Valutazione di biomarcatori in Glioma mediante immunoistochimica su paraffina 3D Glioma Neurosphere culture

Riepilogo

Neurosfere coltivate come 3D culture costituiscono un potente strumento per studiare la biologia di glioma. Qui presentiamo un protocollo per eseguire esame immuno-istochimico pur mantenendo la struttura 3D di glioma neurosfere mediante inclusione in paraffina. Questo metodo consente la caratterizzazione delle proprietà neurosphere glioma ad esempio di staminalità e del differenziamento neurale.

Abstract

Analisi dell'espressione proteica in glioma sono rilevante per diversi aspetti nello studio della sua patologia. Numerose proteine sono state descritte come biomarcatori con applicazioni nella diagnosi, prognosi, classificazione, stato di progressione del tumore e stato di differenziazione delle cellule. Queste analisi di biomarcatori sono anche utili per caratterizzare tumore neurosfere (NS) generato da glioma pazienti e modelli di glioma. Tumore NS forniscono un modello prezioso in vitro per valutare diverse caratteristiche del tumore da cui sono derivate e più accuratamente possibile specchio glioma biologia. Qui descriviamo un metodo dettagliato per analizzare biomarcatori nel tumore NS usando immunohistochemistry (IHC) su paraffina-incastonato del tumore NS.

Introduzione

I gliomi sono i tumori solidi primari del sistema nervoso centrale classificati dalle loro caratteristiche fenotipiche e genotipiche secondo l' organizzazione mondiale della sanità¹. Questa classificazione incorpora la presenza o l'assenza di mutazioni di driver, che rappresentano una fonte interessante di biomarcatori². Biomarcatori sono caratteristiche biologiche che possono essere misurate e valutate per indicare processi normali e patologici, come pure la risposta farmacologica ad un intervento terapeutico³. Biomarcatori possono essere rilevati nel tessuto del tumore e cellule derivate da glioma, permettendo la sua caratterizzazione biologica in diversi aspetti. Alcuni esempi di biomarcatori di glioma mutato Isocitrato deidrogenasi 1 (IDH1), un enzima del mutante caratteristico dei gliomas di qualità inferiore connesso con migliore prognosi⁴. IDH1 mutato è espressa frequentemente in combinazione con TP53 e sindrome ritardo mentale/di alfa-talassemia X-collegata (ATRX)-mutazioni inattivanti, definendo un glioma specifico sottotipo^4,5. Mutazioni inattivanti ATRX anche verificano nel 44% dei gliomas di prima scelta pediatrica^2,6 e sono state associate con i tumori aggressivi e l'instabilità genomica^6,7. Inoltre, i gliomi pontine intrinseci diffusi pediatrici (DIPG) sono differenziati in sottogruppi secondo la presenza o l'assenza di una mutazione K27M nel gene di istone H3 H3F3A o in HIST1H3B/C gene^1,6. Pertanto, l'introduzione di caratterizzazione molecolare permette la suddivisione, studio e trattamento dei gliomi come entità separate, che più vi permetterà lo sviluppo di ulteriori terapie per ogni sottotipo mirate. Inoltre, l'analisi dei biomarker può essere utilizzato per valutare i diversi processi biologici quali apoptosi⁸, autofagia⁹, ciclo cellulare progressione¹⁰, cellula proliferazione¹¹e differenziazione delle cellule¹² .

Modelli animali geneticamente ingegnerizzati che harbor le lesioni genetiche presenti nei cancri umani sono fondamentali per lo studio delle vie che mediano di progressione di malattia di segnalazione. Il nostro laboratorio ha implementato l'utilizzo del sistema transposase Sleeping Beauty (SB) per sviluppare modelli murini geneticamente di glioma che harboring le mutazioni specifiche che ricapitolano glioma umano sottotipi^13,14. Caratteristiche salienti del mirroring presentano nei tumori in situ¹⁵, questi modelli murini geneticamente sono utilizzati per la generazione di NS tumore-derivato, che consentono gli studi in vitro in un sistema 3D. Inoltre, il trapianto di orthotopical di NS nei topi può generare tumori secondari che conservano le caratteristiche del tumore primario e imitano le proprietà istopatologiche, genomiche e fenotipiche del tumore primario corrispondente¹⁵.

Nella coltura privo di siero, cellule di tumore cerebrale con proprietà delle cellule staminali possono essere arricchite e in presenza di fattori di crescita epidermici (EGF) e fattori di crescita del fibroblasto (FGF), può essere coltivate come singole colonie di cellule derivate come culture NS. In questo sistema di coltura selettiva, la maggior parte delle cellule di differenziazione o differenziate rapidamente muoiono, mentre cellule staminali dividere e formare i cluster cellulari. Questo consente la generazione di una cultura di NS che mantiene glioma tumore caratteristiche^16,17,18. Glioma NS può essere utilizzato per valutare diversi aspetti della biologia del tumore, tra cui l'analisi di biomarcatori che hanno applicazioni nella diagnosi, prognosi, classificazione, stato di progressione del tumore e stato di differenziazione delle cellule. Qui, abbiamo dettaglio un protocollo per generare glioma NS e incorporare le culture 3D in paraffina per essere utilizzato per la colorazione IHC. Uno dei vantaggi di fissaggio e l'incorporamento di glioma NS è che la morfologia del NS è mantenuta meglio rispetto ai convenzionali cytospin metodo¹⁹, in cui glioma NS sono sottoposti a manipolazione stressante per dissociazione delle cellule e diventare appiattito. Inoltre, l'incorporamento estingue qualsiasi espressione endogena fluoroforo da tumore geneticamente NS, consentendo la colorazione attraverso gli spettri di fluorescenza. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di preservare la struttura 3D delle cellule di glioma attraverso una processo di inclusione a paraffina e consentire la caratterizzazione di glioma neurosfere usando immunohistochemistry.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università del Michigan.

1. generazione di cervello tumore neurosfere derivata da un modello di Mouse

1. Prima della procedura di dissezione, preparare i supporti delle cellule staminali neurali (NSC Media: DMEM/F12 con 1 supplemento di x B27, 1 x N2 supplemento, 1 x normocin e 1 x antibiotico/antimicotico completati con umana ricombinante EGF e basic-FGF alle concentrazioni di 20 ng/mL). Riempire una provetta da 1,5 mL con 300 µ l di media di NSC e prenotare per più tardi.
2. Selezionare un mouse con un grande tumore.
   Nota: Se il virus iniettato o plasmide codifica luciferina, la dimensione di un tumore può essere monitorata da bioluminescenza. Di solito, un grande tumore ha una bioluminescenza di > 10⁶ fotoni/s/cm²/sr.
3. Eutanasia il mouse con un sovradosaggio di isoflurano: infondere una carta velina con isoflurano e introdurre il tessuto in una camera di euthanization, evitando il contatto diretto con i topi per evitare irritazioni. Attendere che i topi non mostrano un riflesso pedale (solitamente 5-10 min). Decapitare il mouse e sezionare il cervello come descritto in Calinescu et al. ¹³.
4. Se i tumori sono fluorescenti, è possibile utilizzare un microscopio per dissezione equipaggiato con una lampada fluorescente per identificare la massa tumorale all'interno del cervello. Con una pinzetta, sezionare il tumore (di solito 5-7 mm di diametro) dal tessuto cerebrale normale.
5. Posto il tumore dissecato nel tubo da 1,5 mL con media di NSC (punto 1.1). Omogeneizzare il tumore con un pestello di plastica usa e getta che si inserisce nelle pareti del tubo del microcentrifuge applicando pressione delicata.
6. Per dissociare i grumi di cellule, aggiungere 1 mL di media senza enzima dissociazione e incubare per 5 min a 37 ° C.
7. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella 70 µm e lavare il filtro con 20 mL di media di NSC.
8. Centrifugare a 300 x g per 5 min, decantare il supernatante e risospendere il pellet in 6 mL o 15 mL di media di NSC, a seconda della dimensione del pellet.
9. Piastra di sospensione delle cellule del tumore in un matraccio di cultura T-25 o T-75 e la coltura a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto con un'atmosfera di 95% aria e 5% CO₂.
10. Dopo 3 giorni, trasferire il NS sospeso sano e ri-impiattatelo in un matraccio di cultura del tessuto T-25 o T-75. Se necessario, è possibile aggiungere ulteriori NSC media alla cultura.
    Nota: Solitamente ci sarà una popolazione mista di cellule, alcuni saranno morti, alcuni vi hanno aderito, e alcuni si forma NS che sarà galleggiante nella media

2. mantenere e passaggio il NS

Nota: Prevenire la crescita eccessiva e mantenere le cellule relativamente ad alta densità. Confluenza è determinata dalla dimensione di sfere (neri centri delle sfere grandi media crescita eccessiva). Il tasso di crescita del NS dipenderà gli oncogeni utilizzati per generare tumori.

1. Una volta che la cultura di NS ha raggiunto la confluenza, raccogliere la coltura in una provetta sterile e pellet il NS a 300 x g per 5 min.
2. Eliminare il supernatante, aggiungere 1 mL della soluzione di distacco delle cellule e pipettare per risospendere il pellet.
3. Incubare a 37 ° C per 5 min, sfogliando il tubo ogni 2 min per aiutare la dissociazione delle cellule.
   Nota: Quando NS raggiungere confluency, possono essere solitamente visti in modo macroscopico come piccole sfere bianche. Per assicurare la dissociazione delle cellule, almeno tutti i NS visibile deve sono scomparsi.
4. Aggiungere 5 mL di HBSS 1 x e pipetta parecchie volte. Cellule di pellet a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 5 mL di media di NSC completati con EGF ricombinante e basic-FGF.
5. Aggiungere 1 mL di cellule a 15 mL di NSC media e cultura in un fiasco di T-75 a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto con un'atmosfera di 95% aria e 5% CO₂.
6. Aggiungere fattori di crescita (EGF e basic-FGF) ogni 3 giorni. Se i media si trasforma in luce arancione e le cellule non sono ancora confluenti, cambiare il supporto. Per effettuare questa operazione, centrifugare il NS a 300 x g per 4 min e risospendere in media di NSC completati con fattori di crescita.
   Nota: A seconda della dimensione del pellet formata, cellule potrebbero essere necessario suddividere più palloni.

3. congelamento NS per immagazzinaggio a lungo termine

1. Quando la cultura di NS diventa confluente, dissociare le cellule come descritto ai punti 2.1-2.4. Una volta che il pellet è stato risospeso in HBSS, rimuovere un'aliquota e contare le celle.
2. Centrifugare le cellule a 300 x g per 4 minuti e rimuovere per quanto possibile del surnatante.
3. Risospendere il pellet in media (inattivati FBS, 10% DMSO) di congelamento. Si consiglia di congelare tra 1 x 10⁶ e 3 x 10⁶ cellule per fiala al mL.
4. Dividere le cellule risospese in cryovials come molti come necessario e lentamente raffreddare le fiale prima trasferendoli al ghiaccio, quindi a-20 ° C, quindi a-80 ° C e, infine, il giorno successivo per un contenitore di stoccaggio di azoto liquido.

4. fissazione di tumore NS

1. Tumore di cultura NS in un fiasco di T-25 per 2-3 giorni fino a quando le cellule sono confluenti (~ 3 x 10⁶ cellule). Raccogliere tumore NS in una provetta conica da 15 mL da un'almeno una boccetta di confluenti di T-25. A pellet a 300 x g per 5 min.
2. Risospendere il pellet in 1 mL di formalina al 10% e mantenere a temperatura ambiente (TA) per 10 min. aggiungere 5 mL di 1 x HBSS e appallottolare le celle come fatto nel passo 3.2. Ripetere questo passaggio un'altra volta.
3. Posizionare il tubo conico da 15 mL contenente il precipitato sul ghiaccio.

5. paraffina incorporamento del tumore NS

1. Risospendere il pellet di NS lavato in 500 µ l di 2% agarosio liquido caldo e mescolare dolcemente pipettando.
2. Posizionare immediatamente la NS incorporato dell'agarosi su ghiaccio fino a quando l'agarosio polimerizza. Rimuovere il pezzo di agarosio che harboring il NS. Posizionare il pezzo di agarosio polimerizzata con la NS nel cassetto per lavorazione (Figura 2) del tessuto.
3. Continuare con l'elaborazione del tessuto (utilizzando un processore automatico paraffina) e l'incorporamento (utilizza una stazione di incorporamento) di paraffina.

6. la divisione dei NS paraffina

1. Impostare il bagno di acqua a 42 ° C e inserire la lama del microtomo attentamente utilizzando due pennelli per assicurarsi che si è livellato. Utilizzare questa lama solo per la guarnizione.
2. Posizionare il blocco di paraffina del microtomo. Con la mano non dominante, premere la leva posizionata sul lato sinistro che controlla lo spessore di ogni sezione. Premere per la seconda tappa che indica uno spessore di 30 µm.
3. Iniziare a tagliare il blocco (cioè., rimozione di paraffina in eccesso) girando la rotella di mano grossolana con la mano destra fino a raggiunta la superficie del campione. A questo punto, rilasciare la leva che controlla lo spessore taglio a 10 μm o 5 μm. Smettere di taglio quando si raggiunge la superficie del campione.
4. Riempire una scatola di ghiaccio con ghiaccio e aggiungere acqua quanto basta in modo che quando il blocco di paraffina è collocato sul ghiaccio, l'acqua agisce come un film intorno al blocco di paraffina, proteggendolo da toccare direttamente il ghiaccio. Incubare il blocco di paraffina in ghiaccio per 20 min.
5. Scartare la vecchia lama e inserire uno nuovo per il sezionamento. Blocco a secco utilizzando garza, poi metterlo sul microtomo.
6. Con la mano non dominante, ottenere un paio di forcipe curvo che verrà utilizzato per tirare il nastro di paraffina. Tenere un pennello umido vicino alla mano destra, che verrà utilizzato per trasferire il nastro di paraffina a bagnomaria. Cominciano a sezione girando la rotella di mano grossolana con la mano destra ad un veloce ritmo. Utilizzare la pinza nella mano sinistra per tenere il nastro di paraffina.
7. Utilizzare il pennello umido per trasferire il nastro di paraffina a bagnomaria.
8. Utilizzare la curva delle pinze per suddividere le sezioni superficialmente ponendo il forcipe tra due sezioni di paraffina, quindi spingere delicatamente le due sezioni di distanza.
   Nota: Questo movimento dovrebbe essere interamente sulla superficie della sezione di paraffina. Non premere la sezione.
9. Utilizzare il pennello umido per spingere le sezioni separate paraffina su vetrini da microscopio adesione positivamente caricati.
10. Lasciare i vetrini per asciugare durante la notte all'interno di una cappa chimica prima di riporli in scatole di diapositiva. L'archiviazione di diapositive dipende dal tipo di macchia eseguita.

7. esame immuno-istochimico (IHC) di paraffina NS

1. Fate sciogliere la paraffina posizionando i vetrini in un rack di metallo e incubarle a 60 ° C per 20 min.
2. Deparaffinizzare le diapositive tramite incubazione in un treno di reidratazione a RT: 3x xilene per 5 min, 100% etanolo di 2x per 2 min, etanolo al 95% x 2 per 2 min, etanolo al 70% 1x per 2 min e 1 x acqua deionizzata per 2 min Hereon, tenere i vetrini in acqua di rubinetto fino al ricupero dell'antigene , come essiccazione causerà il legame non specifico anticorpo.
3. Incubare i vetrini in tampone citrato (acido citrico 10 mM, detergente non ionico 0.05%, pH 6) a 125 ° C per 30 s e a 90 ° C per 10 s. Lasciatele raffreddare, quindi sciacquare i vetrini 5 volte con acqua distillata.
4. Incubare i vetrini a temperatura ambiente in 0,3% H₂O₂ per 30 min.
5. Lavare i vetrini 3 volte in tampone (0.025% detergente in TBS) per 5 min con agitazione delicata di lavaggio.
6. Incubare i vetrini a temperatura ambiente con blocco soluzione (siero di cavallo di 10%, 0,1% BSA in TBS) per 30 min.
7. Incubare i vetrini durante la notte a 4 ° C in una camera umidificata con l'anticorpo primario preparato in diluizione soluzione (0,1% BSA in TBS). Lavare i vetrini 3 volte in tampone per 5 minuti con agitazione delicata di lavaggio.
8. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 1 h con anticorpo secondario biotinilato preparato in soluzione di diluizione. Lavare i vetrini 3 volte in tampone per 5 minuti con agitazione delicata di lavaggio.
9. Incubare i vetrini a temperatura ambiente al buio per 30 min con perossidasi di rafano avidina-biotinylated complessa. Lavare i vetrini 3 volte in tampone per 5 minuti con agitazione delicata di lavaggio.
10. Incubare i vetrini con DAB-H₂O₂ substrato marche qui per 2-5 minuti a TA.
11. Lavare 3 volte con acqua di rubinetto. Immergere (1-2 s) i vetrini nella soluzione di ematossilina di colorante di contrasto e sciacquarli in acqua di rubinetto fino a schiarimento.
12. Disidratare i vetrini come segue: Incubare in acqua distillata per 2 min, immergere 3 volte in 80% etanolo, Incubare in etanolo al 95% 2 volte per 2 minuti ciascuno, Incubare in etanolo 100% 2 volte per 2 minuti ciascuno e infine in xilene per 3 min ciascuno per 3 volte.
13. Vetrino coprioggetti i vetrini con un mezzo di montaggio a base di xilene e lasciarli asciugare su una superficie piana a RT fino a quando non sono pronti per l'imaging.       Nota: Se eseguendo 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) colorazione, le diapositive possono essere memorizzate a TA. Tuttavia, se viene eseguita la colorazione di immunofluorescenza, i vetrini devono essere conservati al buio a-20 ° C per ridurre foto-candeggio.

Risultati

Per monitorare lo sviluppo del tumore e valutare se il tumore ha raggiunto le dimensioni necessarie per generare NS, abbiamo analizzato la luminescenza emessa dai tumori tramite bioluminescenza. Questo consente lo studio dell'efficienza di trasduzione nei cuccioli e la progressione del tumore dal segnale di luminescenza della luciferasi (Figura 1A e 1B). Quando le dimensioni del tumore raggiungono un segnale di 1 x 10⁷

Discussione

In questo articolo, abbiamo dettaglio un metodo versatile e riproducibile per eseguire esame immuno-istochimico su paraffina glioma NS, che mantengono la caratteristica struttura 3D delle cellule del tumore crescendo nel cervello in situ. Questa tecnica possiede i seguenti vantaggi rispetto all'utilizzo di cellule piastrate su vetro o superfici in plastica: io) conservazione della struttura 3D del NS; II) evitando di stress di dissociazione di cella prima dell'analisi dell'espressione della proteina; III) tempra...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated microtome blade HP35	Thermo Scientific	3150734
Microtome RM 2135	Leica	MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-aldrich	HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated	Dako	E0432	IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT	Biocare medical	BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
N-27 Supplement	ThermoFisher	A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
AGAROSE LE	GoldBio	A-201-1000
Genesee Sc. Corporation	Olympus 15 ml	21-103
Genesee Sc. Corporation	TC-75 treated Flask	25-209
Genesee Sc. Corporation	TC-25 treated Flask	25-207
DMEM/F12	Gibco	11330-057	NS media
HBSS	GibcoTM	14175-103	balanced salt solution
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse