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この原稿の目的は、RING型E3ユビキチンリガーゼの包括的な生化学的および機能的研究の概要を提示することです。このマルチステップパイプラインは、詳細なプロトコルを用いて、試験されたタンパク質の酵素活性を検証し、活性を機能にリンクする方法を示す。
ユビキチン化は、タンパク質の翻訳後修飾として、真核細胞の恒常性において重要な調節的役割を果たす。標的タンパク質への76アミノ酸ユビキチン修飾剤の共有結合は、ポリウビキチン鎖の長さおよびトポロジーに応じて、タンパク質分解から修飾タンパク質の局在化および/または活性の変化に至るまで、異なる結果をもたらす可能性がある。3つの酵素がユビキチン化プロセスを順次触媒する:E1ユビキチン活性化酵素、E2ユビキチン共役酵素、およびE3ユビキチンリガーゼ。E3ユビキチンリガーゼは、基質特異性を決定し、したがって、非常に興味深い研究対象を表す。ここでは、RING型E3ユビキチンリガーゼの酵素活性と機能との関係を研究するための包括的なアプローチを提示する。この4段階のプロトコルは、保存されたRINGドメインを標的とした部位特異的突然変異誘発を介してE3リガーゼ欠損変異体を生成する方法を説明する。2-3)インビトロとプランタの両方のユビキチン化活性を調べる方法;4)これらの生化学的分析を試験タンパク質の生物学的意義に結びつける方法。E3リガーゼ欠損変異体の生成は、まだその基質と相互作用するが、もはや分解のためにそれをユビキチン化し、生体内での酵素基質相互作用の試験を容易にする。さらに、保存されたRINGドメインにおける突然変異は、RNA干渉アプローチの代替アプローチとして機能的ノックアウト研究で利用できる支配的な陰性表現型をしばしば付与する。我々の方法は、植物細胞内の宿主ユビキチン化システムをハイジャックして寄生を促進する植物寄生線虫エフェクターRHA1Bの生物学的役割を調べるために最適化された。in vivo発現システムのわずかな変更によって、このプロトコルは起源に関係なくあらゆるRING型E3リガーゼの分析に適用することができる。
E3ユビキチンリガーゼの大部分は、RING(Really Interesting New Gene)型タンパク質に属する。RINGフィンガードメインは、もともとフリーモントらによって識別されました.1および機能的にタンパク質間相互作用を媒介するドメインとして記載される2.正規の輪ばれる指は、他のアミノ酸残基(X)によって特異的に間隔を空けた8つの保存されたCys(C)およびHis(H)のコンセンサス配列として定義される特殊なタイプの亜鉛調整ドメインであり、C-X2-C-X1-3-H-X2-3-C/C-X 2 -C-X 4-48 -C-X-C-X 2 -C-X2-C-X4-48-C-X 2 -C-X2つのZn2+イオンは、C1/C2およびC/H5 /C6を有するユニークな「クロスブレース」トポロジーを介してコアCおよびH残基によって安定化され、C3/H4およびC7/C8は第2(図1A)3、4を結合する最初のZn 2+イオンを調整する。第5Zn2+配位部位におけるCまたはHの存在に応じて、リングフィンガータンパク質の2つの正規サブクラスが定義された:C3HC4およびC3H2C3(RING-HCおよびRING-H2、それぞれ)。E3ユビキチンリガーゼのRINGドメインはE2共役酵素と基質との相互作用を媒介するので、これらの必須CおよびH残基の突然変異はリガーゼ活性5を破壊することが示されている。RING E3 リガーゼのさらに 5 つのあまり一般的でないサブクラス (RING-v、RING-C2、RING-D、RING-S/T、および RING-G)6が説明されています。RING型E3ユビキチンリガーゼは、さらに単純で複雑なE3酵素に細分化することができる。単純な単一サブユニットRINGE3リガーゼは、基板認識部位およびE2結合リングドメインの両方を含む。対照的に、マルチサブユニットRING型E3複合体は、E2-ユビキチン中間体のE3複合体へのリクルート基板または媒仲介する。自己ユビキチン化のための一次ユビキチン結合部位として機能するRINGドメインLys残基は、E3リガーゼ活性にとっても重要である可能性がある。
すべてのRING含有タンパク質がE3リガーゼとして機能するわけではありません。したがって、RING-fingerドメインのバイオインフォマティクス予測とE2依存性タンパク質ユビキチン化の能力は、生化学的に検証され、試験されたタンパク質の生物学的役割にリンクする必要があります。ここでは、サイト指向の突然変異誘発アプローチを通じて、in vitroとプランタの両方でRING型E3ユビキチンリガーゼの酵素活性を検出し、機能的に特徴付ける方法を概説するステップバイステッププロトコルについて説明する。このパイプラインからの代表的な結果は、RING型E3リガーゼRHA1Bについて示されています。RHA1Bは、植物の免疫を抑制し、植物根細胞の形態を操作するために植物寄生性嚢胞線腫性グロボデラ・パリダによって産生されるエフェクタータンパク質である。病原体/寄生虫の侵入から身を守るために、植物は病原体または寄生虫の存在を検出するヌクレオチド結合ドメインおよびロイシンリッチ反復(NB-LRR)型免疫受容体を進化させ、その結果、感染部位で起こる急速で局所的な細胞死の一形態である過敏性応答(HR)を発症し、病原体のコロニー形成を阻止する。そのような免疫受容体の1つは、G.パリダのいくつかの単離物(フィールド集団D383およびD372)7に対する耐性を付与するジャガイモGpa2タンパク質である。
提示されたプロトコルを用いて、RHA1Bが植物Gpa2免疫受容体をユビキチン化および分解8に標的化することによりE3依存的に植物免疫シグナル伝達を妨害することが最近判明した。
1. 部位特異的突然変異誘発 (図 1)
2. 組換えタンパク質精製とインビトロユビキチン化アッセイ
3.アグロバクテリウム-ニコチアナ・ベンタミアナ葉およびプランタユビキチン化アッセイにおける媒介性一過性タンパク質発現
4. 植物の酵素活性と機能との関連の確立
注:例えば、RHA1Bは、HR細胞死を抑制するために耐性タンパク質Gpa2の分解を促進する。このステップでは、RHA1B のこれらの悪質なアクティビティが E3 に依存していることを確認する方法を示します。
このセクションでは、PROSITE予測RING-H2型ドメイン(132〜176アミノ酸)10を有する単一サブユニットE3ユビキチンリガーゼRHA1Bの検査に使用されるプロトコルに代表する結果が提供される。図1に示すように、E3欠損変異タンパク質を得るためには、RINGドメイン内の保存された8つのCsまたはHsのうちの少なくとも1つ(図1A)を変異化する必要がある(図1B)。したがって、第1段階として、RHA1Bの2つの変異型バージョン、RHA1BC135S(RINGドメインの保存されたC3におけるSerによるサイの置換)およびRHA1BK146R(RHA1Bに存在する唯一のLysにおけるArgによるリスの置換)が生成された。単一サブユニットE3リガセは、ユビキチンを収容するE2から基板へのユビキチン移動を仲介するが、LysにおけるE3の自己ユビキチン化は、その最大の酵素活性のために必要とされるかもしれない。
図2Aにおけるウェスタンブロッティング結果は、試験されたタンパク質の分子量(例えば、MPB融合RHA1B〜100kDa)から始まり、上方に進行するマルチバンドスミアを有する典型的なインビトロユビキチン化アッセイ結果を示す。抗HA抗体は、異なる長さのポリユビキチン化鎖に組み込まれたHAタグ付きUbを認識し、この典型的なユビキチン関連ラダー様スミアを作成した。正の結果を検証するために、図 2Aは、個々のコンポーネント (E1、E2、Ub、または MBP-RHA1B) を欠いているか、MBP を制御として使用し、塗りつぶされたユビキチン化信号を欠いているすべての重要な負のコントロールも示しています。さらに、PVDF膜のクマシーブルー染色は、すべてのコントロールにおいてMBP-RHA1BまたはMBPの等しい負荷を示した。
図2Bは、特定のE2/E3の組み合わせに応じてインビトロユビキチン化結果がどのように変化するかを示す。この例では、10個の異なるE2ファミリーを表す11の異なるE2がテストされました。検出されたユビキチン化活性は、シグナルなし(スミアなし)から異なる分子量から始まるマルチバンドスミアまで、異なるユビキチン化パターンを示す範囲を示した。
図3は、試験されたタンパク質のRING-およびK変異型バージョンのユビキチンアッセイ結果を示す。RHA1BC135Sの酵素活性の欠如は、インビトロ(図3A)でマルチバンドスミアを生成したり、プランタで多ユビキチン化シグナルを促進したりすることができないことで支持されている(図3B)。それ自体でプランタのHAタグ付きUbの過剰発現は、野生型RHA1Bの酵素活性によって与えられる強いユビキチン化シグナルとは対照的に、ベクター制御を含むすべての試験されたサンプルにおいて基礎レベルのユビキチン化を与えたことは注目に値する。さらに、RHA1BK146R変異体に関する分析は、K146残基がRHA1BのE3活性にも不可欠であることを示唆している。限界自己ユビキチン化シグナルはインビトロ(図3A)で検出されたが、プランタアッセイでは変異体がE3欠損であると判定した(図3B、バックグラウンドユビキチン化シグナルのみが検出された)。
E3欠損変異体を生成および生化学的に検証した後、機能的研究は、試験されたRING E3ユビキチンリガーゼのE3関連生物学的役割を決定するように設計することができる。RHA1Bの場合、この線虫エフェクターは、Gpa2トリガHR細胞死の抑制によって現れるように、植物の免疫シグナル伝達を抑制する。図4Aに示すように、野生型RHA1Bとは異なり、E3リガーゼ活性を欠くRHA1BC135S変異体はHR細胞死を妨げなかった。タンパク質ユビキチン化の最も一般的な結果は、そのプロテアソーム媒介性分解であることを考えると、RINGドメインに存在する突然変異は、直接的および/または間接的な基質の分解をトリガするE3依存性の能力を検証するためにも使用することができる。したがって、有意に、図4Bにおけるウェスタンブロッティング結果は、Gpa2が野生型RHA1Bの存在下で蓄積しなかったことを確認したが、RHA1BC135SはGpa2タンパク質安定性に影響を及ぼさなかった。
図1:部位特異的突然変異誘発に関与する原理とステップの概略表現(A)保存されたCysとHisアミノ酸が強調されたRING-CH/H2ドメイン。(B) 変異原性プライマー設計の一例。(C)部位特異的突然変異誘発のステップこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:インビトロユビキチンアッセイの代表者。(A)トップゲルは、すべての負のコントロールを含むユビキチンアッセイを示し、底ゲルは等しい負荷を示す。(B) E2酵素に応じた期待される結果の範囲。この図は Kud ら8から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:RING-およびK-変異体(RHA1BC135SおよびRHA1BK146R)に対するユビキチン化アッセイ結果。(A) RHA1BC135SおよびRHA1BK146Rのインビトロユビキチン化結果(B)RHA1BC135SおよびRHA1BK146Rに対するプランタユビキチン化アッセイ結果この図は Kud ら8から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:E3依存性生物学的機能に関する代表的な機能的研究E3依存性生物学的機能を示す機能的研究の一例。(A)E3依存性HR細胞死抑制および(B)植物免疫受容体Gpa2の分解。この図は Kud ら8から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
PCR セットアップ | |
1°L | プラスミド(〜100ng) |
1.5°L | F変異原プライマー(10μM) |
1.5°L | R変異原プライマー(10μM) |
1°L | dNTP (10 mM) |
5°L | バッファ (10x) |
1°L | ウルトラPfuポリメラーゼ (2.5 U/μl) |
39°L | ddH2O |
50°L | 総容積 |
表1:PCR反応の設定
サーモサイカープログラム | |||
1 | 95 °C | 30 s | |
2 | 95 °C | 30 s | |
3 | 60 °C | 30 s | |
4 | 72 °C | 5 分 | 2-4 30回繰り返す |
5 | 72 °C | 5 分 |
表 2: PCR サーモサイカー プログラム
RHA1Bの例に対して設定されたライゲーション反応 | ||
1.5°L | pMAL-c2::バンヒとSalIによる消化によるMBP線形化ベクトル(60ng) | |
7°L | RHA1B/RHA1BC135S または RHA1BK146R 挿入物は、BamHI および SalI (25 ng) で消化されます。 | |
1°L | T4リガーゼバッファー(10倍) | |
0.5°L | T4リガーゼ(400 U/μL) | |
10°L | 総容積 |
表3:RHA1B例に対してライゲーション反応を設定した。
RING型E3ユビキチンリガーゼの生化学的・機械的基礎を解明することは、ホメオスタシスの発達、ストレスシグナル伝達、維持における生物学的意義の理解に大きく貢献することができます。ここで説明するプロトコルは、インビトロおよびプランタ機能研究と突然変異誘発アプローチを組み合わします。サイト直接突然変異誘発を介してRINGドメインの保存された残基に単一のアミノ酸置換を導入することにより、得られたE3欠損変異体を野生型タンパク質と並行して試験し、酵素活性を機能性と結び付けることができる。
RINGドメイン、特に保存されたCysとHis残基を適切に識別することが重要です。PROSITEなどのオンラインツールを使用すると、10を行うことができます。E2酵素の採用を担うRINGドメインを不安定化させるために、Cysは通常、亜鉛配位に使用されるジスルフィド結合を作成する能力を欠く最も近い構造置換であるSerで置換される。Lorick et al. は、これらの重要な Cys 残基のいずれかに対する突然変異が、単一サブユニット RING 型 E3 リガセス5のユビキチン活性を廃止することを示した。一部のCys残基は、RING型タンパク質を含むマルチユニットE3リガーゼ複合体においても重要であるが、それらのユビキチン化複合体の多面的かつ動的な三次元構造とRING型タンパク質の異なる役割のために、多単位E3リガーゼにおけるRINGドメインにおける保存残基の単一置換は、リガーゼ欠乏表現型11の生成に成功していない。
部位特異的突然変異誘発では、小さいプラスミドベクターと低い増幅サイクルを用いることは、通常、突然変異誘発に対してより高い効率をもたらすことを発見した。Pfu酵素は、他の高忠実度および高いプロセス性DNAポリメラーゼで置換することができる。さらに、目的の遺伝子が希少なコドンを含む場合、別の大腸菌染色、ロゼッタ、組換えタンパク質のより高い収率を達成するために使用することができる。さらに、IPTG誘導のためのインキュベーション時間および温度の両方をさらに最大限に活用することができる。温度が低いと大腸菌分裂率が低下し、特定のタンパク質の発現に有利になる可能性があります。IPTGの濃度が高いほどタンパク質発現が改善される可能性がありますが、大腸菌分裂プロセスも阻害し、お勧めできません。
単一サブユニットRING型E3リガーゼは、E2-Ub中間体を基質に近接して位置づける分子足場として機能するだけでなく、そのコグネイトE2sのユビキチン移動活性を刺激する。さらに、E2/E3の組み合わせが、改変基板の運命を決定するポリウビキチン鎖の長さと結合にとって重要であることを考えると、RING型E3sの考慮には、その酵素パートナーE2s12を含める必要がある。図3Bに示すように、テスト済みのE2はすべてRHA1Bリガーゼと互換性があるわけではありません。したがって、インビトロユビキチン化アッセイは、誤った陰性の結果を避けるために、異なるE2クラスを表す複数のE2酵素と並行して行われるべきである。
ここで提示するin vitro酵素アッセイは、試験されたRING型タンパク質の自己ユビキチン化能力を検出する。しかし、小さな改変により、このプロトコルは、基板のインビトロユビキチン化を検出するために容易に適応することができる。このことから、ステップ2.15からのインビトロユビキチン化混合物は、潜在的なE3リガーゼ基質(500ng)の組換えタンパク質を添加する必要があります。30°Cで2時間のインキュベーションの後、ユビキチン化タンパク質は、抗HA親和性マトリックスの15μL(HA-Ubを使用する場合、またはFLAG-Ubを使用する場合は抗FLAG親和性マトリックス)を使用して、4°Cで2時間攪拌することにより捕捉する必要があります。冷たいUb洗浄バッファー(20 mM Tris pH 7.5、100 mM NaCl、0.1 mM EDTA、0.05%Tween 20、1x PMSF)でビーズを4倍洗浄した後、バッファの40μLを除くすべてを破棄し、ステップ2.16に移動します。ユビキチン化シグナルは、エピトープタグ付きUbおよび基質に特異的な抗体によって検出され、それぞれ、基質タンパク質の分子量から出現し、基質/酵素特異性を確認する。
さらに、生体内のE3リガーゼ基質の同定は、通常、一過性酵素基質相互作用およびユビキチン化標的タンパク質の急速な分解に起因する複数の課題に関連している。E3リガーゼ欠損変異体を使用すると、まだ標的と相互作用するが、13をユビキチン化しなくなったが、プロテアソーム阻害剤MG132を添加する非常に有用な代替手段であり、26Sプロテアソーム機能を常に十分に妨害するとは限らない。
RING型E3リガーゼの共通の特徴は、ホモおよび/またはヘテロダイマーとして形成および機能する傾向がある。興味深いことに、RINGドメインの保存残基における置換は、通常、変異したRING型E3リガーゼが天然の野生型タンパク質13の酵素活性を遮断する優性陰性表現型と関連している。したがって、プランタにおけるRING変異体の過剰発現は、E3リガーゼ遺伝子をノックアウトするための代替アプローチであり得る。
著者たちは何も開示する必要はない。
私たちの仕事は、USDA国立食品農業研究所、USDA-NIFAファームビル、ノースウエストポテトビルの農業・食品研究イニシアチブ競争助成金(2017-67014-26197;2017-67014-26591)からの資金援助によって可能になりました。コンソーシアム、ISDAスペシャルティクロップ
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Amylose resin | NEB | E8021S | |
ATP | Sigma-Aldrich | A1852 | |
Bacterial protease inhibitor | Sigma-Aldrich | P8465 | |
Bromphenol Blue | VWR | 97061-690 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Centrifuge | Beckman Coulter | model: Avanti J-25 | |
Commassie Blue | VWR | 97061-738 | |
Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DNA clean & concentrator Kit | ZYMO RESEARCH | D4029 | |
DpnI | NEB | R0176S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
E. coli BL21 | Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
E. coli DH5α competent cells | Thermo Fisher Scientific | 18265017 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 324504 | |
FeSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | |
FLAG-Ub | BostonBiochem | U-120 | |
Glucose | VWR | 188 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HA-Ub | BostonBiochem | U-110 | |
Heat block | VWR | model: 10153-318 | |
Incubator | VWR | model: 1525 Digital Incubator | |
Incubator shaker | Thermo Fisher Scientific | model: MaxQ 4000 | |
IPTG | Roche | 10724815001 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Liquide nitrogen | university chemistore | ||
Maltose | Sigma-Aldrich | 63418 | |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63138 | |
MgSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | model: 5424 | |
Miniprep plasmid purification kit | ZYMO RESEARCH | D4015 | |
monoclonal anti-FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | |
monoclonal anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H9658 | |
monoclonal anti-MYC antibody | Sigma-Aldrich | WH0004609M2 | |
Mortar | VWR | 89038-144 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | model: 2000 Spectrophotometer | |
Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-5C | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
PCR machine | Bio-Rad | model: C1000 | |
Pestle | VWR | 89038-160 | |
Pfu Ultra | Agilent Technologies | 600380 | |
Plant protease inhibitor coctail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
pMAL-c2 | NEB | N8076S | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Polyvinylpolypyrrolidone | Sigma-Aldrich | P6755 | |
SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
Sonicator | Qsonica Sonicators | model: Q125 | |
Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-253-260 | |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
T4 ligase | NEB | M0202S |
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