Valutazioni strutturali in vivo della malattia oculare in modelli di roditori mediante tomografia a coerenza ottica

Riepilogo

Qui, descriviamo l'uso della tomografia a coerenza ottica di dominio spettrale (SD-OCT) per visualizzare strutture retiniche e oculari in vivo in modelli di degenerazione retinica, glaucoma, retinopatia diabetica e miopia.

Abstract

La tomografia a coerenza ottica di dominio spettrale (SD-OCT) è utile per visualizzare le strutture retiniche e oculari in vivo. Nella ricerca, SD-OCT è uno strumento prezioso per valutare e caratterizzare i cambiamenti in una varietà di modelli di malattie e lesioni retiniche e oculari. Nei modelli di degenerazione retinica indotta dalla luce, SD-OCT può essere utilizzato per tracciare l'assottigliamento dello strato di fotorecettore nel tempo. Nei modelli di glaucoma, SD-OCT può essere utilizzato per monitorare la diminuzione dello strato di fibre nervose retiniche e lo spessore totale della retina e per osservare la coppettazione del nervo ottico dopo aver indotto ipertensione oculare. Nei roditori diabetici, SD-OCT ha aiutato i ricercatori a osservare una diminuzione dello spessore retinico totale e una diminuzione dello spessore di specifici strati retinici, in particolare lo strato di fibre nervose retiniche con progressione della malattia. Nei modelli murini di miopia, SD-OCT può essere utilizzato per valutare i parametri assiali, come le variazioni della lunghezza assiale. I vantaggi di SD-OCT includono l'imaging in vivo delle strutture oculari, la capacità di tracciare quantitativamente i cambiamenti nelle dimensioni oculari nel tempo, la sua rapida velocità di scansione e alta risoluzione. Qui, descriviamo in dettaglio i metodi di SD-OCT e mostriamo esempi del suo utilizzo nel nostro laboratorio in modelli di degenerazione retinica, glaucoma, retinopatia diabetica e miopia. I metodi includono l'anestesia, l'imaging SD-OCT e l'elaborazione delle immagini per le misurazioni dello spessore.

Introduzione

La tomografia a coerenza ottica di dominio spettrale (SD-OCT) è una modalità di imaging precisa e ad alta risoluzione che consente a medici e ricercatori di esaminare le strutture oculari in modo non invasivo. Questa tecnica di imaging si basa sull'interferometria per catturare immagini retiniche tridimensionali in vivo su scala micrometrica ^1,2. È diventata una delle modalità di imaging più frequentemente utilizzate nella ricerca visiva e nella clinica a causa della facile individuazione e accuratezza di caratteristiche patologiche come difetti strutturali e / o assottigliamento degli strati retinici e del liquido sottoretinico³. Nella ricerca che utilizza modelli animali di disturbi visivi, SD-OCT ha fornito analisi essenziali non invasive delle relazioni tra struttura e funzione e delle loro origini istopatologiche⁴. Grazie alla sua risoluzione (fino a 2-3 micron, a seconda della profondità nell'occhio⁵), SD-OCT ha la capacità di rilevare anche piccoli cambiamenti nello spessore dello strato retinico. Questo tipo di analisi può fornire informazioni essenziali per la progressione della malattia e valutare l'efficacia dei metodi neuroprotettivi e dei trattamenti per i disturbi della vista.

SD-OCT è un'alternativa non invasiva all'esame istologico della struttura e i due hanno dimostrato di essere correlati⁶. Mentre SD-OCT non raggiunge la risoluzione cellulare, consente studi longitudinali negli animali. Ciò è vantaggioso perché la progressione della malattia può essere monitorata nei singoli animali nel tempo invece di dover eutanasia sugli animali in punti temporali specifici. Man mano che le tecniche di imaging continuano a migliorare, anche la tecnologia SD-OCT progredirà, fornendo una migliore qualità dell'immagine e la capacità di valutare i processi biologici come la funzione dei vasi sanguigni retinici in dettaglio. Fin dal suo avvento nel 1991, la tecnologia SD-OCT ha visto enormi progressi in termini di risoluzione, velocità e sensibilità⁷.

Il presente studio utilizza un sistema SD-OCT per quantificare i cambiamenti negli strati retinici nei modelli di roditori di degenerazione retinica, glaucoma e retinopatia diabetica. Il sistema SD-OCT utilizzato qui è un sistema OCT di dominio di Fourier che utilizza luce a bassa potenza nel vicino infrarosso per acquisire, elaborare e memorizzare immagini risolte in profondità in tempo reale. Il sistema SD-OCT ha esteso la capacità di imaging della profondità nella banda di lunghezza d'onda di 800 nm, fornendo una profondità di 8 mm e una risoluzione di 4 μm. Nel rilevamento del dominio di Fourier, il segnale di interferenza tra la luce diffusa dal tessuto e un percorso di riferimento è trasformato di Fourier per costruire scansioni assiali e/o profili di profondità assiale di intensità diffusa⁸. Per gli studi qui, il fascio OCT viene scansionato sulla struttura retinica desiderata mentre acquisisce in serie scansioni assiali. In genere, un modello di scansione acquisisce la griglia bidimensionale (B-Scans) come una raccolta di linee di scansione lineari unidimensionali (A-Scans), che corrispondono a immagini in sezione trasversale 2D utilizzando un modello di scansione raster. Per gli studi incentrati sulla miopia nei topi, questo sistema viene utilizzato anche per misurare le dimensioni delle strutture oculari (ad esempio, spessore della cornea, spessore del cristallino, profondità della camera vitreale e lunghezza assiale).

L'attuale sistema consente agli utenti di progettare i propri protocolli, creando scansioni che possono essere personalizzate e selezionate in base alle strutture oculari di interesse. Le scansioni principali presenti in questi protocolli definiti dall'utente rendono questa tecnica di imaging facile da usare. Per l'analisi delle immagini, abbiamo sviluppato una programmazione personalizzata in un programma di modellazione matematica. SD-OCT è un potente strumento per identificare e quantificare in modo non invasivo i cambiamenti patomorfologici nelle strutture oculari e monitorare la progressione della malattia correlata alla vista.

Protocollo

Tutte le procedure descritte sono state approvate dall'Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee e conformi alla guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (NIH Publications, 8a^edizione, aggiornata nel 2011).

NOTA: il sistema SD-OCT utilizzato per sviluppare il protocollo riportato di seguito è descritto nella tabella dei materiali. Sebbene alcune procedure siano specifiche di questo particolare sistema, l'approccio globale può essere adattato ad altri dispositivi OCT e modelli animali. Inoltre, nel nostro laboratorio, questi protocolli sono comunemente usati nei topi e nei ratti; tuttavia, l'approccio generale può essere adottato per diversi modelli animali e dispositivi SD-OCT a condizione che un individuo abbia l'obiettivo e le capacità corrette sul proprio dispositivo.

1. Impostare l'apparecchiatura per la tomografia a coerenza ottica

1. Aprire il software SD-OCT (Table of Materials).
2. Definire chi sta assumendo l'OCT, lo studio e il braccio di trattamento (se pertinente). Assegna un nome a queste categorie in modo da aiutare i ricercatori a cercare le scansioni desiderate in seguito durante l'analisi dei dati.
   1. Nella scheda Paziente/Esame , fare clic su Test Examiner. Selezionare il nome dell'esaminatore. Utilizzare il pulsante Imposta esaminatori e medici per aggiungere nuovi esaminatori.
   2. Fare clic su Nome studio per definire lo studio . Fare clic sulla scheda Studio per aggiungere un nuovo studio o modificare i trattamenti in uno studio esistente. Fare clic a destra di Seleziona braccio di trattamento per selezionare un braccio di trattamento.
3. Fare clic sul pulsante Aggiungi paziente , utilizzato per aggiungere un nuovo punto temporale per un intero gruppo. Quando viene visualizzata la finestra, immettere il numero ID, Nome e Cognome. Seleziona Maschio o Femmina. Inserisci la data di nascita.
4. Fai clic sul pulsante Aggiungi esame per aggiungere i singoli ratti. Per identificare i ratti, fai clic su un esame. Fai clic su Modifica esame. Immettere il numero ID nella casella Immetti note . Fare clic sul pulsante Salva modifiche .
5. Collegare l'obiettivo corretto al dispositivo (Figura 1B), selezionare la configurazione corrispondente nel software e comporre la posizione del braccio di riferimento associata.
   NOTA: Il sistema SD-OCT descritto ha lenti personalizzate, modelli di scansione preimpostati e impostazioni del braccio di riferimento specifiche per la specie animale e la regione dell'occhio da visualizzare (retina o cornea, topo o ratto). Alcuni di questi dettagli sono specifici del sistema SD-OCT descritto (vedere la tabella dei materiali). Ad esempio, non tutti i dispositivi offrono la regolazione manuale della lunghezza del percorso del braccio di riferimento .
6. Nella scheda Paziente/Esame , fare doppio clic sull'esame evidenziato per passare alla scheda Imaging e iniziare l'imaging o semplicemente fare clic sulla scheda Imaging . Se è presente una scansione predefinita, fare clic con il pulsante destro del mouse per eliminarla.
7. Caricare un protocollo di scansione preimpostato facendo clic sul pulsante Seleziona un protocollo dall'elenco . In alternativa, aggiungere singole scansioni.
8. Per i modelli di ratto di glaucoma e retinopatia diabetica e i modelli murini di degenerazione retinica, scegliere un preset composto da quattro immagini: 2 scansioni OD e 2 OS. Per la miopia del mouse, scegli un preset composto da 8 immagini: 4 OD e 4 scansioni OS.
   NOTA: L'imaging preimpostato verrà spiegato più dettagliatamente nella Sezione 3. Questo è qualcosa che ogni laboratorio fa per se stesso o con il produttore durante l'installazione in loco.

2. Anestetizzare l'animale

1. Somministrare anestetico.
   1. Anestetizzare ratti con ketamina (60 mg/kg) e xilazina (7,5 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale.
   2. Anestetizzare i topi con ketamina (80 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale.
   3. Attendere che gli animali siano completamente anestetizzati e non rispondano al pizzico delle dita dei piedi.
2. Somministrare gocce di dilatazione della pupilla (1% tropicamide). Attendere che le pupille si dilatino prima di immaginare.
   NOTA: la dilatazione delle pupille aumenta il campo visivo ma non è un requisito. Le gocce di anestetico locale (cornea) (0,5% di tetracaina) per intorpidire l'occhio dovrebbero essere utilizzate anche se qualcosa toccherà l'occhio (ad esempio, se si applicano lenti a contatto o si utilizza una guida). Una guida è un dispositivo che viene posizionato sopra la testa di scansione e aiuta i principianti ad allineare l'occhio e la testa di scansione.
3. Dopo aver anestetizzato il roditore, posizionare il roditore in un sistema di allineamento dei roditori che può ruotare l'animale nello spazio 3-dimensionale (Figura 1A, 1C e 1D). Fornire supporto termico.
   NOTA: Attualmente, utilizziamo sistemi di allineamento dei roditori per topi e ratti progettati e venduti con il dispositivo SD-OCT.
4. Applicare liquidi (ad esempio, salini o lacrime artificiali) per mantenere gli occhi lubrificati. Assicurarsi che l'occhio non si asciughi durante l'imaging in modo che le proprietà ottiche dell'occhio siano mantenute tra le scansioni (quando la cornea è bagnata, la retina può essere vista chiaramente).
   1. Assicurati di mantenere l'umidità nell'occhio opposto durante la scansione del primo occhio in modo che non si asciughi.
5. Utilizzare una delicata pulizia per rimuovere la soluzione salina in eccesso poco prima dell'imaging, poiché troppo o troppo poco lubrificante sull'occhio influenzerà la qualità dell'immagine.
   NOTA: L'uso di gel lubrificante sterile non è raccomandato durante l'OCT poiché può interferire con l'imaging. Se necessario, dopo la procedura può essere utilizzato gel lubrificante sterile. Una lente a contatto può anche essere applicata per garantire un'adeguata umidità sull'occhio durante il test. Nella nostra esperienza, una lente a contatto non ha fornito un netto miglioramento della qualità dell'immagine, ma le lenti a contatto aiutano a ridurre il rischio di secchezza della cornea durante la sessione di imaging.

3. Imaging OCT dei roditori

1. Inizia con un occhio (OS o OD) e immagina l'occhio controlaterale dopo.
   1. Posizionare l'animale usando i due movimenti rotazionali del sistema di allineamento dei roditori, in modo tale che lo sguardo sia orizzontale e guardando verso il basso l'asse della lente OCT (Figura 1D).
   2. Utilizzare lo Strumento di personalizzazione di Office in modalità Esecuzione libera per orientare la retina per la raccolta dei dati. Utilizzare la modalità Aim (facendo clic sul pulsante Mira) inizialmente per una visualizzazione continua delle scansioni B orizzontali e verticali in tempo reale.
   3. Spostare la testina di scansione più vicino all'occhio fino a quando la retina è visibile (poiché le lenti della retina del topo e del ratto sono a fuoco fisso, spostare la lente verso l'occhio si concentra più in profondità nella retina). Quindi utilizzare il sistema di allineamento dei roditori per regolare la posizione dell'animale su / giù e ruotare / ruotare per posizionare la testa del nervo ottico al centro, rendere orizzontale la scansione orizzontale e verticale la scansione verticale (Figura 1A).
   4. Regolare la distanza di lavoro in modo che l'immagine retinica sia piatta e non curva.
   5. Regolate la posizione del braccio di riferimento per mantenere l'immagine vicino alla parte superiore della finestra di visualizzazione. Fai attenzione a non spingere troppo lontano o l'immagine dell'occhio si capovolgerà su se stessa.
2. Imaging retinico
   1. Per i modelli di glaucoma, degenerazione retinica e retinopatia diabetica: definire una scansione del volume composta da 1000 x 100 x 1 (scansioni A x scansioni B x scansioni B ripetute) per la media. Nei ratti, eseguire una scansione del volume di 3 x 3 mm. Nei topi, eseguire una scansione del volume di 1,5 x 1,5 mm.
   2. Centrare il nervo ottico nell'accesso orizzontale e verticale in modo che la scansione del volume sia al centro. Prenditi del tempo per assicurarti che la testa del nervo ottico sia al centro della scansione e dritta lungo gli assi nasale-temporale e superiore-inferiore (Figura 2). Scansiona e ricentra per assicurarti che sia esattamente al centro, se necessario. Ripetere questa scansione se necessario fino a quando la testa del nervo ottico è centrata e allineata lungo entrambi gli assi. Fai clic sul pulsante Istantanea per scattare una foto.
      NOTA: alcuni dispositivi SD-OCT hanno la possibilità di manipolare otticamente la curvatura dell'occhio (ad esempio, l'immagine è appiattita) regolando la distanza dell'occhio dalla sorgente luminosa con il braccio di riferimento. Si consiglia di appiattire e centrare le immagini quando si effettuano misurazioni dirette dello spessore attraverso gli strati retinici per migliorare la precisione lungo la direzione antero-posteriore.
   3. Fare clic sul pulsante Salva per salvare l'immagine.
   4. Fai una scansione radiale centrata sulla testa del nervo ottico che è 1000 x 4 x 20 (A-scan x B-scan x ripetute B-scans). Utilizzare ripetute scansioni B per migliorare la chiarezza dell'immagine dell'occhio o della retina, che aiuterà a interpretare le regioni dell'occhio o gli strati della retina durante l'analisi dei dati.
      NOTA: Ancora una volta, nei ratti questa scansione radiale è di 3 mm, mentre nei topi la scansione radiale è di 1,5 mm.
   5. Salvare l'immagine.
   6. Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.2.5 nell'occhio controlaterale.
3. Misure di lunghezza assiale
   1. Per i progetti che coinvolgono l'imaging dell'intero occhio, come la miopia del topo, eseguire tre scansioni dell'intero occhio e una scansione della retina per ciascun occhio. Scegli un preset che consiste in una scansione radiale di 500 x 20 x 1 e comprende l'intero diametro dell'occhio.
      NOTA: questa impostazione fornisce un'immagine dell'intera lunghezza dell'occhio del mouse dalla cornea alla coroide.
   2. Centrare il centro dell'occhio e la retina nel campo visivo. Prendi tre scansioni radiali (scansioni dell'occhio intero): una scansione lineare B che è 1000 x 5 x 2 e due ulteriori scansioni lineari B di 1000 x 5 x 2 nella stessa posizione. Salvare le immagini.
   3. Successivamente, se lo si desidera, ingrandire ed eseguire una scansione del volume o rettangolare (scansione della retina) simile alla descrizione in 3.2 che consiste in scansioni 1000 x 20 A x scansioni B. Salvare la scansione del volume.
   4. Ripetere i passaggi da 3.3 a 3.3.3 nell'occhio controlaterale.
      NOTA: le misurazioni della lunghezza assiale sono possibili solo su occhi piccoli (mouse o più piccoli) poiché la finestra di imaging dei sistemi attuali non è abbastanza grande da catturare un occhio più grande.

4. Fasi post-imaging

1. Archivia i dati salvati su un cloud, che è una buona pratica per la gestione dei dati e consente un facile accesso per analisi successive. Eseguire analisi dei dati con software personalizzato sviluppato in un programma di modellazione matematica (Table of Materials).
2. Rimuovere il roditore dal sistema di allineamento dei roditori e somministrare un'iniezione intraperitoneale di atipamezolo (1 mg/kg per ratti e topi) per invertire gli effetti della xilazina, in modo che il roditore si svegli più rapidamente.
3. Consentire ai roditori di recuperare su una piastra elettrica a fuoco basso. Dare ulteriori gocce saline se necessario. Riportare i roditori nella loro gabbia di casa quando hanno riacquistato la deambulazione completa.
4. Chiudere il programma e disattivare lo Strumento di personalizzazione di Office.

5. Post-elaborazione delle immagini OCT

1. Elaborare le immagini utilizzando un software personalizzato sviluppato in un programma di modellazione matematica per soddisfare specifiche esigenze dello Strumento di personalizzazione (ad esempio, misurare lo spessore delle aree di interesse contrassegnando manualmente le immagini).
2. A seconda dello scopo dell'immagine (retina del topo, retina del ratto o miopia/lunghezza assiale), utilizzare uno dei tre diversi programmi:
   1. Per l'elaborazione della retina, selezionare le scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office da caricare. Innanzitutto, definisci il centro della testa del nervo ottico con un semplice clic.
   2. Guarda come il programma genera linee verticali che definiscono le distanze su entrambi i lati della testa del nervo ottico. Si noti che nella retina di ratto, queste linee sono a 0,5 mm e 1,2 mm di distanza dal centro della testa del nervo ottico, per un totale di 4 linee verticali che rappresentano gli assi naso-temporale e inferiore-superiore dell'occhio a seconda della scansione radiale B attualmente analizzata.
      NOTA: Nella retina del topo, queste linee verticali si trovano a 0,25 mm e 0,5 mm dal centro della testa del nervo ottico.
   3. Delinea i seguenti livelli lungo ogni riga:
      Lo strato di fibre nervose retiniche (RNFL), lo strato plessiforme interno (IPL), lo strato nucleare interno (INL), lo strato plessiforme esterno (OPL), lo strato nucleare esterno (ONL), la membrana limitante esterna (ELM), i segmenti interni / segmenti esterni (IS / OS), l'epitelio pigmentato retinico (RPE) e lo spessore retinico totale.
      NOTA: La scansione radiale in genere non ha etichette nasali / temporali e superiori / inferiori quando viene aperta. Le scansioni possono essere create in modo tale da avere un orientamento n/t e s/I, e quelle scansioni in particolare vengono analizzate in seguito.
   4. Dopo che un'immagine è stata delineata e il programma chiuso, esportare queste misurazioni in un software di foglio di calcolo per l'analisi dei dati.
3. Utilizzare questi valori di lunghezza e spessore del passaggio 5 per effettuare confronti tra gruppi, ad esempio determinando se esistono differenze regionali (n/t/s/i) o cambiamenti longitudinali.
4. Per le misurazioni della retina, determinare innanzitutto se ci sono differenze nell'asse naso-temporale e inferiore-superiore alle distanze di 0,5 mm e 1,2 mm.
   NOTA: Se non si osservano differenze nei quadranti, le misurazioni di 0,5 mm e 1,2 mm possono essere mediate insieme. Questo è un approccio simile per le scansioni retiniche del topo solo a 0,25 mm e 0,5 mm.
5. Per gli studi sulla miopia, utilizzare questo programma per valutare i parametri oculari lungo l'asse ottico dell'occhio. Aprire il programma di modellazione matematica. Innanzitutto, seleziona un'immagine da caricare.
   1. Dopo aver caricato l'immagine, contrassegnare manualmente ogni scansione (radiale e B). Contrassegnare i bordi anteriore e posteriore della cornea, della lente, della camera vitreale e della retina, in modo che il programma calcoli lo spessore corneale, lo spessore della lente, la profondità della camera anteriore e vitreale, lo spessore totale della retina, la lunghezza assiale totale.
   2. Dopo la marcatura, uscire dal programma che richiede un menu di salvataggio. Salva i valori delineati in un software per fogli di calcolo e calcola la media delle tre scansioni separate insieme.

Risultati

SD-OCT è considerato di successo se si ottengono immagini di alta qualità in modo tale che le dimensioni oculari possano essere misurate in modo affidabile. Qui, una varietà di usi di SD-OCT sono illustrati utilizzando modelli di degenerazione retinica, glaucoma, retinopatia diabetica e miopia.

In un modello di degenerazione retinica indotta dalla luce (LIRD), l'esposizione alla luce intensa (10.000 lux) induce la degenerazione delle cellule fotorecettrici nella retina⁹

Discussione

L'imaging ad alta risoluzione delle strutture oculari in vivo consente di valutare i cambiamenti retinici e oculari nel tempo. In questo protocollo, SD-OCT ha dimostrato di catturare le differenze nelle strutture oculari in vivo in modelli di degenerazione retinica, glaucoma, retinopatia diabetica e miopia.

L'aspetto più critico quando si esegue SD-OCT è ottenere un'immagine chiara della retina o di un'altra struttura oculare di interesse. È importante prendersi del tempo per assicurarsi ch...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% tropicamide	Sandoz	Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59
0.5% tetracaine	Alcon	NDC 0065-0741-12
AIM-RAS G3 120 V	Leica Bioptigen	90-AIMRAS-G3-120	Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice
Celluvisc gel	REFRESH CELLUVISC	#4554; NDC-0023-4554-30
G3 18 mm Telecentric Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-18
G3 Mouse Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-M
G3 Rat Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-R
heating pad	Fabrication	11-1130
InVivoVue software	Leica Bioptigen		Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system
MATLAB	Mathworks		mathematical modeling program
Mouse/Rat Kit	Leica Bioptigen	90-KIT-M/R	Mouse/rat rodent alignment system
saline	ADDIPAK	200-39
System Envisu R4300 VHR 120 V	Leica Bioptigen	90-R4300-V1-120	SD-OCT system