Évaluations structurales in vivo des maladies oculaires dans des modèles de rongeurs utilisant la tomographie par cohérence optique

Résumé

Ici, nous décrivons l’utilisation de la tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) pour visualiser les structures rétiniennes et oculaires in vivo dans des modèles de dégénérescence rétinienne, de glaucome, de rétinopathie diabétique et de myopie.

Résumé

La tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) est utile pour visualiser les structures rétiniennes et oculaires in vivo. En recherche, le SD-OCT est un outil précieux pour évaluer et caractériser les changements dans une variété de modèles de maladies et de blessures rétiniennes et oculaires. Dans les modèles de dégénérescence rétinienne induite par la lumière, le SD-OCT peut être utilisé pour suivre l’amincissement de la couche photoréceptrice au fil du temps. Dans les modèles de glaucome, le SD-OCT peut être utilisé pour surveiller la diminution de la couche de fibres nerveuses rétiniennes et de l’épaisseur totale de la rétine et pour observer les ventouses du nerf optique après avoir induit une hypertension oculaire. Chez les rongeurs diabétiques, le SD-OCT a aidé les chercheurs à observer une diminution de l’épaisseur totale de la rétine ainsi qu’une diminution de l’épaisseur de couches rétiniennes spécifiques, en particulier la couche de fibres nerveuses rétiniennes avec la progression de la maladie. Dans les modèles murins de myopie, le SD-OCT peut être utilisé pour évaluer les paramètres axiaux, tels que les changements de longueur axiale. Les avantages du SD-OCT comprennent l’imagerie in vivo des structures oculaires, la capacité de suivre quantitativement les changements dans les dimensions oculaires au fil du temps, ainsi que sa vitesse de balayage rapide et sa haute résolution. Ici, nous détaillons les méthodes de SD-OCT et montrons des exemples de son utilisation dans notre laboratoire dans des modèles de dégénérescence rétinienne, de glaucome, de rétinopathie diabétique et de myopie. Les méthodes comprennent l’anesthésie, l’imagerie SD-OCT et le traitement des images pour les mesures d’épaisseur.

Introduction

La tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) est une modalité d’imagerie précise à haute résolution qui permet aux cliniciens et aux chercheurs d’examiner les structures oculaires de manière non invasive. Cette technique d’imagerie est basée sur l’interférométrie pour capturer des images rétiniennes tridimensionnelles in vivo à l’échelle^{micrométrique 1,2}. Il est devenu l’une des modalités d’imagerie les plus fréquemment utilisées dans la recherche sur la vision et en clinique en raison de la détection facile et de la précision des caractéristiques pathologiques telles que les défauts structurels et / ou l’amincissement des couches rétiniennes et du liquide sous-rétinien³. Dans le cadre de recherches utilisant des modèles animaux de troubles liés à la vision, le SD-OCT a fourni des analyses non invasives essentielles des relations entre la structure et la fonction et de leurs origines histopathologiques⁴. En raison de sa résolution (jusqu’à 2-3 microns, selon la profondeur dans l’œil⁵), SD-OCT a la capacité de détecter même de petits changements dans l’épaisseur de la couche rétinienne. Ce type d’analyse peut fournir des informations essentielles pour la progression de la maladie et évaluer l’efficacité des méthodes neuroprotectrices et des traitements pour les troubles liés à la vision.

Le SD-OCT est une alternative non invasive à l’examen histologique de la structure, et il a été démontré que les deux sont corrélés⁶. Bien que le SD-OCT n’atteigne pas la résolution cellulaire, il permet des études longitudinales chez l’animal. Ceci est avantageux parce que la progression de la maladie peut être suivie chez des animaux individuels au fil du temps plutôt que d’avoir à euthanasier les animaux à des moments précis. Au fur et à mesure que les techniques d’imagerie continueront de s’améliorer, la technologie SD-OCT progressera également, offrant une qualité d’image améliorée ainsi que la capacité d’évaluer en détail les processus biologiques tels que la fonction des vaisseaux sanguins rétiniens. Même depuis son avènement en 1991, la technologie SD-OCT a connu d’énormes progrès en termes de résolution, de vitesse et de sensibilité⁷.

La présente étude utilise un système SD-OCT pour quantifier les changements dans les couches rétiniennes dans les modèles de rongeurs de dégénérescence rétinienne, de glaucome et de rétinopathie diabétique. Le système SD-OCT utilisé ici est un système OCT à domaine de Fourier qui utilise une lumière proche infrarouge de faible puissance pour acquérir, traiter et stocker des images résolues en profondeur en temps réel. Le système SD-OCT a une capacité d’imagerie de profondeur étendue dans la bande de longueur d’onde de 800 nm, offrant une profondeur de 8 mm et une résolution de 4 μm. Dans la détection du domaine de Fourier, le signal d’interférence entre la lumière diffusée du tissu et un chemin de référence est transformé de Fourier pour construire des balayages axiaux et/ou des profils de profondeur axiale d’intensité dispersée⁸. Pour les études ici, le faisceau OCT est balayé sur la structure rétinienne souhaitée tout en acquérant des balayages axiaux en série. En règle générale, un motif de balayage acquiert la grille bidimensionnelle (B-Scans) sous la forme d’une collection de lignes de balayage linéaires unidimensionnelles (A-Scans), qui correspondent à des images en coupe 2D à l’aide d’un motif de balayage raster. Pour les études axées sur la myopie chez la souris, ce système est également utilisé pour mesurer les dimensions des structures oculaires (par exemple, l’épaisseur de la cornée, l’épaisseur du cristallin, la profondeur de la chambre vitrée et la longueur axiale).

Le système actuel permet aux utilisateurs de concevoir leurs propres protocoles, en créant des scans qui peuvent être adaptés et sélectionnés en fonction des structures oculaires d’intérêt. Les principaux scans présentés dans ces protocoles définis par l’utilisateur rendent cette technique d’imagerie conviviale. Pour les analyses d’images, nous avons développé une programmation personnalisée dans un programme de modélisation mathématique. Le SD-OCT est un outil puissant pour identifier et quantifier de manière non invasive les changements pathomorphologiques dans les structures oculaires et surveiller la progression des maladies liées à la vision.

Protocole

Toutes les procédures décrites ont été approuvées par l’Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee et conformes au guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publications, 8^e édition, mise à jour en 2011).

REMARQUE : Le système SD-OCT utilisé pour développer le protocole ci-dessous est décrit dans le tableau des matériaux. Bien que certaines procédures soient spécifiques à ce système particulier, l’approche globale peut être adaptée à d’autres dispositifs et modèles animaux de PTO. De plus, dans notre laboratoire, ces protocoles sont couramment utilisés chez les souris et les rats; cependant, l’approche globale peut être adoptée pour différents modèles animaux et dispositifs SD-OCT à condition qu’une personne dispose de l’objectif et des capacités appropriés sur son appareil.

1. Mettre en place l’équipement de tomographie par cohérence optique

1. Ouvrez le logiciel SD-OCT (Table of Materials).
2. Définir qui prend l’EAO, l’étude et le bras de traitement (le cas échéant). Nommez ces catégories de manière à aider les chercheurs à rechercher les analyses souhaitées plus tard au cours de l’analyse des données.
   1. Dans l’onglet Patient/Examen , cliquez sur Examinateur de test. Sélectionnez le nom de l’examinateur. Utilisez le bouton Configurer les examinateurs et les médecins pour ajouter de nouveaux examinateurs .
   2. Cliquez sur Nom de l’étude pour définir l’étude. Cliquez sur l’onglet Étude pour ajouter une nouvelle étude ou modifier des traitements dans une étude existante. Cliquez à droite de Select Treatment Arm pour sélectionner un bras de traitement.
3. Cliquez sur le bouton Ajouter un patient , qui permet d’ajouter un nouveau point de temps pour un groupe entier. Lorsque la fenêtre s’affiche, entrez le numéro d’identification, le prénom et le nom. Sélectionnez Homme ou Femme. Entrez la date de naissance.
4. Cliquez sur le bouton Ajouter un examen pour ajouter les rats individuels. Pour identifier les rats, cliquez sur un examen. Cliquez sur Modifier l’examen. Entrez le numéro d’identification dans la zone Entrer les notes . Cliquez sur le bouton Enregistrer les modifications .
5. Fixez l’objectif approprié à l’appareil (Figure 1B), sélectionnez la configuration correspondante dans le logiciel et réglez la position du bras de référence associée.
   REMARQUE: Le système SD-OCT décrit a des lentilles personnalisées, des modèles de balayage prédéfinis et des réglages de bras de référence spécifiques à l’espèce animale et à la région de l’œil à imager (rétine ou cornée, souris ou rat). Certains de ces détails sont spécifiques au système SD-OCT décrit (voir tableau des matériaux). Par exemple, tous les appareils n’offrent pas un réglage manuel de la longueur du bras de référence .
6. Dans l’onglet Patient/Examen , double-cliquez sur l’examen en surbrillance pour passer à l’onglet Imagerie et commencer l’imagerie ou cliquez simplement sur l’onglet Imagerie . S’il existe une analyse par défaut, cliquez avec le bouton droit de la souris pour la supprimer.
7. Chargez un protocole d’analyse prédéfini en cliquant sur le bouton Sélectionner un protocole dans la liste . Vous pouvez également ajouter des analyses individuelles.
8. Pour les modèles de rats de glaucome et de rétinopathie diabétique et les modèles murins de dégénérescence rétinienne, choisissez un préréglage composé de quatre images: 2 OD et 2 OS. Pour la myopie de souris, choisissez un préréglage composé de 8 images : 4 OD et 4 OS scans.
   REMARQUE: L’imagerie prédéfinie sera expliquée plus en détail dans la section 3. C’est quelque chose que chaque laboratoire fabrique pour lui-même ou avec le fabricant lors de l’installation sur site.

2. Anesthésier l’animal

1. Administrer un anesthésique.
   1. Anesthésier les rats avec de la kétamine (60 mg/kg) et de la xylazine (7,5 mg/kg) par injection intrapéritonéale.
   2. Anesthésier les souris avec de la kétamine (80 mg/kg) et de la xylazine (16 mg/kg) par injection intrapéritonéale.
   3. Attendez que les animaux soient complètement anesthésiés et ne répondent pas au pincement des orteils.
2. Administrer des gouttes de dilatation pupillaire (1% de tropicamide). Attendez que les pupilles se dilatent avant l’imagerie.
   NOTE: La dilatation des pupilles augmente le champ de vision mais n’est pas une exigence. Des gouttes anesthésiques locales (cornéennes) (0,5% de tétracaïne) pour engourdir l’œil doivent également être utilisées si quelque chose touche l’œil (par exemple, si vous appliquez des lentilles cornéennes ou utilisez un guide). Un guide est un dispositif qui est placé sur la tête de numérisation et aide les débutants à aligner l’œil et la tête de numérisation.
3. Après avoir anesthésié le rongeur, placez-le dans un système d’alignement du rongeur qui peut faire pivoter l’animal dans un espace à 3 dimensions (Figure 1A, 1C et 1D). Fournir un support thermique.
   REMARQUE: Actuellement, nous utilisons des systèmes d’alignement de rongeurs pour souris et rats conçus et vendus avec le dispositif SD-OCT.
4. Appliquez du liquide (par exemple, une solution saline ou des larmes artificielles) pour garder les yeux lubrifiés. S’assurer que l’œil ne se dessèche pas pendant l’imagerie afin que les propriétés optiques de l’œil soient maintenues entre les examens (lorsque la cornée est mouillée, la rétine peut être vue clairement).
   1. Assurez-vous de maintenir l’humidité dans l’œil opposé lorsque vous scannez le premier œil afin qu’il ne se dessèche pas.
5. Utilisez une lingette délicate pour évacuer l’excès de solution saline juste avant l’imagerie, car trop ou trop peu de lubrifiant sur l’œil affectera la qualité de l’image.
   REMARQUE: L’utilisation de gel lubrifiant stérile n’est pas recommandée pendant la TCO car elle peut interférer avec l’imagerie. Si nécessaire, un gel lubrifiant stérile peut être utilisé après la procédure. Une lentille de contact peut également être appliquée pour assurer une humidité adéquate sur l’œil tout au long du test. D’après notre expérience, une lentille de contact n’a pas apporté une amélioration marquée de la qualité de l’image, mais les lentilles cornéennes aident à réduire le risque de séchage de la cornée pendant la séance d’imagerie.

3. Imagerie de la TCO chez les rongeurs

1. Commencez par un œil (OS ou OD) et imagez ensuite l’œil controlatéral.
   1. Positionnez l’animal en utilisant les deux mouvements de rotation du système d’alignement des rongeurs, de sorte que le regard soit horizontal et regarde vers le bas l’axe de la lentille OCT (figure 1D).
   2. Utilisez l’OPO en mode Exécution libre pour orienter la rétine pour la collecte de données. Utilisez d’abord le mode Visée (en cliquant sur le bouton Viser ) pour un affichage continu des balayages B horizontaux et verticaux en temps réel.
   3. Rapprochez la tête de balayage de l’œil jusqu’à ce que la rétine soit visible (car les lentilles de la rétine de souris et de rat sont à focale fixe, déplaçant la lentille vers l’œil se concentre plus profondément dans la rétine). Ensuite, utilisez le système d’alignement des rongeurs pour ajuster la position de l’animal vers le haut / bas et pivoter / tordre pour positionner la tête du nerf optique au centre, rendre le balayage horizontal horizontal horizontal et le balayage vertical vertical (Figure 1A).
   4. Ajustez la distance de travail de sorte que l’image rétinienne soit plate et non incurvée.
   5. Ajustez la position du bras de référence pour conserver l’image près du haut de la fenêtre d’affichage. Veillez à ne pas pousser trop loin ou l’image de l’œil retournera sur elle-même.
2. Imagerie rétinienne
   1. Pour les modèles de glaucome, de dégénérescence rétinienne et de rétinopathie diabétique : Définissez un balayage volumique composé de 1000 x 100 x 1 (balayage A x balayage B scans x scans B répétés) pour la moyenne. Chez les rats, effectuez un balayage de volume de 3 x 3 mm. Chez la souris, effectuez un balayage de volume de 1,5 x 1,5 mm.
   2. Centrez le nerf optique dans l’accès horizontal et vertical afin que le balayage de volume soit au centre. Prenez le temps de vous assurer que la tête du nerf optique est au centre de la scintigraphie et droite le long des axes nasal-temporal et supérieur-inférieur (Figure 2). Scannez et recentrez pour vous assurer qu’il est exactement au centre, si nécessaire. Répétez cette analyse si nécessaire jusqu’à ce que la tête du nerf optique soit centrée et alignée le long des deux axes. Cliquez sur le bouton Instantané pour prendre une photo.
      REMARQUE: Certains appareils SD-OCT ont la possibilité de manipuler optiquement la courbure de l’œil (par exemple, l’image est aplatie) en ajustant la distance de l’œil à la source lumineuse avec le bras de référence. Nous recommandons d’aplatir et de centrer les images lors de la prise de mesures directes de l’épaisseur à travers les couches rétiniennes pour améliorer la précision le long de la direction antéro-postérieure.
   3. Cliquez sur le bouton Enregistrer pour enregistrer l’image.
   4. Prenez un balayage radial centré sur la tête du nerf optique qui est de 1000 x 4 x 20 (A-scan x B-scan x B-scans répétés). Utilisez des balayages B répétés pour améliorer la clarté de l’image de l’œil ou de la rétine, ce qui aidera à interpréter les régions de l’œil ou les couches de la rétine pendant l’analyse des données.
      NOTE: Encore une fois, chez les rats, ce balayage radial est de 3 mm, tandis que chez la souris, le balayage radial est de 1,5 mm.
   5. Enregistrez l’image.
   6. Répétez les étapes 3.1 à 3.2.5 dans l’œil controlatéral.
3. Mesures de longueur axiale
   1. Pour les projets qui impliquent l’imagerie de l’œil entier, comme la myopie de souris, prenez trois scans de l’œil entier et un scanner de la rétine pour chaque œil. Choisissez un préréglage qui consiste en un balayage radial de 500 x 20 x 1 et qui englobe tout le diamètre de l’œil.
      REMARQUE: Ce paramètre fournit une image de toute la longueur de l’œil de souris de la cornée à la choroïde.
   2. Centrez le milieu de l’œil et de la rétine dans le champ de vision. Prenez trois balayages radiaux (balayages de l’œil entier): un balayage linéaire B de 1000 x 5 x 2 et deux scans B linéaires supplémentaires de 1000 x 5 x 2 au même endroit. Enregistrez les images.
   3. Ensuite, si vous le souhaitez, zoomez et effectuez un balayage de volume ou rectangulaire (balayage de la rétine) similaire à la description en 3.2 qui consiste en des scans 1000 x 20 A x B scans. Enregistrez l’analyse du volume.
   4. Répétez les étapes 3.3 à 3.3.3 dans l’œil controlatéral.
      REMARQUE: Les mesures de longueur axiale ne sont possibles que sur de petits yeux (souris ou plus petits) car la fenêtre d’imagerie des systèmes actuels n’est pas assez grande pour capturer un œil plus grand.

4. Étapes post-imagerie

1. Stockez les données sauvegardées sur un cloud, ce qui est une bonne pratique pour la gestion des données et permet un accès facile pour une analyse ultérieure. Effectuer l’analyse de données avec un logiciel personnalisé développé dans un programme de modélisation mathématique (Table of Materials).
2. Retirer le rongeur du système d’alignement des rongeurs et administrer une injection intrapéritonéale d’atipamézole (1 mg/kg pour les rats et les souris) pour inverser les effets de la xylazine, afin que le rongeur se réveille plus rapidement.
3. Laissez les rongeurs récupérer sur un coussin chauffant à feu doux. Donnez des gouttes salines supplémentaires au besoin. Retournez les rongeurs dans leur cage d’origine lorsqu’ils ont retrouvé leur pleine marche.
4. Fermez le programme et désactivez l’OPO.

5. Post-traitement des images de l’OCT

1. Traiter les images à l’aide d’un logiciel personnalisé développé dans un programme de modélisation mathématique pour répondre à des besoins spécifiques de l’OCT (par exemple, mesurer l’épaisseur des zones d’intérêt en marquant manuellement les images).
2. Selon le but de l’image (rétine de souris, rétine de rat ou myopie/longueur axiale), utilisez l’un des trois programmes suivants :
   1. Pour traiter la rétine, sélectionnez les scans de l’OCO à charger. Tout d’abord, définissez le centre de la tête du nerf optique d’un simple clic.
   2. Regardez comment le programme génère des lignes verticales définissant les distances de chaque côté de la tête du nerf optique. Notons que dans la rétine du rat, ces lignes sont à 0,5 mm et 1,2 mm du centre de la tête du nerf optique, pour un total de 4 lignes verticales représentant les axes nasal-temporal et inférieur-supérieur de l’œil en fonction du scanner radial B actuellement analysé.
      REMARQUE: Dans la rétine de la souris, ces lignes verticales sont à 0,25 mm et 0,5 mm du centre de la tête du nerf optique.
   3. Délimitez les couches suivantes le long de chaque ligne :
      La couche de fibres nerveuses rétiniennes (RNFL), la couche plexiforme interne (IPL), la couche nucléaire interne (INL), la couche plexiforme externe (OPL), la couche nucléaire externe (ONL), la membrane limitante externe (ELM), les segments internes / segments externes (IS / OS), l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) et l’épaisseur totale de la rétine.
      REMARQUE: Le balayage radial n’a généralement pas d’étiquettes nasales / temporales et supérieures / inférieures lorsqu’il est ouvert. Les scans peuvent être créés de telle sorte qu’ils ont une orientation n/t et s/i, et ces scans en particulier sont analysés ultérieurement.
   4. Une fois qu’une image a été délimitée et que le programme a été fermé, exportez ces mesures dans un tableur pour l’analyse des données.
3. Utilisez ces valeurs de longueur et d’épaisseur de l’étape 5 pour faire des comparaisons entre les groupes, par exemple, déterminer s’il existe des différences régionales (n/t/s/i) ou des changements longitudinaux.
4. Pour les mesures rétiniennes, déterminez d’abord s’il existe des différences dans l’axe nasal-temporal et inférieur-supérieur aux distances de 0,5 mm et 1,2 mm.
   NOTE: Si les différences entre les quadrants ne sont pas observées, les mesures de 0,5 mm et de 1,2 mm peuvent être moyennées ensemble. Il s’agit d’une approche similaire pour les scintigraphies rétiniennes de souris seulement à 0,25 mm et 0,5 mm.
5. Pour les études de myopie, utilisez ce programme pour évaluer les paramètres oculaires le long de l’axe optique de l’œil. Ouvrez le programme de modélisation mathématique. Tout d’abord, sélectionnez une image à charger.
   1. Après avoir chargé l’image, marquez manuellement chaque numérisation (radiales et B). Marquez les bords antérieur et postérieur de la cornée, du cristallin, de la chambre vitrée et de la rétine, de sorte que le programme calcule l’épaisseur de la cornée, l’épaisseur du cristallin, la profondeur de la chambre antérieure et vitrée, l’épaisseur totale de la rétine, la longueur axiale totale.
   2. Après le marquage, quittez le programme qui invite un menu d’enregistrement. Enregistrez les valeurs délimitées dans un tableur et faites la moyenne des trois numérisations distinctes ensemble.

Résultats

Le SD-OCT est considéré comme un succès si des images de haute qualité sont obtenues de manière à ce que les dimensions oculaires puissent être mesurées de manière fiable. Ici, une variété d’utilisations de SD-OCT sont illustrées à l’aide de modèles de dégénérescence rétinienne, de glaucome, de rétinopathie diabétique et de myopie.

Dans un modèle de dégénérescence rétinienne induite par la lumière (LIRD), l’exposition à une lumière vive (10 000 lux) induit une...

Discussion

L’imagerie à haute résolution des structures oculaires in vivo permet d’évaluer les changements rétiniens et oculaires au fil du temps. Dans ce protocole, il a été démontré que le SD-OCT capturait les différences dans les structures oculaires in vivo dans des modèles de dégénérescence rétinienne, de glaucome, de rétinopathie diabétique et de myopie.

L’aspect le plus critique lors de l’exécution de SD-OCT est d’obtenir une image claire de la rétine ou d’une autre s...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% tropicamide	Sandoz	Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59
0.5% tetracaine	Alcon	NDC 0065-0741-12
AIM-RAS G3 120 V	Leica Bioptigen	90-AIMRAS-G3-120	Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice
Celluvisc gel	REFRESH CELLUVISC	#4554; NDC-0023-4554-30
G3 18 mm Telecentric Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-18
G3 Mouse Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-M
G3 Rat Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-R
heating pad	Fabrication	11-1130
InVivoVue software	Leica Bioptigen		Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system
MATLAB	Mathworks		mathematical modeling program
Mouse/Rat Kit	Leica Bioptigen	90-KIT-M/R	Mouse/rat rodent alignment system
saline	ADDIPAK	200-39
System Envisu R4300 VHR 120 V	Leica Bioptigen	90-R4300-V1-120	SD-OCT system