光コヒーレンストモグラフィーを用いたげっ歯類モデルにおける眼疾患のin vivo構造評価

要約

ここでは、スペクトル領域光干渉断層撮影(SD-OCT)を用いて、網膜変性、緑内障、糖尿病性網膜症、近視のモデルにおいて、in vivoで網膜および眼の構造を可視化する方法について説明します。

要約

スペクトル領域光干渉断層撮影法(SD-OCT)は、生体内の網膜および眼の構造を視覚化するのに有用である。 研究において、SD-OCTは、さまざまな網膜および眼の疾患および損傷モデルの変化を評価および特徴付けるための貴重なツールです。光誘発網膜変性モデルでは、SD-OCTを使用して、感光体層の経時的な薄層化を追跡できます。緑内障モデルでは、SD-OCTを使用して、網膜神経線維層の減少と網膜総厚さを監視し、高眼圧症を誘発した後の視神経カッピングを観察することができます。糖尿病性げっ歯類において、SD-OCTは、研究者が網膜の総厚さの減少と、特定の網膜層、特に疾患の進行に伴う網膜神経線維層の厚さの減少を観察するのに役立ちました。近視のマウスモデルでは、SD-OCTを使用して、軸方向の長さの変化などの軸方向パラメータを評価できます。SD-OCTの利点には、眼の構造のin vivoイメージング、経時的な眼の寸法の変化を定量的に追跡する能力、およびその高速スキャン速度と高解像度が含まれます。本稿では、SD-OCTの手法を詳述し、網膜変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、近視のモデルにおけるSD-OCTの使用例を示す。方法には、麻酔、SD-OCTイメージング、および厚さ測定のための画像の処理が含まれます。

概要

スペクトル領域光干渉断層撮影(SD-OCT)は、臨床医や研究者が眼の構造を非侵襲的に検査できるようにする、正確で高解像度のイメージングモダリティです。このイメージング技術は、マイクロメートルスケールでin vivoで3次元網膜画像をキャプチャする干渉法に基づいています^1,2。これは、網膜層や網膜下液の構造的欠陥や菲薄化などの病理学的特徴を簡単に検出して精度が高いため、視力研究や診療所で最も頻繁に使用されるイメージングモダリティの1つになっています³。SD-OCTは、視覚関連疾患の動物モデルを用いた研究において、構造と機能の関係とその病理組織学的起源に関する重要な非侵襲的解析を提供してきました⁴。SD-OCTは、その解像度(眼の深さに応じて最大2〜3ミクロン⁾により5、網膜層の厚さのわずかな変化も検出できます。このタイプの分析は、疾患の進行に不可欠な情報を提供し、視覚関連障害に対する神経保護法と治療の有効性を評価することができます。

SD-OCTは、組織学的に構造を調べるための非侵襲的な代替手段であり、2つは相関していることが示されています⁶。SD-OCTは細胞分解能に達しませんが、動物での縦断的研究を可能にします。これは、特定の時点で動物を安楽死させる必要とは対照的に、個々の動物で時間の経過とともに病気の進行を追跡できるため、有利です。イメージング技術が進歩し続けるにつれて、SD-OCT技術も進歩し、画質が向上し、網膜血管機能などの生物学的プロセスを詳細に評価できるようになります。1991年の登場以来、SD-OCTテクノロジーは解像度、速度、感度が大幅に向上しています⁷。

本研究では、SD-OCTシステムを利用して、網膜変性、緑内障、糖尿病性網膜症のげっ歯類モデルにおける網膜層の変化を定量化します。ここで使用するSD-OCTシステムは、低電力の近赤外光を利用して深度分解画像をリアルタイムで取得、処理、保存するフーリエ領域OCTシステムです。SD-OCTシステムは、800nmの波長帯域で拡張された深度イメージング機能を備えており、8mmの深さと4μmの解像度を提供します。フーリエ領域検出では、組織からの散乱光と基準経路との間の干渉信号がフーリエ変換され、散乱強度⁸の軸方向スキャンおよび/または軸方向深さプロファイルが構築されます。ここでの研究では、OCTビームを目的の網膜構造上でスキャンし、軸方向スキャンを連続的に取得します。通常、スキャンパターンは、ラスタースキャンパターンを使用して2D断面画像に対応する線形1次元スキャンライン(A-スキャン)の集合として2次元グリッド(B-スキャン)を取得します。マウスの近視に焦点を当てた研究では、このシステムは眼の構造の寸法(角膜の厚さ、レンズの厚さ、硝子体の深さ、軸方向の長さなど)の測定にも使用されます。

現在のシステムでは、ユーザーは独自のプロトコルを設計し、関心のある眼の構造に基づいて調整および選択できるスキャンを作成できます。これらのユーザー定義プロトコルに搭載されている主要なスキャンにより、このイメージング技術はユーザーフレンドリーになります。画像解析のために、我々は数学モデリングプログラムでカスタマイズされたプログラミングを開発しました。SD-OCTは、眼の構造における病理学的形態学的変化を非侵襲的に特定および定量化し、視覚関連疾患の進行を監視するための強力なツールです。

プロトコル

記載されているすべての手順は、アトランタ退役軍人省の施設動物管理および使用委員会によって承認され、実験動物の世話と使用に関する国立衛生研究所のガイドに準拠しています(NIH出版物、^第 8版、2011年更新)。

注:以下のプロトコルの開発に使用されるSD-OCTシステムは、 材料の表に記載されています。一部の手順はこの特定のシステムに固有ですが、全体的なアプローチは他のOCTデバイスや動物モデルにも適用できます。さらに、私たちの研究室では、これらのプロトコルはマウスとラットで一般的に使用されています。ただし、全体的なアプローチは、個人がデバイスに適切なレンズと機能を持っていれば、さまざまな動物モデルとSD-OCTデバイスに採用できます。

1.光干渉断層撮影装置のセットアップ

1. SD-OCT ソフトウェア(材料表)を開きます。
2. OCT、研究、および治療群を服用している人を定義します(該当する場合)。研究者が後でデータ分析中に目的のスキャンを検索するのに役立つ方法で、これらのカテゴリに名前を付けます。
   1. 「患者/検査」タブで、「検査官」をクリックします。試験官の名前を選択します。[検査官と医師の設定] ボタンを使用して、新しい審査官を追加します。
   2. スタディ名をクリックして、スタディを定義します。[試験]タブをクリックして、新しい試験を追加するか、既存の試験の処理を変更します。[治療群の選択]の右側をクリックして、治療群を選択します。
3. [ 患者の追加 ] ボタンをクリックして、グループ全体の新しい時点を追加します。ウィンドウが表示されたら、ID番号、名、姓を入力します。[男性] または [女性] を選択します。生年月日を入力します。
4. [ 試験の追加 ] ボタンをクリックして、個々のラットを追加します。ラットを特定するには、試験をクリックしてください。[ 試験の編集] をクリックします。[ メモの入力 ] ボックスに ID 番号を入力します。[ 変更を保存 ]ボタンをクリックします。
5. 適切なレンズをデバイスに取り付け(図1B)、ソフトウェアで対応する構成を選択し、関連する基準アームの位置をダイヤルします。
   注意: 説明されているSD-OCTシステムには、画像化する動物種と目の領域(網膜または角膜、マウスまたはラット)に固有のカスタマイズされたレンズ、プリセットスキャンパターン、および 基準アーム 設定があります。これらの詳細の一部は、説明されているSD-OCTシステムに固有です(資料の表を参照)。たとえば、すべてのデバイスが 基準アーム の経路長を手動で調整できるわけではありません。
6. [患者/検査]タブで、強調表示された検査をダブルクリックして[イメージング]タブに進み、イメージングを開始するか、[イメージング]タブをクリックします。デフォルトのスキャンがある場合は、右クリックして削除します。
7. 事前設定されたスキャンプロトコルをロードするには、[ リストからプロトコルを選択] ボタンをクリックします。または、個々のスキャンを追加します。
8. 緑内障と糖尿病性網膜症のラットモデルと網膜変性症のマウスモデルの場合、2つのODスキャンと2つのOSスキャンの4つの画像で構成されるプリセットを選択します。マウス近視の場合は、OD4スキャンとOSスキャン4スキャンの8つの画像で構成されるプリセットを選択します。
   注意: プリセットイメージングについては、セクション3で詳しく説明します。これは、各ラボがオンサイトインストール中に自分で、またはメーカーと一緒に作成するものです。

2.動物を麻酔する

1. 麻酔薬を投与します。
   1. ラットにケタミン(60 mg / kg)とキシラジン(7.5 mg / kg)を腹腔内注射で麻酔します。.
   2. 腹腔内注射により、ケタミン(80 mg / kg)とキシラジン(16 mg / kg)でマウスを麻酔します。.
   3. 動物が完全に麻酔され、つま先のつまみに反応しなくなるまで待ちます。
2. 瞳孔拡張滴(1%トロピカミド)を投与する。画像を作成する前に、瞳孔が拡張するのを待ちます。
   注:瞳孔の拡張は視野を広げますが、必須ではありません。何かが目に触れる場合(例えば、コンタクトレンズを適用する場合、またはガイドを使用する場合)、目を麻痺させるための局所(角膜)麻酔薬(0.5%テトラカイン)も使用する必要があります。ガイドは、スキャンヘッドの上に配置され、初心者が目とスキャンヘッドを並べるのに役立つデバイスです。
3. げっ歯類に麻酔をかけた後、動物を3次元空間で回転させることができるげっ歯類の位置合わせシステムに配置します(図1A、1C、および1D)。熱サポートを提供します。
   注:現在、SD-OCTデバイスで設計および販売されているマウスとラット用のげっ歯類アライメントシステムを使用しています。
4. 液体(生理食塩水や人工涙液など)を塗布して、目を滑らかに保ちます。スキャン間で目の光学特性が維持されるように、イメージング中に目が乾かないようにしてください(角膜が濡れている場合、網膜がはっきりと見えます)。
   1. 最初の目をスキャンするときは、乾かないように反対側の目の湿気を維持してください。
5. 目の潤滑剤が多すぎたり少なすぎたりすると画質に影響するため、繊細なタスクワイプを使用して、イメージングの直前に余分な生理食塩水を吸い取ります。
   注: 滅菌潤滑剤ゲルの使用は、イメージングを妨げる可能性があるため、OCT中はお勧めしません。必要に応じて、手順の後に滅菌潤滑剤ゲルを使用することができます。コンタクトレンズを適用して、テスト全体を通して目に十分な水分を確保することもできます。私たちの経験では、コンタクトレンズは画質に顕著な改善をもたらしませんでしたが、コンタクトレンズはイメージングセッション中の角膜乾燥のリスクを減らすのに役立ちます。

3.げっ歯類OCTイメージング

1. 片方の目(OSまたはOD)から始めて、反対側の目を後に画像化します。
   1. げっ歯類アライメントシステムの2つの回転運動を使用して、視線が水平になり、OCTレンズの軸を見下ろすように動物を配置します(図1D)。
   2. OCT をフリー ラン モードで使用して、データ収集のために網膜の向きを設定します。最初に照 準 モード( 照準 ボタンをクリックして)を使用すると、水平方向と垂直方向の両方のB-スキャンをリアルタイムで連続的に表示できます。
   3. 網膜が見えるまでスキャンヘッドを目に近づけます(マウスとラットの網膜レンズは固定焦点であるため、レンズを目の焦点に向かって動かすと、網膜の奥深くに焦点が合います)。次に、げっ歯類の位置合わせシステムを使用して、動物の位置を上下に調整し、回転/ねじって視神経頭を中央に配置し、水平スキャンを水平にし、垂直スキャンを垂直にします(図1A)。
   4. 網膜像が平らで湾曲しないように作動距離を調整します。
   5. 基準アームの位置を調整して、画像を表示ウィンドウの上部近くに保ちます。押し込みすぎると、目の画像が反転しないように注意してください。
2. 網膜イメージング
   1. 緑内障、網膜変性症、および糖尿病性網膜症モデルの場合: 平均化のために、1000 x 100 x 1 (A スキャン x B スキャン x 繰り返し B スキャン) で構成されるボリューム スキャンを定義します。ラットでは、3 x 3 mmのボリュームスキャンを行います。マウスでは、1.5 x 1.5 mmのボリュームスキャンを行います。
   2. ボリュームスキャンが中央になるように、視神経を水平方向と垂直方向のアクセスの中央に配置します。視神経乳頭がスキャンの中心にあり、鼻側頭軸と上軸と下軸に沿ってまっすぐになっていることを確認します(図2)。必要に応じて、スキャンして再センタリングし、正確に中央にあることを確認します。視神経乳頭が中央に配置され、両方の軸に沿って整列するまで、必要に応じてこのスキャンを繰り返します。[ スナップショット ]ボタンをクリックして写真を撮ります。
      注意: 一部のSD-OCTデバイスには、 基準アームで光源から目の距離を調整することにより、目の湾曲を光学的に操作するオプションがあります(たとえば、画像は平らになります)。網膜層を直接厚さ測定する場合は、前後方向に沿った精度を向上させるために、画像を平坦化して中央に配置することをお勧めします。
   3. [ 保存 ]ボタンをクリックして画像を保存します。
   4. 視神経乳頭を中心とした1000 x 4 x 20の放射状スキャンを行います(A-スキャン x B-スキャン x 繰り返しB-スキャン)。繰り返しBスキャンを使用して、目または網膜の画像の鮮明さを高め、データ分析中に目の領域または網膜の層を解釈するのに役立ちます。
      注:繰り返しになりますが、ラットではこの放射状スキャンは3 mmですが、マウスでは放射状スキャンは1.5 mmです。
   5. 画像を保存します。
   6. 反対側の目で手順3.1から3.2.5を繰り返します。
3. 軸方向の長さ測定
   1. マウス近視など、目全体を画像化するプロジェクトでは、目全体を 3 回スキャンし、各目に対して 1 回の網膜スキャンを行います。500 x 20 x 1で、目の直径全体を網羅する放射状スキャンで構成されるプリセットを選択します。
      注意: この設定は、角膜から脈絡膜までのマウスの目の全長の画像を提供します。
   2. 目の中央と網膜を視野の中央に配置します。3つの放射状スキャン(全眼スキャン)を行います:1000 x 5 x 2のリニアBスキャンと、同じ場所で1000 x 5 x 2の2つの追加のリニアBスキャン。画像を保存します。
   3. その後、必要に応じてズームインし、1000 x 20 Aスキャンx Bスキャンで構成される3.2の説明と同様のボリュームまたは長方形のスキャン(網膜スキャン)を実行します。ボリュームスキャンを保存します。
   4. 反対側の目で手順3.3から3.3.3を繰り返します。
      注:現在のシステムのイメージングウィンドウは大きな目をキャプチャするのに十分な大きさではないため、軸方向の長さの測定は小さな目(マウスまたはそれより小さい)でのみ可能です。

4.イメージング後のステップ

1. 保存したデータをクラウドに保存することは、データ管理の優れたプラクティスであり、後で分析するために簡単にアクセスできます。数学的モデリングプログラム(材料表)で開発されたカスタムソフトウェアを使用してデータ分析を実行します。
2. げっ歯類の位置合わせシステムからげっ歯類を取り除き、アチパメゾール(ラットとマウスの場合は1 mg / kg)を腹腔内注射してキシラジンの効果を逆転させ、げっ歯類がより早く目覚めるようにします。.
3. げっ歯類が弱火で加熱パッドで回復するのを待ちます。必要に応じて追加の生理食塩水滴を与えます。げっ歯類が完全に歩行を取り戻したら、家のケージに戻します。
4. プログラムを終了し、OCT をオフにします。

5. OCT画像の後処理

1. 特定のOCTニーズに合わせて数学的モデリングプログラムで開発されたカスタムソフトウェアを使用して画像を処理します(たとえば、画像を手動でマークして関心領域の厚さを測定します)。
2. 画像の目的(マウス網膜、ラット網膜、または近視/軸長)に応じて、次の3つの異なるプログラムのいずれかを使用します。
   1. 網膜を処理するには、ロードするOCTスキャンを選択します。まず、簡単なクリックで視神経乳頭の中心を定義します。
   2. プログラムが視神経乳頭の両側の距離を定義する垂直線を生成するのを見てください。ラット網膜では、これらの線は視神経乳頭の中心から0.5 mmと1.2 mm離れており、現在分析されている橈骨Bスキャンに応じて、眼の鼻側頭軸と下上軸を表す合計4本の垂直線があります。
      注意: マウスの網膜では、これらの垂直線は視神経乳頭の中心から0.25mmと0.5mmにあります。
   3. 各線に沿って次のレイヤーを描画します。
      網膜神経線維層(RNFL)、内網状層(IPL)、内顆粒層(INL)、外網状層(OPL)、外顆粒層(ONL)、外限界膜(ELM)、内部/外部(IS/OS)、網膜色素上皮(RPE)、および総網膜厚さ。
      注意: 放射状スキャンには、通常、開いたときに鼻/側頭および上/下ラベルがありません。スキャンは、n/tおよびs/Iの向きになるように作成でき、特にこれらのスキャンは後で分析されます。
   4. 画像が描かれ、プログラムが終了したら、これらの測定値をデータ分析用のスプレッドシートソフトウェアにエクスポートします。
3. 手順 5 のこれらの長さと厚さの値を使用して、地域差 (n/t/s/i) や縦方向の変化があるかどうかなど、グループ間の比較を行います。
4. 網膜測定の場合、まず、0.5 mmと1.2 mmの距離で鼻側頭軸と下上軸に違いがあるかどうかを判断します。
   注意: 象限に違いが見られない場合は、0.5mmと1.2mmの測定値を一緒に平均することができます。これは、0.25 mmと0.5 mmでのみマウスの網膜スキャンを行う場合と同様のアプローチです。
5. 近視の研究では、このプログラムを使用して、目の光軸に沿った眼のパラメータを評価します。数理モデリングプログラムを開きます。まず、読み込む画像を選択します。
   1. 画像を読み込んだ後、各スキャン(放射状およびBスキャン)を手動でマークします。角膜、水晶体、硝子体房、網膜の前縁と後端をマークして、プログラムが角膜の厚さ、レンズの厚さ、前房と硝子体の深さ、網膜の厚さ、総軸長を計算するようにします。
   2. マーキング後、保存メニューを表示するプログラムを終了します。描写された値をスプレッドシートソフトウェアに保存し、3つの別々のスキャンを一緒に平均します。

結果

SD-OCTは、眼の寸法を確実に測定できるように高品質の画像が得られれば成功と見なされます。ここでは、網膜変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、近視のモデルを使用して、SD-OCTのさまざまな使用法を示しています。

光誘発網膜変性(LIRD)モデルでは、明るい光(10,000ルクス)への曝露は^、網膜9の視細胞変性を誘導する。代表的なSD-OCT画像は、損傷を受けて?...

ディスカッション

in vivoでの眼構造の高解像度イメージングにより、経時的な網膜および眼の変化の評価が可能になります。このプロトコルでは、SD-OCTは、網膜変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、および近視のモデルでin vivoで眼構造の違いを捉えることが実証されました。

SD-OCTを実行する際の最も重要な側面は、網膜または他の関心のある眼構造の鮮明な画像を取得することです。網膜が...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% tropicamide	Sandoz	Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59
0.5% tetracaine	Alcon	NDC 0065-0741-12
AIM-RAS G3 120 V	Leica Bioptigen	90-AIMRAS-G3-120	Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice
Celluvisc gel	REFRESH CELLUVISC	#4554; NDC-0023-4554-30
G3 18 mm Telecentric Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-18
G3 Mouse Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-M
G3 Rat Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-R
heating pad	Fabrication	11-1130
InVivoVue software	Leica Bioptigen		Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system
MATLAB	Mathworks		mathematical modeling program
Mouse/Rat Kit	Leica Bioptigen	90-KIT-M/R	Mouse/rat rodent alignment system
saline	ADDIPAK	200-39
System Envisu R4300 VHR 120 V	Leica Bioptigen	90-R4300-V1-120	SD-OCT system