Avaliações estruturais in vivo de doenças oculares em modelos de roedores utilizando tomografia de coerência óptica

Resumo

Aqui, descrevemos o uso da tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) para visualizar estruturas retinianas e oculares in vivo em modelos de degeneração da retina, glaucoma, retinopatia diabética e miopia.

Resumo

A tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) é útil para visualizar estruturas retinianas e oculares in vivo. Em pesquisa, o SD-OCT é uma ferramenta valiosa para avaliar e caracterizar alterações em uma variedade de modelos de doenças e lesões retinianas e oculares. Em modelos de degeneração retiniana induzida pela luz, o SD-OCT pode ser usado para rastrear o afinamento da camada fotorreceptora ao longo do tempo. Em modelos de glaucoma, o SD-OCT pode ser usado para monitorar a diminuição da camada de fibras nervosas da retina e da espessura total da retina e para observar a ventosa do nervo óptico após a indução da hipertensão ocular. Em roedores diabéticos, o SD-OCT ajudou os pesquisadores a observar a diminuição da espessura total da retina, bem como a diminuição da espessura de camadas específicas da retina, particularmente a camada de fibras nervosas da retina com a progressão da doença. Em modelos de miopia em camundongos, o SD-OCT pode ser usado para avaliar parâmetros axiais, como alterações de comprimento axial. As vantagens do SD-OCT incluem imagens in vivo de estruturas oculares, a capacidade de rastrear quantitativamente as mudanças nas dimensões oculares ao longo do tempo e sua rápida velocidade de varredura e alta resolução. Aqui, detalhamos os métodos do SD-OCT e mostramos exemplos de seu uso em nosso laboratório em modelos de degeneração da retina, glaucoma, retinopatia diabética e miopia. Os métodos incluem anestesia, imagens SD-OCT e processamento das imagens para medições de espessura.

Introdução

A tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) é uma modalidade de imagem precisa e de alta resolução que permite que clínicos e pesquisadores examinem estruturas oculares de forma não invasiva. Essa técnica de imagem baseia-se na interferometria para capturar imagens tridimensionais da retina in vivo em escala microscópica ^1,2. Tornou-se uma das modalidades de imagem mais utilizadas na pesquisa da visão e na clínica, devido à fácil detecção e precisão de características patológicas, como defeitos estruturais e/ou afinamento das camadas retinianas e do líquido sub-retiniano³. Em pesquisas utilizando modelos animais de distúrbios relacionados à visão, a SD-OCT forneceu análises não invasivas essenciais das relações entre estrutura e função e suas origens histopatológicas⁴. Devido à sua resolução (até 2-3 mícrons, dependendo da profundidade no olho⁵), o SD-OCT tem a capacidade de detectar até mesmo pequenas alterações na espessura da camada da retina. Esse tipo de análise pode fornecer informações essenciais para a progressão da doença e avaliar a eficácia de métodos e tratamentos neuroprotetores para distúrbios relacionados à visão.

O DS-OCT é uma alternativa não invasiva ao exame histológico da estrutura, e os dois demonstraram estar correlacionados⁶. Embora o SD-OCT não atinja a resolução celular, ele permite estudos longitudinais em animais. Isso é vantajoso porque a progressão da doença pode ser rastreada em animais individuais ao longo do tempo, em vez de ter que sacrificar animais em pontos de tempo específicos. À medida que as técnicas de imagem continuam a melhorar, a tecnologia SD-OCT também progredirá, proporcionando melhor qualidade de imagem, bem como a capacidade de avaliar processos biológicos, como a função dos vasos sanguíneos da retina, em detalhes. Mesmo desde o seu advento em 1991, a tecnologia SD-OCT tem visto enormes avanços em resolução, velocidade e sensibilidade⁷.

O presente estudo utiliza um sistema SD-OCT para quantificar alterações nas camadas da retina em modelos de roedores de degeneração da retina, glaucoma e retinopatia diabética. O sistema SD-OCT usado aqui é um sistema OCT de domínio Fourier que utiliza luz infravermelha próxima de baixa potência para adquirir, processar e armazenar imagens resolvidas em profundidade em tempo real. O sistema SD-OCT tem capacidade de imagem de profundidade estendida na faixa de comprimento de onda de 800 nm, fornecendo 8 mm de profundidade e resolução de 4 μm. Na detecção do domínio de Fourier, o sinal de interferência entre a luz dispersa do tecido e um caminho de referência é transformado de Fourier para construir varreduras axiais e/ou perfis de profundidade axial de intensidade dispersa⁸. Para os estudos aqui, o feixe OCT é escaneado sobre a estrutura da retina desejada enquanto adquire varreduras axiais em série. Normalmente, um padrão de varredura adquire a grade bidimensional (B-Scans) como uma coleção de linhas de varredura unidimensionais lineares (A-Scans), que correspondem a imagens transversais 2D usando um padrão de varredura raster. Para estudos focados na miopia em camundongos, esse sistema também é usado para medir as dimensões das estruturas oculares (por exemplo, espessura da córnea, espessura da lente, profundidade da câmara vítrea e comprimento axial).

O sistema atual permite que os usuários projetem seus próprios protocolos, criando varreduras que podem ser adaptadas e selecionadas com base nas estruturas oculares de interesse. As principais varreduras apresentadas nesses protocolos definidos pelo usuário tornam essa técnica de imagem fácil de usar. Para análises de imagens, desenvolvemos programação personalizada em um programa de modelagem matemática. O SD-OCT é uma ferramenta poderosa para identificar e quantificar de forma não invasiva as alterações patomorfológicas nas estruturas oculares e monitorar a progressão da doença relacionada à visão.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais de Atlanta Veterans Affairs e em conformidade com o guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório (NIH Publications,^8ª edição, atualizada em 2011).

NOTA: O sistema SD-OCT usado para desenvolver o protocolo abaixo é descrito na Tabela de Materiais. Embora alguns dos procedimentos sejam específicos para este sistema específico, a abordagem global pode ser adaptada para outros dispositivos PTU e modelos animais. Além disso, em nosso laboratório, esses protocolos são comumente usados em camundongos e ratos; no entanto, a abordagem geral pode ser adotada para diferentes modelos animais e dispositivos SD-OCT, desde que um indivíduo tenha a lente e os recursos corretos em seu dispositivo.

1. Configurar o equipamento de tomografia de coerência óptica

1. Abra o software SD-OCT (Tabela de Materiais).
2. Defina quem está tomando a OCT, o estudo e o braço de tratamento (se relevante). Nomeie essas categorias de uma maneira que ajude os pesquisadores a procurar as varreduras desejadas mais tarde durante a análise dos dados.
   1. Na guia Paciente/Exame , clique em Examinador de Teste. Selecione o nome do examinador. Use o botão Configurar examinadores e médicos para adicionar novos examinadores.
   2. Clique em Nome do estudo para definir o estudo. Clique na guia Estudo para adicionar um novo estudo ou modificar tratamentos em um estudo existente. Clique à direita de Selecionar braço de tratamento para selecionar um braço de tratamento.
3. Clique no botão Adicionar paciente , que é usado para adicionar um novo ponto de tempo para um grupo inteiro. Quando a janela for exibida, insira Número de identificação, Nome e Sobrenome. Selecione Masculino ou Feminino. Insira a Data de Nascimento.
4. Clique no botão Adicionar exame para adicionar os ratos individuais. Para identificar os ratos, clique em um exame. Clique em Editar Exame. Insira o número de ID na caixa Inserir anotações . Clique no botão Salvar alterações .
5. Conecte a lente adequada ao dispositivo (Figura 1B), selecione a configuração correspondente no software e disque na posição do braço de referência associada.
   NOTA: O sistema SD-OCT descrito possui lentes personalizadas, padrões de varredura predefinidos e configurações de braço de referência específicas para a espécie animal e a região do olho que está sendo fotografada (retina ou córnea, rato ou rato). Alguns desses detalhes são específicos do sistema SD-OCT descrito (consulte a tabela de materiais). Por exemplo, nem todos os dispositivos oferecem ajuste manual do comprimento do caminho do braço de referência.
6. Na guia Paciente/Exame, clique duas vezes no exame destacado para prosseguir para a guia Imagem e iniciar a geração de imagens ou simplesmente clique na guia Imagem. Se houver uma verificação padrão, clique com o botão direito do mouse para excluí-la.
7. Carregue um protocolo de varredura predefinido clicando no botão Selecionar um protocolo na lista . Como alternativa, adicione varreduras individuais.
8. Para modelos de ratos de glaucoma e retinopatia diabética e modelos de camundongos de degeneração da retina, escolha uma pré-configuração que consiste em quatro imagens: 2 OD e 2 OS. Para miopia do mouse, escolha uma predefinição que consiste em 8 imagens: 4 varreduras OD e 4 OS.
   NOTA: A imagem predefinida será explicada em mais detalhes na Seção 3. Isso é algo que cada laboratório faz para si mesmo ou com o fabricante durante a instalação no local.

2. Anestesiar o animal

1. Administrar anestésico.
   1. Anestesiar ratos com cetamina (60 mg/kg) e xilazina (7,5 mg/kg) através de injeção intraperitoneal.
   2. Anestesiar camundongos com cetamina (80 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg) por injeção intraperitoneal.
   3. Espere até que os animais estejam totalmente anestesiados e não respondam ao beliscão do dedo do pé.
2. Administrar gotas de dilatação da pupila (1% de tropicamida). Espere que as pupilas se dilatem antes de fazer a imagem.
   NOTA: A dilatação das pupilas aumenta o campo de visão, mas não é um requisito. Gotas anestésicas locais (córnea) (tetracaína a 0,5%) para anestesiar o olho também devem ser usadas se algo estiver tocando o olho (por exemplo, se aplicar lentes de contato ou usar um guia). Um guia é um dispositivo que é colocado sobre a cabeça de varredura e ajuda os iniciantes a alinhar o olho e a cabeça de varredura.
3. Depois de anestesiar o roedor, coloque o roedor em um sistema de alinhamento de roedores que possa girar o animal no espaço tridimensional (Figura 1A, 1C e 1D). Fornecer suporte térmico.
   NOTA: Atualmente, usamos sistemas de alinhamento de roedores para camundongos e ratos projetados e vendidos com o dispositivo SD-OCT.
4. Aplique líquido (por exemplo, soro fisiológico ou lágrimas artificiais) para manter os olhos lubrificados. Certifique-se de que o olho não seque durante a imagem para que as propriedades ópticas do olho sejam mantidas entre os exames (quando a córnea está molhada, a retina pode ser vista claramente).
   1. Certifique-se de manter a umidade no olho oposto ao escanear o primeiro olho para que ele não seque.
5. Use uma limpeza de tarefas delicadas para eliminar o excesso de solução salina antes da imagem, pois muito ou pouco lubrificante no olho afetará a qualidade da imagem.
   NOTA: O uso de gel lubrificante estéril não é recomendado durante a OCT, uma vez que pode interferir com a imagem. Se necessário, gel lubrificante estéril pode ser usado após o procedimento. Uma lente de contato também pode ser aplicada para garantir a umidade adequada no olho durante todo o teste. Em nossa experiência, uma lente de contato não proporcionou uma melhoria acentuada na qualidade da imagem, mas as lentes de contato ajudam a reduzir o risco de secagem da córnea durante a sessão de imagem.

3. Imagem OCT de roedores

1. Comece com um olho (OS ou OD) e imagine o olho contralateral depois.
   1. Posicione o animal usando os dois movimentos rotacionais do sistema de alinhamento de roedores, de modo que o olhar seja horizontal e olhando para baixo no eixo da lente OCT (Figura 1D).
   2. Use a OCT no modo Free Run para orientar a retina para a coleta de dados. Use o modo Apontar (clicando no botão Apontar ) inicialmente para uma exibição contínua de varreduras B horizontais e verticais em tempo real.
   3. Mova a cabeça de varredura para mais perto do olho até que a retina esteja visível (como as lentes de retina de rato e rato são de foco fixo, movendo a lente em direção ao olho foca mais profundamente na retina). Em seguida, use o sistema de alinhamento de roedores para ajustar a posição do animal para cima/para baixo e girar/torcer para posicionar a cabeça do nervo óptico no centro, fazer a varredura horizontal horizontal e a varredura vertical vertical (Figura 1A).
   4. Ajuste a distância de trabalho de modo que a imagem da retina seja plana e não curva.
   5. Ajuste a posição do braço de referência para manter a imagem perto da parte superior da janela de exibição. Tenha cuidado para não ir muito longe ou a imagem do olho vai virar de volta sobre si mesma.
2. Imagem da retina
   1. Para modelos de glaucoma, degeneração da retina e retinopatia diabética: Defina uma varredura de volume que consista em 1000 x 100 x 1 (exames A x exames B x exames B repetidos) para média. Em ratos, faça uma varredura de volume que seja de 3 x 3 mm. Em camundongos, faça uma varredura de volume de 1,5 x 1,5 mm.
   2. Centralize o nervo óptico no acesso horizontal e vertical para que a varredura de volume esteja no centro. Reserve um tempo para se certificar de que a cabeça do nervo óptico está no centro da varredura e reta ao longo dos eixos nasal-temporal e superior-inferior (Figura 2). Digitalize e recarregue novamente para se certificar de que está exatamente no centro, se necessário. Repita esta varredura conforme necessário até que a cabeça do nervo óptico esteja centrada e alinhada ao longo de ambos os eixos. Clique no botão Instantâneo para tirar uma foto.
      NOTA: Alguns dispositivos SD-OCT têm a opção de manipular opticamente a curvatura do olho (por exemplo, a imagem é achatada) ajustando a distância do olho da fonte de luz com o braço de referência. Recomendamos achatar e centralizar as imagens ao fazer medições diretas de espessura através das camadas da retina para melhorar a precisão ao longo da direção anteroposterior.
   3. Clique no botão Salvar para salvar a imagem.
   4. Faça uma varredura radial centrada na cabeça do nervo óptico que é 1000 x 4 x 20 (A-scan x B-scan x repetidas B-scans). Use exames B repetidos para melhorar a clareza da imagem do olho ou da retina, o que ajudará a interpretar regiões do olho ou camadas da retina durante a análise de dados.
      NOTA: Novamente, em ratos esta varredura radial é de 3 mm, enquanto em camundongos a varredura radial é de 1,5 mm.
   5. Salve a imagem.
   6. Repita os passos 3.1 a 3.2.5 no olho contralateral.
3. Medidas axiais do comprimento
   1. Para projetos que envolvam imagens de todo o olho, como miopia de camundongo, faça três exames de todo o olho e uma varredura de retina para cada olho. Escolha uma pré-definição que consista em uma varredura radial que seja 500 x 20 x 1 e englobe todo o diâmetro do olho.
      NOTA: Esta configuração fornece uma imagem de todo o comprimento do olho do rato, desde a córnea até à coroide.
   2. Centralize o meio do olho e da retina no campo de visão. Faça três varreduras radiais (varreduras de olho inteiro): uma varredura B linear que é 1000 x 5 x 2 e duas varreduras B lineares adicionais de 1000 x 5 x 2 no mesmo local. Salve as imagens.
   3. Depois, se desejar, aumente o zoom e faça uma varredura de volume ou retangular (varredura de retina) semelhante à descrição no 3.2, que consiste em varreduras de 1000 x 20 A x varreduras B. Salve a varredura de volume.
   4. Repita os passos 3.3 a 3.3.3 no olho contralateral.
      NOTA: As medições axiais do comprimento só são possíveis em olhos pequenos (mouse ou menores), uma vez que a janela de imagem dos sistemas atuais não é grande o suficiente para capturar um olho maior.

4. Etapas pós-imagem

1. Armazene dados salvos em uma nuvem, o que é uma boa prática para o gerenciamento de dados e permite fácil acesso para análise posterior. Realizar análise de dados com software personalizado desenvolvido em um programa de modelagem matemática (Tabela de Materiais).
2. Remova o roedor do sistema de alinhamento de roedores e dê uma injeção intraperitoneal de atipamezol (1 mg/kg para ratos e camundongos) para reverter os efeitos da xilazina, para que o roedor acorde mais rapidamente.
3. Permita que os roedores se recuperem em uma almofada de aquecimento em fogo baixo. Dê gotas salinas adicionais, conforme necessário. Devolva os roedores à sua gaiola de origem quando recuperarem a deambulação completa.
4. Feche o programa e desative a OCT.

5. Pós-processamento de imagens OCT

1. Processe as imagens usando um software personalizado desenvolvido em um programa de modelagem matemática para atender às necessidades específicas da OCT (por exemplo, medir a espessura das áreas de interesse marcando manualmente as imagens).
2. Dependendo da finalidade da imagem (retina de camundongo, retina de rato ou miopia/comprimento axial), use um dos três programas diferentes:
   1. Para processar a retina, selecione as varreduras OCT a serem carregadas. Primeiro, defina o centro da cabeça do nervo óptico com um simples clique.
   2. Veja como o programa gera linhas verticais que definem distâncias em ambos os lados da cabeça do nervo óptico. Note-se que na retina de ratos, essas linhas estão a 0,5 mm e 1,2 mm de distância do centro da cabeça do nervo óptico, para um total de 4 linhas verticais que representam os eixos nasal-temporal e inferior-superior do olho, dependendo da varredura radial B atualmente analisada.
      NOTA: Na retina do rato, estas linhas verticais estão a 0,25 mm e a 0,5 mm do centro da cabeça do nervo óptico.
   3. Delineie as seguintes camadas ao longo de cada linha:
      A camada de fibras nervosas da retina (RNFL), a camada plexiforme interna (IPL), a camada nuclear interna (INL), a camada plexiforme externa (OPL), a camada nuclear externa (ONL), a membrana limitante externa (ELM), os segmentos internos/segmentos externos (IS/OS), o epitélio pigmentar da retina (PSE) e a espessura total da retina.
      NOTA: A varredura radial normalmente não tem rótulos nasais/temporais e superiores/inferiores quando é aberta. As varreduras podem ser criadas de tal forma que tenham uma orientação n/t e s/I, e essas varreduras, em particular, são analisadas posteriormente.
   4. Depois que uma imagem for delineada e o programa fechado, exporte essas medidas para um software de planilha para análise de dados.
3. Use esses valores de comprimento e espessura da etapa 5 para fazer comparações entre grupos, por exemplo, determinando se há diferenças regionais (n/t/s/i) ou alterações longitudinais.
4. Para medições da retina, primeiro determine se há diferenças no eixo nasal-temporal e inferior-superior nas distâncias de 0,5 mm e 1,2 mm.
   NOTA: Se não forem observadas diferenças nos quadrantes, as medições de 0,5 mm e 1,2 mm podem ser calculadas em conjunto. Esta é uma abordagem semelhante para os exames de retina do rato apenas em 0,25 mm e 0,5 mm.
5. Para estudos de miopia, use este programa para avaliar os parâmetros oculares ao longo do eixo óptico do olho. Abra o programa de modelagem matemática. Primeiro, selecione uma imagem para carregar.
   1. Depois de carregar a imagem, marque manualmente cada digitalização (varreduras radiais e B). Marque as bordas anterior e posterior da córnea, lente, câmara vítrea e retina, de modo que o programa calcule a espessura da córnea, espessura da lente, profundidade da câmara anterior e vítrea, espessura total da retina, comprimento axial total.
   2. Após a marcação, saia do programa que solicita um menu de salvamento. Salve os valores delineados em um software de planilha e faça a média das três varreduras separadas juntas.

Resultados

O SD-OCT é considerado bem-sucedido se forem obtidas imagens de alta qualidade de modo que as dimensões oculares possam ser medidas de forma confiável. Aqui, uma variedade de usos do SD-OCT é ilustrada usando modelos de degeneração da retina, glaucoma, retinopatia diabética e miopia.

Em um modelo de degeneração retiniana induzida por luz (LIRD), a exposição à luz brilhante (10.000 lux) induz a degeneração das células fotorreceptoras na retina⁹. Imagens re...

Discussão

A imagem de alta resolução de estruturas oculares in vivo permite a avaliação das alterações retinianas e oculares ao longo do tempo. Neste protocolo, a SD-OCT demonstrou capturar diferenças nas estruturas oculares in vivo em modelos de degeneração da retina, glaucoma, retinopatia diabética e miopia.

O aspecto mais crítico ao realizar o SD-OCT é a obtenção de uma imagem clara da retina ou de outra estrutura ocular de interesse. É importante ter tempo para se certificar de que a ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% tropicamide	Sandoz	Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59
0.5% tetracaine	Alcon	NDC 0065-0741-12
AIM-RAS G3 120 V	Leica Bioptigen	90-AIMRAS-G3-120	Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice
Celluvisc gel	REFRESH CELLUVISC	#4554; NDC-0023-4554-30
G3 18 mm Telecentric Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-18
G3 Mouse Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-M
G3 Rat Lens	Leica Bioptigen	90-BORE-G3-R
heating pad	Fabrication	11-1130
InVivoVue software	Leica Bioptigen		Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system
MATLAB	Mathworks		mathematical modeling program
Mouse/Rat Kit	Leica Bioptigen	90-KIT-M/R	Mouse/rat rodent alignment system
saline	ADDIPAK	200-39
System Envisu R4300 VHR 120 V	Leica Bioptigen	90-R4300-V1-120	SD-OCT system