광학 간섭 단층 촬영을 사용한 설치류 모델에서 안구 질환의 생체 내 구조 평가

요약

여기에서는 망막 변성, 녹내장, 당뇨병 성 망막증 및 근시 모델에서 생체 내 망막 및 안구 구조를 시각화하기 위해 스펙트럼 도메인 광학 간섭 단층 촬영 (SD-OCT)을 사용하는 방법을 설명합니다.

초록

스펙트럼 영역 광학 간섭 단층 촬영 (SD-OCT)은 생체 내에서 망막 및 안구 구조를 시각화하는 데 유용합니다. 연구에서 SD-OCT는 다양한 망막 및 안구 질환 및 손상 모델의 변화를 평가하고 특성화하는 데 유용한 도구입니다. 광 유도 망막 변성 모델에서 SD-OCT는 시간 경과에 따른 광수용체 층의 얇아짐을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 녹내장 모델에서 SD-OCT는 감소된 망막 신경 섬유층과 총 망막 두께를 모니터링하고 안구 고혈압을 유도한 후 시신경 부항을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 당뇨병 설치류에서 SD-OCT는 연구자들이 총 망막 두께 감소와 특정 망막 층, 특히 질병 진행에 따른 망막 신경 섬유층의 두께 감소를 관찰하는 데 도움이 되었습니다. 근시의 마우스 모델에서 SD-OCT는 축 방향 길이 변화와 같은 축 방향 매개 변수를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. SD-OCT의 장점에는 안구 구조의 생체 내 이미징, 시간 경과에 따른 안구 치수의 변화를 정량적으로 추적하는 기능, 빠른 스캔 속도 및 고해상도가 포함됩니다. 여기에서는 SD-OCT의 방법을 자세히 설명하고 망막 변성, 녹내장, 당뇨병 성 망막증 및 근시 모델에서 실험실에서 사용 된 예를 보여줍니다. 방법에는 마취, SD-OCT 이미징 및 두께 측정을 위한 이미지 처리가 포함됩니다.

서문

스펙트럼 영역 광학 간섭 단층 촬영(SD-OCT)은 임상의와 연구자가 안구 구조를 비침습적으로 검사할 수 있는 정밀한 고해상도 이미징 방식입니다. 이 이미징 기술은 간섭계를 기반으로 하여 마이크로미터 규모의 생체 내 3차원 망막 이미지를 캡처합니다.^1,2. 망막층 및 망막하 액의 구조적 결함 및/또는 얇아짐과 같은 병리학적 특징의 쉬운 감지 및 정확성으로 인해 시력 연구 및 클리닉에서 가장 자주 사용되는 영상 양식^중 하나가 되었습니다3. 시각 관련 장애의 동물 모델을 사용한 연구에서 SD-OCT는 구조와 기능 간의 관계와 조직 병리학 적 기원에 대한 필수적인 비 침습적 분석을 제공했습니다⁴. 해상도 (눈의 깊이에 따라 최대 2-3 미크론⁵)로 인해 SD-OCT는 망막 층 두께의 작은 변화도 감지 할 수 있습니다. 이러한 유형의 분석은 질병 진행에 필수적인 정보를 제공하고 시력 관련 장애에 대한 신경 보호 방법 및 치료의 효능을 평가할 수 있습니다.

SD-OCT는 조직 학적으로 구조를 검사하는 비 침습적 대안이며, 둘은 상관 관계가있는 것으로 나타났습니다⁶. SD-OCT는 세포 분해능에 도달하지 않지만 동물에 대한 종단 연구를 허용합니다. 이는 특정 시점에서 동물을 안락사시키는 것과는 대조적으로 시간이 지남에 따라 개별 동물에서 질병 진행을 추적 할 수 있기 때문에 유리합니다. 이미징 기술이 계속 향상됨에 따라 SD-OCT 기술도 발전하여 향상된 이미지 품질과 망막 혈관 기능과 같은 생물학적 과정을 세부적으로 평가할 수 있는 기능을 제공할 것입니다. 1991년 등장 이래에도 SD-OCT 기술은 해상도, 속도 및 감도⁷에서 엄청난 발전을 이루었습니다.

본 연구는 SD-OCT 시스템을 활용하여 망막 변성, 녹내장 및 당뇨병 성 망막증의 설치류 모델에서 망막 층의 변화를 정량화합니다. 여기에 사용된 SD-OCT 시스템은 저전력, 근적외선을 활용하여 깊이 해상도 이미지를 실시간으로 획득, 처리 및 저장하는 푸리에 영역 OCT 시스템입니다. SD-OCT 시스템은 800nm 파장 대역에서 확장된 깊이 이미징 기능을 제공하여 8mm 깊이 및 4μm 해상도를 제공합니다. 푸리에 도메인 검출에서, 조직으로부터의 산란광과 기준 경로 사이의 간섭 신호는 산란 강도⁸의 축 방향 스캔 및 / 또는 축 방향 깊이 프로파일을 구성하기 위해 푸리에 변환된다. 여기의 연구를 위해 OCT 빔은 축 방향 스캔을 연속적으로 획득하면서 원하는 망막 구조 위로 스캔됩니다. 일반적으로 스캔 패턴은 래스터 스캔 패턴을 사용하여 2D 단면 이미지에 해당하는 선형 1차원 스캔 라인(A-스캔)의 모음으로 2차원 그리드(B-스캔)를 획득합니다. 마우스의 근시에 초점을 맞춘 연구의 경우이 시스템은 안구 구조의 차원 (예 : 각막 두께, 렌즈 두께, 유리체 챔버 깊이 및 축 길이)을 측정하는 데에도 사용됩니다.

현재 시스템을 통해 사용자는 자신의 프로토콜을 설계하여 관심 있는 안구 구조에 따라 맞춤화하고 선택할 수 있는 스캔을 생성할 수 있습니다. 이러한 사용자 정의 프로토콜에 포함된 주요 스캔은 이 이미징 기술을 사용자 친화적으로 만듭니다. 이미지 분석을 위해 우리는 수학적 모델링 프로그램에서 맞춤형 프로그래밍을 개발했습니다. SD-OCT는 안구 구조의 병리학적 변화를 비침습적으로 식별 및 정량화하고 시력 관련 질병 진행을 모니터링하는 강력한 도구입니다.

프로토콜

설명 된 모든 절차는 애틀랜타 재향 군인 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드 (NIH 간행물, 8^판 , 2011 년 업데이트)를 준수했습니다.

참고: 아래 프로토콜을 개발하는 데 사용되는 SD-OCT 시스템은 재료 표에 설명되어 있습니다. 일부 절차는 이 특정 시스템과 관련이 있지만 전체 접근 방식은 다른 OCT 장치 및 동물 모델에 맞게 조정할 수 있습니다. 또한, 우리 실험실에서 이러한 프로토콜은 생쥐와 쥐에서 일반적으로 사용됩니다. 그러나 전반적인 접근 방식은 개인이 장치에 올바른 렌즈와 기능을 가지고 있는 경우 다양한 동물 모델 및 SD-OCT 장치에 채택될 수 있습니다.

1. 광학 간섭 단층 촬영 장비 설정

1. SD-OCT 소프트웨어(재료 표)를 엽니다.
2. OCT, 연구 및 치료 부문을 복용하는 사람(해당되는 경우)을 정의합니다. 연구원이 나중에 데이터 분석 중에 원하는 스캔을 검색하는 데 도움이 되는 방식으로 이러한 범주의 이름을 지정합니다.
   1. 환자/시험 탭에서 시험 시험관을 클릭합니다. 심사관의 이름을 선택합니다. Setup Examiners & Physicians 버튼을 사용하여 새 심사관을 추가합니다.
   2. 스터디 이름을 클릭하여 스터디를 정의합니다. 스터디 탭을 클릭하여 새 스터디를 추가하거나 기존 스터디에서 처리를 수정합니다. 치료대 선택의 오른쪽을 클릭하여 치료대를 선택합니다.
3. 전체 그룹에 대한 새 시점을 추가하는 데 사용되는 환자 추가 버튼을 클릭합니다. 창이 나타나면 ID 번호, 이름 및 성을 입력합니다. 남성 또는 여성을 선택합니다. 생년월일을 입력합니다.
4. 시험 추가 버튼을 클릭하여 개별 쥐를 추가합니다. 쥐를 식별하려면 시험을 클릭하십시오. 시험 편집을 클릭합니다. 메모 입력 상자에 ID 번호를 입력합니다. 변경 내용 저장 버튼을 클릭합니다.
5. 장치에 적절한 렌즈를 부착하고(그림 1B), 소프트웨어에서 해당 구성을 선택하고, 관련 기준 암 위치에서 다이얼합니다.
   참고: 설명된 SD-OCT 시스템에는 맞춤형 렌즈, 사전 설정 스캔 패턴 및 이미징되는 동물 종 및 눈 영역(망막 또는 각막, 마우스 또는 쥐)에 특정한 참조 암 설정이 있습니다. 이러한 세부 사항 중 일부는 설명된 SD-OCT 시스템에만 해당됩니다(자료 표 참조). 예를 들어, 모든 장치가 기준 암 경로 길이를 수동으로 조정할 수 있는 것은 아닙니다.
6. 환자/검사 탭에서 강조 표시된 검사를 두 번 클릭하여 이미징 탭으로 이동하여 이미징을 시작하거나 이미징 탭을 클릭합니다. 기본 스캔이 있는 경우 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 삭제합니다.
7. 목록에서 프로토콜 선택 버튼을 클릭하여 사전 설정된 스캔 프로토콜을 로드합니다. 또는 개별 검사를 추가합니다.
8. 녹내장 및 당뇨병 성 망막증의 쥐 모델과 망막 변성의 마우스 모델의 경우 4 개의 이미지 (2 개의 OD 및 2 개의 OS 스캔)로 구성된 사전 설정을 선택하십시오. 마우스 근시의 경우 8개의 이미지(4개의 OD 및 4개의 OS 스캔)로 구성된 사전 설정을 선택합니다.
   참고: 사전 설정된 이미징은 섹션 3에서 자세히 설명합니다. 이것은 각 실험실이 현장 설치 중에 스스로 또는 제조업체와 함께 만드는 것입니다.

2. 동물을 마취

1. 마취제를 투여하십시오.
   1. 복강 주사를 통해 케타민 (60 mg / kg)과 자일 라진 (7.5 mg / kg)으로 쥐를 마취하십시오.
   2. 복강 주사를 통해 케타민 (80 mg / kg)과 자일 라진 (16 mg / kg)으로 마우스를 마취하십시오.
   3. 동물이 완전히 마취 될 때까지 기다렸다가 발가락 꼬집음에 반응하지 마십시오.
2. 동공 확장 방울 (1 % 트로피 아미드)을 투여하십시오. 이미징하기 전에 동공이 확장될 때까지 기다리십시오.
   참고: 동공의 확장은 시야를 증가시키지만 필수 사항은 아닙니다. 눈을 마비시키는 국소 (각막) 마취제 (0.5 % 테트라 카인)는 눈에 닿을 경우 (예 : 콘택트 렌즈를 적용하거나 가이드를 사용하는 경우) 사용해야합니다. 가이드는 스캔 헤드 위에 배치되는 장치로 초보자가 눈과 스캔 헤드를 정렬하는 데 도움이 됩니다.
3. 설치류를 마취 한 후 설치류를 3 차원 공간에서 동물을 회전 할 수있는 설치류 정렬 시스템에 놓습니다 (그림 1A, 1C 및 1D). 열 지원을 제공하십시오.
   참고 : 현재 우리는 SD-OCT 장치로 설계 및 판매되는 생쥐와 쥐를위한 설치류 정렬 시스템을 사용합니다.
4. 액체(예: 식염수 또는 인공 눈물)를 바르고 눈에 윤활유를 바르십시오. 스캔 사이에 눈의 광학적 특성이 유지되도록 이미징 중에 눈이 건조하지 않도록 합니다(각막이 젖었을 때 망막이 명확하게 보일 수 있음).
   1. 첫 번째 눈을 스캔할 때 반대쪽 눈이 건조해지지 않도록 습기를 유지하십시오.
5. 눈에 윤활유가 너무 많거나 너무 적으면 이미지 품질에 영향을 미치므로 이미징 직전에 섬세한 작업 물티슈를 사용하여 과도한 식염수를 제거하십시오.
   알림: 멸균 윤활제 젤의 사용은 이미징을 방해할 수 있으므로 OCT 동안 사용하지 않는 것이 좋습니다. 필요한 경우 절차 후에 멸균 윤활제 젤을 사용할 수 있습니다. 콘택트 렌즈를 적용하여 테스트 내내 눈에 적절한 수분을 공급할 수도 있습니다. 우리의 경험에서, 콘택트 렌즈는 이미지 품질에 현저한 개선을 제공하지 않았지만 콘택트 렌즈는 이미징 세션 동안 각막 건조의 위험을 줄이는 데 도움이됩니다.

3. 설치류 OCT 영상

1. 한쪽 눈(OS 또는 OD)으로 시작하고 반대쪽 눈을 이미지화합니다.
   1. 설치류 정렬 시스템의 두 회전 동작을 사용하여 시선이 수평이 되고 OCT 렌즈의 축을 내려다보도록 동물을 배치합니다(그림 1D).
   2. 자유 실행 모드에서 OCT를 사용하여 데이터 수집을 위해 망막의 방향을 지정합니다. 처음에는 조준 모드(조준 버튼 클릭)를 사용하여 수평 및 수직 B-스캔을 실시간으로 연속적으로 표시합니다.
   3. 망막이 보일 때까지 스캔 헤드를 눈에 더 가깝게 이동합니다(마우스와 쥐 망막 렌즈는 고정 초점이므로 렌즈를 눈 쪽으로 이동하면 망막 깊숙이 초점을 맞춥니다). 그런 다음 설치류 정렬 시스템을 사용하여 동물의 위치를 위/아래로 조정하고 회전/비틀어 시신경 헤드를 중앙에 배치하고 수평 스캔을 수평으로 만들고 수직 스캔을 수직으로 만듭니다(그림 1A).
   4. 망막 이미지가 평평하고 구부러지지 않도록 작동 거리를 조정하십시오.
   5. 참조 암 위치를 조정하여 이미지가 디스플레이 창 상단 근처에 유지되도록 합니다. 너무 멀리 밀어 넣지 않으면 눈 이미지가 저절로 뒤집히지 않도록 주의하십시오.
2. 망막 영상
   1. 녹내장, 망막 변성 및 당뇨병성 망막증 모델의 경우: 평균화를 위해 1000 x 1000 x 1(A 스캔 x B 스캔 x 반복 B 스캔)로 구성된 볼륨 스캔을 정의합니다. 쥐의 경우 3 x 3 mm의 볼륨 스캔을하십시오. 마우스에서 1.5 x 1.5mm 볼륨 스캔을 수행합니다.
   2. 시신경을 수평 및 수직 접근의 중앙에 배치하여 볼륨 스캔이 중앙에 오도록 합니다. 시간을 내어 시신경 헤드가 스캔의 중심에 있고 비강-측두엽 및 상하축을 따라 직선인지 확인합니다(그림 2). 필요한 경우 스캔하고 다시 중앙에 배치하여 정확히 중앙에 있는지 확인합니다. 시신경 헤드가 중앙에 있고 두 축을 따라 정렬될 때까지 필요에 따라 이 스캔을 반복합니다. 스냅샷 버튼을 클릭하여 사진을 찍습니다.
      참고: 일부 SD-OCT 장치에는 기준 암으로 광원에서 눈의 거리를 조정하여 눈의 곡률을 광학적으로 조작(예: 이미지가 병합됨)할 수 있는 옵션이 있습니다. 망막층을 통해 직접 두께를 측정할 때 이미지를 평평하게 하고 중앙에 배치하여 전후방 방향을 따라 정확도를 높이는 것이 좋습니다.
   3. 저장 버튼을 클릭하여 이미지를 저장합니다.
   4. 시신경두를 중심으로 1000 x 4 x 20의 방사형 스캔을 수행합니다(A-스캔 x B-스캔 x 반복 B-스캔). 반복적인 B 스캔을 사용하여 눈이나 망막의 이미지 선명도를 향상시켜 데이터 분석 중에 눈 영역 또는 망막 층을 해석하는 데 도움이 됩니다.
      참고: 다시 말하지만, 쥐의 경우 이 방사형 스캔은 3mm이고 생쥐의 경우 방사형 스캔은 1.5mm입니다.
   5. 이미지를 저장합니다.
   6. 반대쪽 눈에서 3.1-3.2.5단계를 반복합니다.
3. 축 길이 측정
   1. 쥐 근시와 같이 눈 전체를 영상화하는 프로젝트의 경우 눈 전체를 세 번 스캔하고 각 눈에 대해 한 번의 망막 스캔을 수행합니다. 500 x 20 x 1이고 눈의 전체 직경을 포함하는 방사형 스캔으로 구성된 사전 설정을 선택합니다.
      참고: 이 설정은 각막에서 맥락막까지 마우스 눈의 전체 길이의 이미지를 제공합니다.
   2. 시야에서 눈과 망막의 중앙을 중앙에 놓습니다. 방사형 스캔(전체 눈 스캔): 1000 x 5 x 2인 선형 B 스캔과 동일한 위치에서 1000 x 5 x 2의 추가 선형 B 스캔 2개를 수행합니다. 이미지를 저장합니다.
   3. 그런 다음 원하는 경우 확대하여 1000 x 20A 스캔 x B 스캔으로 구성된 3.2의 설명과 유사한 볼륨 또는 직사각형 스캔(망막 스캔)을 수행합니다. 볼륨 스캔을 저장합니다.
   4. 반대쪽 눈에서 3.3-3.3단계를 반복합니다.
      참고: 축 방향 길이 측정은 현재 시스템의 이미징 창이 더 큰 눈을 캡처할 만큼 충분히 크지 않기 때문에 작은 눈(마우스 또는 더 작은)에서만 가능합니다.

4. 이미징 후 단계

1. 저장된 데이터를 클라우드에 저장하는 것은 데이터 관리에 좋은 방법이며 나중에 분석하기 위해 쉽게 액세스할 수 있도록 합니다. 수학적 모델링 프로그램(재료 표)에서 개발된 맞춤형 소프트웨어로 데이터 분석을 수행합니다.
2. 설치류 정렬 시스템에서 설치류를 제거하고 자일라진의 효과를 역전시키기 위해 아티파메졸(쥐와 생쥐의 경우 1mg/kg)을 복강 주사하여 설치류가 더 빨리 깨어나도록 합니다.
3. 설치류가 저온의 가열 패드에서 회복되도록하십시오. 필요에 따라 식염수를 추가로 투여하십시오. 설치류가 완전히 회복되면 집 케이지로 되돌립니다.
4. 프로그램을 닫고 OCT를 끕니다.

5. OCT 이미지의 후처리

1. 특정 OCT 요구 사항에 맞게 수학적 모델링 프로그램에서 개발된 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다(예: 이미지를 수동으로 표시하여 관심 영역의 두께 측정).
2. 이미지의 목적(마우스 망막, 쥐 망막 또는 근시/축 길이)에 따라 다음 세 가지 프로그램 중 하나를 사용합니다.
   1. 망막을 처리하려면 로드할 OCT 스캔을 선택합니다. 먼저 간단한 클릭으로 시신경 헤드의 중심을 정의하십시오.
   2. 프로그램이 시신경 머리의 양쪽에서 거리를 정의하는 수직선을 생성하는 것을 지켜보십시오. 쥐 망막에서이 선은 시신경 머리의 중심에서 0.5mm 및 1.2mm 떨어져 있으며, 현재 분석 된 방사형 B 스캔에 따라 눈의 비강 측두엽 및 하부 상축을 나타내는 총 4 개의 수직선이 있습니다.
      참고: 마우스 망막에서 이 수직선은 시신경 머리 중심에서 0.25mm 및 0.5mm에 있습니다.
   3. 각 선을 따라 다음 레이어를 묘사합니다.
      망막 신경 섬유층 (RNFL), 내부 플렉시 폼 층 (IPL), 내부 핵 층 (INL), 외부 플렉시 폼 층 (OPL), 외부 핵 층 (ONL), 외부 제한막 (ELM), 내부 세그먼트 / 외부 세그먼트 (IS / OS), 망막 색소 상피 (RPE) 및 총 망막 두께.
      참고: 방사형 스캔은 일반적으로 열릴 때 비강/측두 및 상급/하부 레이블이 없습니다. 스캔들은 n/t 및 s/I 배향을 갖도록 생성될 수 있고, 특히 이들 스캔들은 나중에 분석된다.
   4. 이미지가 묘사되고 프로그램이 닫힌 후 데이터 분석을 위해 이러한 측정값을 스프레드시트 소프트웨어로 내보냅니다.
3. 5단계의 길이 및 두께 값을 사용하여 그룹 간에 비교(예: 지역차(n/t/s/i) 또는 종단 변경이 있는지 확인)합니다.
4. 망막 측정의 경우 먼저 0.5mm 및 1.2mm 거리에서 비강-측두엽 및 하부-상축에 차이가 있는지 확인합니다.
   참고: 사분면의 차이가 관찰되지 않으면 0.5mm 및 1.2mm 측정값을 함께 평균화할 수 있습니다. 이것은 0.25mm 및 0.5mm에서만 마우스 망막 스캔에 대한 유사한 접근 방식입니다.
5. 근시 연구의 경우이 프로그램을 사용하여 눈의 광축을 따라 안구 매개 변수를 평가하십시오. 수학적 모델링 프로그램을 엽니다. 먼저 로드할 이미지를 선택합니다.
   1. 이미지를 로드한 후 각 스캔(방사형 및 B 스캔)을 수동으로 표시합니다. 각막, 렌즈, 유리체 및 망막의 전방 및 후방 가장자리를 표시하여 프로그램이 각막 두께, 렌즈 두께, 전방 및 유리체 챔버 깊이, 총 망막 두께, 총 축 길이를 계산하도록합니다.
   2. 마킹 후 저장 메뉴를 표시하는 프로그램을 종료합니다. 묘사된 값을 스프레드시트 소프트웨어에 저장하고 세 개의 개별 스캔을 함께 평균화합니다.

결과

SD-OCT는 안구 치수를 안정적으로 측정 할 수 있도록 고품질 이미지를 얻으면 성공한 것으로 간주됩니다. 여기에서는 망막 변성, 녹내장, 당뇨병 성 망막증 및 근시 모델을 사용하여 SD-OCT의 다양한 용도를 설명합니다.

광-유도성 망막 변성 (LIRD) 모델에서, 밝은 빛(10,000 lux)에의 노출은 망막에서 광수용체 세포의 퇴행을 유도한다⁹. 대표적인 SD-OCT 이미지는 손상?...

토론

생체 내 안구 구조의 고해상도 이미징을 통해 시간 경과에 따른 망막 및 안구 변화를 평가할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 SD-OCT는 망막 변성, 녹내장, 당뇨병 성 망막증 및 근시 모델에서 생체 내 안구 구조의 차이를 포착하는 것으로 입증되었습니다.

SD-OCT를 수행할 때 가장 중요한 측면은 망막 또는 기타 관심 있는 안구 구조의 선명한 이미지를 얻는 것입니다. 망막이 완벽하...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% tropicamide	Sandoz	Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59
0.5% tetracaine	Alcon	NDC 0065-0741-12
AIM-RAS G3 120 V	Leica Bioptigen	90-AIMRAS-G3-120	Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice
Celluvisc gel	REFRESH CELLUVISC	#4554; NDC-0023-4554-30
G3 18 mm Telecentric Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-18
G3 Mouse Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-M
G3 Rat Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-R
heating pad	Fabrication	11-1130
InVivoVue software	Leica Bioptigen		Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system
MATLAB	Mathworks		mathematical modeling program
Mouse/Rat Kit	Leica Bioptigen	90-KIT-M/R	Mouse/rat rodent alignment system
saline	ADDIPAK	200-39
System Envisu R4300 VHR 120 V	Leica Bioptigen	90-R4300-V1-120	SD-OCT system