным и воспроизводимый метод, чтобы выполнить иммуногистохимия на парафин врезанных глиомы NS, которые поддерживают характерным 3D структура клеток опухоли, растущие в мозг в situ. Этот метод имеет следующие преимущества по сравнению с использовани...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated microtome blade HP35	Thermo Scientific	3150734
Microtome RM 2135	Leica	MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-aldrich	HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated	Dako	E0432	IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT	Biocare medical	BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
N-27 Supplement	ThermoFisher	A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
AGAROSE LE	GoldBio	A-201-1000
Genesee Sc. Corporation	Olympus 15 ml	21-103
Genesee Sc. Corporation	TC-75 treated Flask	25-209
Genesee Sc. Corporation	TC-25 treated Flask	25-207
DMEM/F12	Gibco	11330-057	NS media
HBSS	GibcoTM	14175-103	balanced salt solution
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse