使用光学相干断层扫描对啮齿动物模型中眼部疾病的体内结构评估

摘要

在这里，我们描述了使用光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）在视网膜变性，青光眼，糖尿病视网膜病变和近视模型中可视化体内视网膜和眼部结构。

摘要

光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）可用于可视化体内视网膜和眼部结构。 在研究中，SD-OCT是评估和表征各种视网膜和眼部疾病和损伤模型变化的宝贵工具。在光诱导的视网膜变性模型中，SD-OCT可用于跟踪感光层随时间推移的变薄。在青光眼模型中，SD-OCT可用于监测视网膜神经纤维层减少和视网膜总厚度，并观察诱发眼高压后的视神经拔罐情况。在糖尿病啮齿动物中，SD-OCT帮助研究人员观察到总视网膜厚度减少以及特定视网膜层厚度减少，特别是视网膜神经纤维层随着疾病进展而减少。在近视小鼠模型中，SD-OCT可用于评估轴向参数，例如轴向长度变化。SD-OCT的优势包括眼部结构的活体成像，定量跟踪眼部尺寸随时间变化的能力，以及快速的扫描速度和高分辨率。在这里，我们详细介绍了SD-OCT的方法，并展示了其在我们的实验室中用于视网膜变性，青光眼，糖尿病视网膜病变和近视模型的示例。方法包括麻醉，SD-OCT成像和处理用于厚度测量的图像。

引言

光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）是一种精确的高分辨率成像方式，允许临床医生和研究人员无创地检查眼部结构。这种成像技术基于干涉测量法，以微米尺度^1，2捕获体内三维视网膜图像。它已成为视觉研究和临床中最常用的成像方式之一，因为它易于检测和准确检测病理特征，例如结构缺陷和/或视网膜层和视网膜^下液变薄3。在使用视觉相关疾病的动物模型的研究中，SD-OCT提供了关于结构和功能与其组织病理学起源之间关系的基本无创分析⁴。由于其分辨率（高达2-3微米，取决于眼睛的深度⁵），SD-OCT能够检测到视网膜层厚度的微小变化。这种类型的分析可以为疾病进展提供基本信息，并评估神经保护方法和治疗视力相关疾病的疗效。

SD-OCT是组织学检查结构的无创替代方法，两者已被证明是相关的⁶。虽然SD-OCT不能达到细胞分辨率，但它确实允许在动物中进行纵向研究。这是有利的，因为随着时间的推移，可以在个体动物中跟踪疾病进展，而不是必须在特定时间点对动物实施安乐死。随着成像技术的不断改进，SD-OCT技术也将不断发展，提供增强的图像质量以及详细评估视网膜血管功能等生物过程的能力。自 1991 年问世以来，SD-OCT 技术在分辨率、速度^{和灵敏度方面}都取得了巨大进步7。

本研究利用SD-OCT系统量化视网膜变性、青光眼和糖尿病视网膜病变啮齿动物模型中视网膜层的变化。这里使用的SD-OCT系统是一种傅里叶域OCT系统，它利用低功耗、近红外光实时采集、处理和存储深度分辨图像。SD-OCT 系统在 800 nm 波段具有扩展的深度成像能力，可提供 8 mm 深度和 4 μm 分辨率。在傅里叶域检测中，来自组织的散射光与参考路径之间的干涉信号被傅里叶变换，以构建散射强度⁸的轴向扫描和/或轴向深度剖面。对于这里的研究，OCT束在所需的视网膜结构上扫描，同时连续获取轴向扫描。通常，扫描图案将二维网格（B扫描）作为线性一维扫描线（A扫描）的集合获取，这些线对应于使用光栅扫描图案的2D横截面图像。对于专注于小鼠近视的研究，该系统还用于测量眼部结构的尺寸（例如角膜厚度、晶状体厚度、玻璃体室深度和轴向长度）。

目前的系统允许用户设计自己的协议，创建可以根据感兴趣的眼部结构进行定制和选择的扫描。这些用户定义的协议中具有的主要扫描功能使这种成像技术用户友好。对于图像分析，我们在数学建模程序中开发了定制编程。SD-OCT是一种强大的工具，可以无创地识别和量化眼部结构的病理形态变化，并监测与视力相关的疾病进展。

研究方案

所描述的所有程序均已获得亚特兰大退伍军人事务机构动物护理和使用委员会的批准，并符合美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用指南（NIH出版物，第^8版， 2011年更新）。

注意:用于开发以下协议的 SD-OCT 系统在 材料表中进行了描述。虽然某些程序特定于该特定系统，但整体方法可以适用于其他OCT设备和动物模型。此外，在我们的实验室中，这些协议通常用于小鼠和大鼠;但是，整体方法可以用于不同的动物模型和SD-OCT设备，前提是个人在其设备上具有正确的镜头和功能。

1. 设置光学相干断层扫描设备

1. 打开 SD-OCT 软件（材料表）。
2. 定义谁正在服用OCT，研究和治疗组（如果相关）。命名这些类别的方式将有助于研究人员稍后在数据分析期间搜索所需的扫描。
   1. 在" 患者/ 检查"选项卡中，单击" 测试检查员"。选择考官的姓名。使用 "设置检查员和医生 "按钮添加新的检查员。
   2. 单击"算例名称"以定义 算例 。单击"研究"选项卡以添加新 研究 或修改现有研究中的治疗方法。单击"选择治疗臂"的右侧以 选择治疗臂 。
3. 单击添加 患者 按钮，该按钮用于为整个组添加新的时间点。当窗口出现时，输入 ID 号、名字和姓氏。选择"男性"或"女性"。输入出生日期。
4. 单击 "添加检查 "按钮以添加单个大鼠。要识别大鼠，请单击检查。单击 编辑考试。在"输入备注"框中 输入 ID 号。单击 保存更改 按钮。
5. 将正确的镜头安装到设备上（图1B），在软件中选择相应的配置，然后拨入关联的参考臂位置。
   注意:所描述的SD-OCT系统具有定制的镜头，预设扫描模式和 参考臂 设置，特定于动物物种和被成像的眼睛区域（视网膜或角膜，小鼠或大鼠）。其中一些细节特定于所描述的SD-OCT系统（见材料表）。例如，并非所有设备都提供 参考臂 路径长度的手动调整。
6. 在" 患者/ 检查"选项卡中，双击突出显示的检查以进入 " 成像"选项卡并开始成像，或者只需单击 "成像 "选项卡。如果有默认扫描，请右键单击以将其删除。
7. 通过单击从列表中选择协议按钮加载预设的扫描 协议 。或者，添加单个扫描。
8. 对于青光眼和糖尿病视网膜病变的大鼠模型以及视网膜变性的小鼠模型，请选择由四个图像组成的预设:2 个 OD 和 2 个 OS 扫描。对于鼠标近视，请选择由 8 张图像组成的预设:4 张 OD 和 4 张操作系统扫描。
   注意:预设成像将在第 3 节中更详细地解释。这是每个实验室在现场安装期间为自己或与制造商一起制作的东西。

2. 麻醉动物

1. 给予麻醉剂。
   1. 通过腹膜内注射用氯胺酮（60mg / kg）和甲苯噻嗪（7.5mg / kg）麻醉大鼠。
   2. 通过腹膜内注射用氯胺酮（80mg / kg）和甲苯噻嗪（16mg / kg）麻醉小鼠。
   3. 等到动物完全麻醉并且对脚趾捏没有反应。
2. 给予瞳孔散大滴剂（1%托吡卡胺）。等待瞳孔扩张后再进行成像。
   注意:瞳孔散大会增加视野，但不是必需的。如果有任何物体会接触到眼睛（例如，如果使用隐形眼镜或使用导板），也应使用局部（角膜）麻醉剂（0.5% 丁卡因）来麻痹眼睛。指南是一种放置在扫描头上的设备，可帮助初学者将眼睛和扫描头对齐。
3. 麻醉啮齿动物后，将啮齿动物置于可以在3维空间中旋转动物的啮齿动物对齐系统中（图1A，1C和1D）。提供热支持。
   注意:目前，我们使用啮齿动物比对系统来设计和销售SD-OCT设备。
4. 涂抹液体（例如生理盐水或人工泪液）以保持眼睛润滑。确保眼睛在成像过程中不会变干，以便在扫描之间保持眼睛的光学特性（当角膜潮湿时，可以清楚地看到视网膜）。
   1. 扫描第一只眼睛时，请确保保持对面眼睛的水分，以免其变干。
5. 在成像前，使用精细的工作擦拭来吸走多余的盐水，因为眼睛上的润滑剂过多或过少都会影响图像质量。
   注意: 在OCT期间不建议使用无菌润滑凝胶，因为它会干扰成像。如果需要，可以在手术后使用无菌润滑凝胶。也可以使用隐形眼镜以确保在整个测试过程中眼睛有足够的水分。根据我们的经验，隐形眼镜并没有显着改善图像质量，但隐形眼镜确实有助于降低成像过程中角膜干燥的风险。

3. 啮齿动物OCT成像

1. 从一只眼睛（OS或OD）开始，然后对侧眼睛成像。
   1. 使用啮齿动物对齐系统的两次旋转运动来定位动物，使视线水平并向下看OCT镜头的轴（图1D）。
   2. 在自由运行模式下使用 OCT 定向视网膜以进行数据收集。最初使用瞄准模式（通过单击瞄准按钮）可实时连续显示水平和垂直B扫描。
   3. 将扫描头移近眼睛，直到视网膜可见（因为小鼠和大鼠视网膜晶状体是定焦的，将晶状体移向眼睛聚焦到视网膜深处）。然后使用啮齿动物对准系统向上/向下调整动物位置并旋转/扭转以将视神经头定位在中心，使水平扫描水平，垂直扫描垂直（图1A）。
   4. 调整工作距离，使视网膜图像平坦且不弯曲。
   5. 调整参考臂位置，使图像靠近显示窗口的顶部。小心不要推得太远，否则眼睛图像会自行翻转。
2. 视网膜成像
   1. 对于青光眼、视网膜变性和糖尿病视网膜病变模型:定义由 1000 x 100 x 1（A 扫描 x B 扫描 x 重复 B 扫描）组成的体积扫描以进行平均。在大鼠中，进行3 x 3毫米的体积扫描。在小鼠中，进行1.5 x 1.5毫米体积扫描。
   2. 将视神经在水平和垂直通道中居中，以便体积扫描位于中心。花点时间确保视神经头位于扫描的中心，并沿着鼻颞轴和上下轴笔直（图2）。如果需要，扫描并重新居中以确保它正好位于中心。根据需要重复此扫描，直到视神经头居中并沿两个轴对齐。点击 快照 按钮拍摄照片。
      注意:某些SD-OCT设备可以选择通过使用 参考臂调整眼睛与光源的距离来光学操纵眼睛的曲率（例如，图像被展平）。我们建议在通过视网膜层进行直接厚度测量时将图像展平并居中，以提高沿前后方向的准确性。
   3. 点击 保存 按钮保存图像。
   4. 以视神经头为中心进行径向扫描，尺寸为1000 x 4 x 20（A扫描x B扫描x重复B扫描）。使用重复的B扫描来提高眼睛或视网膜的图像清晰度，这将有助于在数据分析过程中解释眼睛区域或视网膜层。
      注意:同样，在大鼠中，径向扫描为3毫米，而在小鼠中，径向扫描为1.5毫米。
   5. 保存图像。
   6. 在对侧眼中重复步骤 3.1 至 3.2.5。
3. 轴向长度测量
   1. 对于涉及整只眼睛成像的项目，例如小鼠近视，对整只眼睛进行三次扫描，对每只眼睛进行一次视网膜扫描。选择一个预设，该预设由 500 x 20 x 1 的径向扫描组成，涵盖眼睛的整个直径。
      注意:此设置提供从角膜到脉络膜的小鼠眼睛整个长度的图像。
   2. 将眼睛和视网膜的中间置于视野的中心。进行三次径向扫描（全眼扫描）:在同一位置进行一次 1000 x 5 x 2 的线性 B 扫描和两次 1000 x 5 x 2 的附加线性 B 扫描。保存图像。
   3. 然后，如果需要，放大并进行类似于 3.2 中的描述的体积或矩形扫描（视网膜扫描），包括 1000 x 20 A 扫描 x B 扫描。保存卷扫描。
   4. 在对侧眼中重复步骤 3.3 至 3.3.3。
      注意:轴向长度测量只能在小眼睛（鼠标或更小）上进行，因为当前系统的成像窗口不足以捕获较大的眼睛。

4. 成像后步骤

1. 将保存的数据存储在云上，这是数据管理的良好做法，并允许轻松访问以供以后分析。使用在数学建模程序中开发的自定义软件（材料表）执行数据分析。
2. 从啮齿动物对准系统中取出啮齿动物，腹腔注射阿替美唑（大鼠和小鼠为1mg / kg）以逆转甲苯噻嗪的作用，使啮齿动物更快地醒来。
3. 让啮齿动物在加热垫上用小火恢复。根据需要给予额外的生理盐水滴剂。当啮齿动物恢复完全行走时，将它们送回家笼。
4. 关闭程序并关闭 OCT。

5. OCT图像的后处理

1. 使用在数学建模程序中开发的自定义软件处理图像，以满足特定的OCT需求（例如，通过手动标记图像来测量感兴趣区域的厚度）。
2. 根据图像的目的（小鼠视网膜、大鼠视网膜或近视/轴长），使用以下三种不同程序之一:
   1. 要处理视网膜，请选择要加载的OCT扫描。首先，通过简单的点击定义视神经头的中心。
   2. 观看程序生成垂直线，定义视神经头两侧的距离。请注意，在大鼠视网膜中，这些线距离视神经头中心0.5毫米和1.2毫米，总共有4条垂直线代表眼睛的鼻颞轴和下上轴，具体取决于当前分析的径向B扫描。
      注意:在小鼠视网膜中，这些垂直线距离视神经头中枢分别为0.25毫米和0.5毫米。
   3. 沿每条线描绘以下图层:
      视网膜神经纤维层 （RNFL）、内丛状层 （IPL）、内核层 （INL）、外丛状层 （OPL）、外核层 （ONL）、外部限制膜 （ELM）、内段/外段 （IS/OS）、视网膜色素上皮 （RPE） 和总视网膜厚度。
      注意:径向扫描打开时通常没有鼻/颞和上/下标签。可以创建扫描，使其具有 n/t 和 s/I 方向，特别是这些扫描将在以后进行分析。
   4. 描绘图像并关闭程序后，将这些测量值导出到电子表格软件中进行数据分析。
3. 使用步骤 5 中的这些长度和厚度值在组之间进行比较，例如，确定是否存在区域差异 （n/t/s/i） 或纵向变化。
4. 对于视网膜测量，首先确定在0.5毫米和1.2毫米距离处鼻颞轴和下上轴是否存在任何差异。
   注意:如果未观察到象限的差异，则可以将0.5 mm和1.2 mm的测量值平均在一起。对于仅在0.25毫米和0.5毫米处进行小鼠视网膜扫描，这是一种类似的方法。
5. 对于近视研究，请使用该程序评估沿眼睛光轴的眼部参数。打开数学建模程序。首先，选择要加载的图像。
   1. 加载图像后，手动标记每个扫描（径向和B扫描）。标记角膜、晶状体、玻璃体室和视网膜的前缘和后缘，以便程序计算角膜厚度、晶状体厚度、前室和玻璃体室深度、视网膜总厚度、总轴长。
   2. 标记后，退出程序，提示保存菜单。将划定的值保存在电子表格软件中，并将三个单独的扫描平均在一起。

结果

如果获得高质量的图像，从而可以可靠地测量眼部尺寸，则认为SD-OCT是成功的。在这里，使用视网膜变性，青光眼，糖尿病视网膜病变和近视的模型说明了SD-OCT的各种用途。

在光诱导的视网膜变性（LIRD）模型中，暴露于强光（10，000勒克斯）会诱导视网膜中感光细胞的变性⁹。与未受损（对照）小鼠相比，具有代表性的SD-OCT图像显示LIRD BALB / c小鼠视网膜中含...

讨论

体内眼部结构的高分辨率成像可以评估视网膜和眼部随时间的变化。在该协议中，SD-OCT被证明可以捕获视网膜变性，青光眼，糖尿病视网膜病变和近视模型中体内眼部结构的差异。

执行SD-OCT时最关键的方面是获得视网膜或其他感兴趣的眼部结构的清晰图像。重要的是要花时间确保视网膜完全居中并具有出色的清晰度。啮齿动物的沉重呼吸会导致嘈杂的图像（实际上可以看到?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% tropicamide	Sandoz	Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59
0.5% tetracaine	Alcon	NDC 0065-0741-12
AIM-RAS G3 120 V	Leica Bioptigen	90-AIMRAS-G3-120	Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice
Celluvisc gel	REFRESH CELLUVISC	#4554; NDC-0023-4554-30
G3 18 mm Telecentric Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-18
G3 Mouse Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-M
G3 Rat Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-R
heating pad	Fabrication	11-1130
InVivoVue software	Leica Bioptigen		Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system
MATLAB	Mathworks		mathematical modeling program
Mouse/Rat Kit	Leica Bioptigen	90-KIT-M/R	Mouse/rat rodent alignment system
saline	ADDIPAK	200-39
System Envisu R4300 VHR 120 V	Leica Bioptigen	90-R4300-V1-120	SD-OCT system