Bewertung von Biomarkern in Gliom von Immunohistochemistry auf Paraffin-eingebetteten 3D Gliom Neurosphäre Kulturen

Zusammenfassung

Neurosphären als 3D Kulturen angebaut sind ein mächtiges Werkzeug um Gliom Biologie zu studieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Immunohistochemistry durchführen unter Beibehaltung der 3D-Struktur von Gliom Neurospheres durch Paraffin einbetten. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Gliom Neurosphäre Eigenschaften wie Stemness und neuronale Differenzierung.

Zusammenfassung

Analyse der Proteinexpression in Gliom ist relevant für verschiedene Aspekte in der Studie von seiner Pathologie. Zahlreiche Proteine wurden als Biomarker mit Anwendungen in der Diagnose, Prognose, Klassifizierung, Zustand der Tumorprogression und Differenzierung Zellstatus beschrieben. Diese Analysen der Biomarker eignen sich auch zur Charakterisierung der Tumor Neurosphären (NS) aus Gliom Patienten und Gliom Modelle generiert. Tumor-NS bieten eine wertvolle in-vitro- Modell, um verschiedene Funktionen des Tumors zu beurteilen, aus denen sie stammen und können genauer Spiegel Gliom Biologie. Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Analyse von Biomarkern im Tumor NS mit Immunhistochemie (IHC) auf Paraffin-eingebetteten Tumor NS.

Einleitung

Gliome sind primäre soliden Tumoren des zentralen Nervensystems durch ihre genotypischen und phänotypischen Merkmale gemäß der Weltgesundheitsorganisation (WHO)¹eingestuft. Diese Einteilung beinhaltet das Vorhandensein oder Fehlen der Fahrer Mutationen, die eine attraktive Biomarker²darstellen. Biomarker sind biologische Merkmale, die gemessen und ausgewertet, um normale und pathologische Prozesse sowie pharmakologische Reaktionen auf eine therapeutische Intervention³zeigen werden. Biomarker können erkannt werden in Tumor-Gewebe und Zellen aus Gliom, so dass seine biologische Charakterisierung in verschiedenen Aspekten. Einige Beispiele für Gliom Biomarker mutierten Isocitrate Dehydrogenase 1 (IDH1), ein mutiertes Enzym charakteristisch für minderwertigen Gliome bessere Prognose⁴zugeordnet. Mutiertes IDH1 drückt sich häufig in Kombination mit TP53 und Alpha-Thalassämie/Mentale Retardierung Syndrom X-chromosomal (ATRX)-Inaktivierung Mutationen,^4,5Subtyp definieren einen bestimmten Gliom. ATRX-Inaktivierung Mutationen auch in 44 % der pädiatrischen hochgradige Gliome^2,6 auftreten und aggressive Tumoren und genomische Instabilität^6,7zugeordnet wurden. Darüber hinaus unterscheiden sich die pädiatrische diffus intrinsische Pontinische Gliome (DIPG) in Untergruppen nach dem Vorhandensein oder Fehlen einer K27M Mutation in Histon H3 gen H3F3A oder in der HIST1H3B/C gen^1,6. Daher die Einführung der molekularen Charakterisierung erlaubt die Unterteilung, Erforschung und Behandlung von Gliomen als getrennte Einheiten, wodurch mehr die Entwicklung von mehr gezielte Therapien für jeden Subtyp. Darüber hinaus kann die Analyse von Biomarkern verwendet werden, um unterschiedliche biologische Prozesse z. B. Apoptose⁸Autophagie⁹, Zellzyklus Progression¹⁰, Zelle Verbreitung¹¹und Zelldifferenzierung^{12 bewerten} .

Gentechnisch hergestellte Tiermodellen, die die genetischen Veränderungen im menschlichen Krebserkrankungen Hafen sind entscheidend für das Studium der Signalwege, die Progression der Erkrankung zu vermitteln. Unser Labor hat die Verwendung von Sleeping Beauty (SB) Transposase System entwickeln gentechnisch veränderter Mausmodelle der Gliom beherbergen bestimmte Mutationen, die menschlichen Gliom Subtypen^13,14rekapitulieren umgesetzt. Diese gentechnisch veränderte Mausmodelle dienen zur Erzeugung von Tumor-abgeleitete NS, die in-vitro- Studien in einem 3D System ermöglichen, Spiegelung hervorstechenden Merkmale präsentieren in der Tumoren in Situ¹⁵. Die Orthotopical Transplantation von NS auf Mäuse kann auch sekundäre Tumoren generieren, die Funktionen des Primärtumors zu behalten und imitieren die histopathologischen, genomischen und phänotypischen Eigenschaften der entsprechenden Primärtumors¹⁵.

In serumfreien Kultur Gehirn-Tumor-Zellen mit Stammzellen Eigenschaften angereichert werden können, und im Beisein von epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF), können sie als einzelne Zelle abgeleitet Kolonien wie NS Kulturen angebaut werden. In diesem selektiven Kultursystem sterben die meisten differenzierende oder differenzierte Zellen schnell, während Stammzellen teilen und die zelluläre Cluster bilden. Dies ermöglicht die Erzeugung einer NS-Kultur, die Gliom Tumor Merkmale^16,17,18unterhält. Gliom NS kann verwendet werden, um verschiedene Aspekte der Tumorbiologie, einschließlich der Analyse von Biomarkern, die Anwendungen in Diagnose, Prognose, Klassifizierung, Zustand der Tumorprogression und Zellstatus Differenzierung zu bewerten. Hier haben wir ein Protokoll zum Gliom NS zu generieren und Einbinden der 3D Kulturen in Paraffin verwendet werden ausführlich für IHC beflecken. Ein Vorteil von Befestigung und Einbettung Gliom NS ist, dass die Morphologie der NS ist besser im Vergleich zu den herkömmlichen Cytospin Methode¹⁹, gepflegt, in welche Gliom NS stressig Manipulation für Zelle Dissoziation unterliegen und abgeflacht werden. Darüber hinaus stillt die Einbettung beliebiger endogenen Fluorophor Ausdruck aus gentechnisch veränderter Tumor NS, Färbung über die fluoreszierenden Spektren ermöglichen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die 3D-Struktur Gliom Zellen durch ein Paraffin einbetten Prozess erhalten und Charakterisierung von Gliom Neurospheres verwenden Immunohistochemistry zu ermöglichen.

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Michigan genehmigt.

1. Generation von Gehirn Tumor Neurospheres abgeleitet von einem Maus-Modell

1. Bereiten Sie vor dem Eingriff Dissektion neurale Stammzellen Medien (NSC-Medien: DMEM/F12 mit 1 x B27 Ergänzung, 1 x N2 Ergänzung, 1 X Normocin und 1 X Antibiotikum/antimykotische ergänzt mit menschlichen rekombinanten EGF und Basic-FGF bei Konzentrationen von 20 ng/mL). Füllen Sie eine 1,5 mL-Tube mit 300 µL der NSC Medien und für später reservieren.
2. Wählen Sie eine Maus mit einem großen Tumor.
   Hinweis: Die Größe eines Tumors kann von Biolumineszenz überwacht werden, wenn das Plasmid oder Virus injiziert Luciferin kodiert. In der Regel hat ein großer Tumor eine Biolumineszenz von > 10⁶ Photonen/s/cm²/sr.
3. Die Maus mit einer Überdosis Isofluran einschläfern: Infusion ein Seidenpapier mit Isofluran und einführen des Gewebes in einer Euthanization-Kammer, Vermeidung von direktem Kontakt mit den Mäusen zu Irritationen vorzubeugen. Warten Sie, bis die Mäuse keinen Pedalen Reflex (in der Regel ca. 5-10 min) zeigen. Enthaupten Sie die Maus und sezieren Sie das Gehirn zu, wie beschrieben in Calinescu Et al. ¹³.
4. Wenn die Tumoren fluoreszierend sind, ausgestattet mit einer Leuchtstofflampe sezierenden Mikroskop verwenden Sie, um die Tumor-Masse im Gehirn zu identifizieren. Mit einer feinen Pinzette Sezieren des Tumors (in der Regel 5 bis 7 mm Durchmesser) aus dem normalen Hirngewebe.
5. Ort der seziert Tumor in der 1,5 mL Tube mit NSC Medien (Schritt 1.1). Den Tumor mit einem Einweg-Kunststoff-Stößel, die in den Wänden der Microcentrifuge Schlauch passt durch sanften Druck zu homogenisieren.
6. Die Zelle Klumpen zu distanzieren, 1 mL der enzymfreien Dissoziation Medien hinzufügen und 5 min bei 37 ° c inkubieren
7. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 µm Zelle Sieb und waschen Sie das Sieb mit 20 mL der NSC-Medien.
8. 300 X g für 5 min Zentrifugieren Sie, abgießen Sie überstand und wieder auszusetzen Sie das Pellet in 6 mL oder 15 mL NSC Medien, abhängig von der Größe der Pellets.
9. Platte die Zellsuspension Tumor zu einem t-25 oder T-75 Kultur Kolben und Kultur bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator mit einer Atmosphäre von 95 % Luft und 5 % CO₂.
10. Nach 3 Tagen übertragen die gesunde abgehängte NS und Platte sie erneut in einem t-25 oder T-75 Gewebekultur-Kolben. Falls erforderlich, fügen Sie mehr NSC Medien zur Kultur.
    Hinweis: Es werden in der Regel eine gemischte Population von Zellen, einige werden tot, einige wird eingehalten haben, und einige werden bilden NS, die in den Medien schwimmen werden

2. Erhaltung und Passagierung der NS

Hinweis: Verhindern Sie übermäßiges Wachstum und erhalten Sie Zellen in relativ hoher Dichte zu. Confluence ist durch Sphären Größe (schwarze Zentren der großen Kugeln bedeuten Überwucherung) bestimmt. Die Wachstumsrate der NS hängt von der Onkogene verwendet, um Tumoren zu erzeugen.

1. Nachdem die NS-Kultur Konfluenz erreicht hat, sammeln die Kultur in einem sterilen Zentrifugenröhrchen und pellet-NS 300 X g für 5 min.
2. Den Überstand verwerfen, fügen Sie 1 mL der Lösung Zelle Ablösung und pipette um das Diabolo wieder auszusetzen.
3. Inkubation bei 37 ° C für 5 min, streichen das Rohr alle 2 min um Zelle Dissoziation zu helfen.
   Hinweis: Wenn NS Konfluenz erreicht haben, können sie in der Regel makroskopisch als kleine weiße Kugeln gesehen werden. Um die Zelle Dissoziation zu gewährleisten, müssen zumindest alle sichtbaren NS verschwunden sind.
4. Fügen Sie 5 mL HBSS 1 X und Pipette mehrmals. Pellet-Zellen bei 300 X g für 5 min. verwerfen den überstand. Wieder aussetzen Sie, das Pellet in 5 mL NSC Medien mit rekombinanten EGF und Basic-FGF ergänzt.
5. 15 mL NSC Medien und Kultur in einem T-75 Kolben bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator mit einer Atmosphäre von 95 % Luft und 5 % CO₂1 mL der Zellen hinzufügen.
6. Fügen Sie Wachstumsfaktoren (EGF und Basic-FGF) alle 3 Tage. Wenn das Medium Licht dreht sich Orange und die Zellen sind noch nicht konfluierende, wechseln Sie das Medium. Um dies zu tun, die NS 300 X g für 4 min Zentrifugieren und neu im NSC Medien ergänzt mit Wachstumsfaktoren aussetzen.
   Hinweis: Abhängig von der Größe des Pellet-gebildet, müssen Zellen mehr Flaschen aufgeteilt werden soll.

(3) Einfrieren NS für die Langzeitspeicherung

1. Wird die NS-Kultur konfluierende, distanzieren Sie sich die Zellen wie in 2.1-2.4 beschrieben. Sobald das Pellet in HBSS wieder ausgesetzt wurde, eine aliquote entfernen und die Zellen zu zählen.
2. Zentrifugieren Sie Zellen bei 300 X g für 4 min und entfernen Sie so viel wie möglich des Überstands.
3. Wieder aussetzen Sie, das Pellet in Medien (Hitze-inaktivierten FBS, 10 % DMSO) Einfrieren. Es wird empfohlen, zwischen 1 x 10⁶ und 3 x 10⁶ Zellen pro Fläschchen pro mL einfrieren.
4. Teilen Sie neu suspendierten Zellen in soviele Cryovials wie nötig und langsam abkühlen lassen die Fläschchen durch erste Übertragung zu Eis, dann bis-20 ° C, dann bis-80 ° C, und schließlich am nächsten Tag zu einem flüssigen Stickstoff-Vorratsbehälter.

4. Fixierung der Tumor NS

1. Kultur-Tumor NS in einem t-25 Kolben für 2-3 Tage, bis die Zellen konfluierende sind (~ 3 x 10⁶ Zellen). Sammeln Sie Tumor NS in einem 15 mL konische Röhrchen aus mindestens einem t-25 konfluierende Kolben. Pellet-300 X g für 5 Minuten.
2. Wieder aussetzen das Pellet in 1 mL 10 % Formalin und halten bei Raumtemperatur (RT) für 10 min. hinzufügen 5 mL 1 X HBSS und pellet-Zellen wie in Schritt 3.2 getan. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
3. Legen Sie die 15 mL konische Röhrchen mit Pellet auf Eis.

(5) Paraffin Einbetten des Tumors NS

1. Wieder aussetzen der gewaschenen NS Pellets in 500 µL 2 % warme flüssige Agarose und vorsichtig mischen durch pipettieren.
2. Legen Sie sofort Agarose eingebettet NS auf Eis, bis die Agarose polymerisiert. Entfernen Sie die Agarose Stück beherbergen die NS. Legen Sie die polymerisierten Agarose mit NS in die Kassette für Gewebe, die Verarbeitung (Abbildung 2).
3. Fahren Sie mit Gewebe Verarbeitung (mit einem automatischen Paraffin-Prozessor) und paraffin einbetten (unter Verwendung einer Einbettungs-Station).

6. Schneiden von Paraffin-eingebetteten NS

1. Im Wasserbad auf 42 ° C festgelegt, und legen Sie die Klinge am Mikrotom sorgfältig mit zwei Pinsel, um sicherzustellen, dass es dem Erdboden gleichgemacht wird. Verwenden Sie dieses Blatt nur zum Trimmen.
2. Legen Sie den Paraffinblock auf Mikrotom. Drücken Sie mit der nichtdominanten Hand den Hebel befindet sich auf der linken Seite, die die Dicke der einzelnen Abschnitte steuert. Drücken Sie an der zweiten Haltestelle, die 30 µm Dicke angibt.
3. Trimmen des Blocks beginnen (i.e., entfernen überschüssiges Paraffin) durch das grobe Handrad mit der rechten Hand drehen, bis die Oberfläche der Probe erreicht ist. An dieser Stelle lösen Sie den Hebel, der die trim Dicke 10 μm oder 5 μm steuert. Stoppen Sie trimmen, wenn die Oberfläche der Probe erreicht ist.
4. Füllen Sie eine Kühlbox mit Eis und fügen Sie gerade genug Wasser hinzu, so dass wenn der Paraffinblock auf Eis gelegt wird, das Wasser verhält sich wie ein Film um den Paraffinblock, schützt sie vor das Eis direkt berühren. Inkubieren Sie die Paraffinblock auf Eis für 20 min.
5. Entsorgen Sie die alte Klinge und legen Sie ein neues Kennwort für schneiden. Trocken-Block mit Gaze, dann legen Sie es auf dem Mikrotom.
6. Erhalten Sie mit der nichtdominanten Hand ein paar gebogene Pinzetten, die verwendet werden, um das Paraffin Band ziehen. Halten Sie einen feuchten Pinsel in der Nähe der rechten Hand, die verwendet wird, um das Paraffin-Band auf dem Wasserbad zu übertragen. Beginnen, Abschnitt durch Drehen der groben Handrad mit der rechten Hand in einem schnellen Tempo. Verwenden Sie die Zange in der linken Hand das Paraffin-Band halten.
7. Verwenden Sie den feuchten Pinsel das Paraffin-Band auf dem Wasserbad zu übertragen.
8. Verwenden Sie, die Kurve der Zange um die Abschnitte aufteilen von oberflächlich Platzierung der Zange zwischen zwei Paraffin Abschnitte, dann schieben die beiden Abschnitte entfernt sanft.
   Hinweis: Diese Bewegung sollte sich ganz auf die Oberfläche des Abschnitts Paraffin. Drücken Sie nicht auf den Abschnitt.
9. Verwenden Sie den feuchten Pinsel um die getrennten Paraffin Abschnitte auf Objektträger positiv geladenen Adhäsion drücken.
10. Lassen Sie die Folien über Nacht trocknen innerhalb einer chemischen Haube vor dem Speichern in Folie-Boxen. Die Lagerung von Folien hängt von der Art des Flecks durchgeführt.

(7) Immunhistochemie (IHC) von Paraffin-eingebetteten NS

1. Schmelzen Sie Paraffin, indem die Folien in einem Metallgestell und Bebrüten sie bei 60 ° C für 20 Minuten.
2. Die Folien durch Inkubation in einem Zug Rehydratation bei RT deparaffinize: 3 x Xylol für 5 min, 100 % 2 X Ethanol für 2 min, 95 % 2 X Ethanol für 2 min, 70 % 1 X Ethanol für 2 min und 1 x deionisiertes Wasser für 2 min. Hereon, halten die Folien im Leitungswasser bis Antigen-Retrieval , als Austrocknen verursacht unspezifische Antikörperbindung.
3. Inkubieren Sie die Folien in Citrat-Puffer (10 mM Zitronensäure, 0,05 % nicht-ionische Reinigungsmittel, pH 6) bei 125 ° C für 30 s und bei 90 ° C für 10 s. Abkühlen lassen, dann die Folien 5 Mal mit destilliertem Wasser ausspülen.
4. Inkubieren Sie Folien bei RT in 0,3 % H₂O₂ für 30 min.
5. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal in Waschpuffer (0,025 % Reinigungsmittel in TBS) für 5 min. unter Rühren sanft.
6. Inkubieren Sie die Folien bei RT mit blockiert Lösung (10 % Pferd Serum, 0,1 % BSA in TBS) für 30 min.
7. Inkubieren Sie die Folien über Nacht bei 4 ° C in eine feuchte Kammer mit Primärantikörper Verdünnung-Lösung (0,1 % BSA in TBS) vorbereitet. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal in Waschpuffer für 5 min. unter Rühren sanft.
8. Inkubieren Sie die Folien für 1 h bei RT mit biotinylierte Sekundärantikörper in Verdünnung Lösung vorbereitet. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal in Waschpuffer für 5 min. unter Rühren sanft.
9. Inkubieren Sie die Folien bei RT in der Dunkelheit für 30 min mit Avidin-biotinylierte Meerrettich-Peroxidase-Komplex. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal in Waschpuffer für 5 min. unter Rühren sanft.
10. Inkubieren Sie die Folien mit DAB-H₂O₂ Substrat Marken hier für 2-5 min bei RT
11. Spülen Sie 3 Mal mit Leitungswasser. Tauchen Sie (ca. 1-2 s) Folien in Hämatoxylin Lösung Gegenfärbung, und spülen Sie sie gründlich in Leitungswasser bis Lichtung.
12. Entwässern Sie die Folien wie folgt: in destilliertem Wasser für 2 min inkubieren, Tauchen 3 Mal in 80 % Ethanol, in 95 % igem Ethanol 2 Mal für 2 min inkubieren, in 100 % igem Ethanol 2 Mal für jeweils 2 min inkubieren und schließlich in Xylol 3 Mal für 3 Minuten.
13. Deckglas Folien mit Xylol basiert Eindeckmittel und lassen Sie sie trocknen auf eine Ebene Fläche bei RT, bis sie bereit sind für die Bildgebung.       Hinweis: Wenn 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB) Färbung, die Durchführung der Folien bei RT speicherbar Immunfluoreszenz-Färbung erfolgt, sollten Folien im Dunkeln bei-20 ° C reduzieren Foto bleichen gespeichert werden.

Ergebnisse

Um Tumorentwicklung zu überwachen und zu bewerten, wenn der Tumor die NS generieren Größe erreicht hat, analysierten wir die Lumineszenz von Tumoren mit Biolumineszenz emittiert. Dies ermöglicht die Untersuchung der Transduktion Effizienz in der Welpen und Tumorprogression durch die Lumineszenz-Signal der Luciferase (Abbildung 1A und 1 b). Wenn die Größe des Tumors ein Signal von 1 x 10⁷ Photonen/s/cm2/sr (

Diskussion

In diesem Artikel zeigen wir eine vielseitige und reproduzierbare Methode durchführen Immunohistochemistry auf Paraffin-eingebetteten Gliom NS, die die charakteristischen 3D-Struktur von Tumorzellen wachsen in das Gehirn in Situzu pflegen. Diese Technik besitzt die folgenden Vorteile gegenüber der Verwendung von Zellen auf Glas oder Kunststoff-Oberflächen verchromt: ich) Erhaltung der 3D-Struktur von NS; (II) Vermeidung von Stress der Zelle Dissoziation vor der Analyse der Proteinexpression; (III) abschrecken...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated microtome blade HP35	Thermo Scientific	3150734
Microtome RM 2135	Leica	MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-aldrich	HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated	Dako	E0432	IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT	Biocare medical	BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
N-27 Supplement	ThermoFisher	A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
AGAROSE LE	GoldBio	A-201-1000
Genesee Sc. Corporation	Olympus 15 ml	21-103
Genesee Sc. Corporation	TC-75 treated Flask	25-209
Genesee Sc. Corporation	TC-25 treated Flask	25-207
DMEM/F12	Gibco	11330-057	NS media
HBSS	GibcoTM	14175-103	balanced salt solution
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse