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要約

ここでは、血管内フィラメント穿孔によって誘導された標準化されたSAHマウスモデルを、手術後24時間で磁気共鳴画像法(MRI)と組み合わせて、正しい出血部位を確保し、他の関連する頭蓋内病変を排除する。

要約

くも膜下出血(SAH)を模倣するための血管内フィラメント穿孔モデルは一般的に使用されるモデルである - しかし、この技術は、高い死亡率だけでなく、制御不能な量のSAHおよび脳卒中または頭蓋内出血などの他の頭蓋内合併症を引き起こす可能性がある。このプロトコルでは、血管内フィラメント穿孔によって誘導された標準化されたSAHマウスモデルを提示し、手術後24時間で磁気共鳴画像法(MRI)と組み合わせて、正しい出血部位を確保し、他の関連する頭蓋内病変を排除する。簡単に言えば、C57BL/6Jマウスを腹腔内ケタミン/キシラジン(70mg/16mg/kg体重)注射で麻酔し、仰臥位に置いた。正中線頸部切開後、総頚動脈(CCA)および頸動脈分岐部が露出し、5-0非吸収性モノフィラメントポリプロピレン縫合糸が外頚動脈(ECA)に逆行的に挿入され、総頚動脈に進んだ。次いで、フィラメントを内頸動脈(ICA)に浸入し、前方に押し出して前大脳動脈(ACA)を穿孔する。手術からの回復後、マウスは24時間後に7.0T MRIを受ける。出血量は術後MRIを介して定量化および等級付けすることができ、血液量に基づいてさらなるサブグループ分析を実行するオプションを備えた堅牢な実験SAHグループを可能にします。

概要

くも膜下出血(SAH)は、頭蓋内動脈瘤の破裂によって引き起こされ、脳卒中の約5%を占める実質的な罹患率および死亡率に関連する生命を脅かす緊急事態をもたらす1,2。SAH患者は、重度の頭痛、神経機能障害、および進行性の意識障害を呈する3。SAH患者の約30%が、最初の出血事象4後最初の30日以内に死亡する。臨床的には、患者の50%が早期の脳損傷後に遅延脳損傷(DBI)を経験する。DBIは、遅延性脳虚血および遅延性神経学的欠損を特徴とする。現在の研究は、いくつかの異なる要因の相乗効果が、血液脳関門の破壊、小動脈の収縮、微小循環機能障害、および血栓症を含む神経学的機能の喪失につながることを示している5,6。

SAHの1つのユニークな側面は、病因が実質外の場所に由来するが、その後実質内の有害なカスケードにつながることである:病理はくも膜下腔における血液の蓄積から始まり、神経炎症、神経および内皮細胞アポトーシス、皮質拡散脱分極、および脳浮腫形成7などの多数の実質外効果を引き起こす、8.

臨床研究はいくつかの要因によって制限されており、動物モデルは、疾患のパトメカニスティックな変化を一貫して正確に模倣する上で重要な要素となっています。異なるSAHモデルプロトコルが提案されている、例えば、大槽への自家血液注入(ACM)。また、胸郭マグナおよび視神経キアズム槽(APC)にそれぞれ自家血液を二重注射する修正方法9、10である。自家血液注射は、くも膜下出血後の血管れん縮および炎症反応の病理学的過程をシミュレートする簡単な方法であるが、以下の頭蓋内圧(ICP)の上昇は比較的遅く、血液脳関門の透過性に顕著な変化は誘発されない11、12。別の方法である動脈周囲血液配置は、通常、大型SAHモデル(例えば、サルおよびイヌ)において使用され、抗凝固された自家血液または同等の血液製剤を血管の周囲に配置することを含む。動脈の直径変化は顕微鏡で観察することができ、SAH13後の脳血管れん縮の指標となる。

Barryらは、頭蓋骨を切除した後に脳底動脈が露出する血管内穿孔モデルを1979年に初めて記載した。次いで、動脈をタングステン微小電極で穿刺し、顕微鏡定位技術14を使用する。1995年、ベダーソンとVeelkenは脳虚血のZea-Longaモデルを修正し、血管内穿孔を確立し、15,16以来継続的に改善されています。この方法は、マウスとヒトがウィリスのサークルとして知られる同様の頭蓋内血管網を共有しているという事実に基づいている。

マウスモデルにおけるSAHの術後評価およびグレーディングのために、異なるアプローチが提案されている。菅原らは、2008年から広く用いられているグレーディングスケールを開発した17。この方法は、形態学的変化に基づいてSAHの重症度を評価する。しかし、この方法では、マウスの脳組織形態を直接視力で検査する必要があるため、マウスを評価のために犠牲にする必要があります。さらに、インビボでSAH重症度を決定するためのいくつかの方法が確立されている。アプローチは、単純な神経学的スコアリングから頭蓋内圧(ICP)のモニタリング、さまざまな放射線イメージング技術まで多岐にわたります。さらに、MRIグレーディングは、SAH重症度をグレード化する新しい非侵襲的ツールとして示されており、神経学的スコア18、19と相関している。

ここでは、血管内穿孔によって引き起こされるSAHモデルのためのプロトコールを、術後MRIと組み合わせる。また、 生体内 における出血量を客観化するシステムを確立するために、7.0T高分解能T2加重MRIを用いてSAHグレーディングと総血液量定量を行うシステムを開発しました。このアプローチは、SAHの正しい誘導と、脳卒中、水頭症、または脳内出血(ICH)および合併症などの他の病状の排除を保証する。

プロトコル

実験は、Landesamt fuer Gesundheit undheit und and Soziales (LaGeSo), Berlin, Germany(G0063/18)によって定められたガイドラインおよび規制に従って実施した。本研究では、体重25±0.286g(平均±s.e.m.)のC57Bl/6J雄(8~12週齢)マウスを用いた。

1. 動物の準備

  1. ケタミン(70mg/kg)およびキシラジン(16mg/kg)を腹腔内に注射して麻酔を誘導する。体温を正常に保ち、深部麻酔の迅速な誘導に貢献します。つま先のピンチなどの痛みの刺激で適切な鎮静をテストし、反応がないことを確認します。
  2. マウスの首の毛をカミソリで慎重に剃り、70%エタノールとそれに続くベタジン/クロルヘキシジンできれいにし、局所的な痛みを抑えるために皮膚表面に1%のリドカインを塗布する。
  3. マウスを仰臥位に置きます。テープを使用して手足と尾を固定し、首の皮膚を手術の反対側に優しく伸ばします。同時に、首をわずかに上げます。
  4. 眼科用軟膏(例えば、5%デクスパンテノール)を使用して、手術中の眼の脱水を防止する。

2. SAH誘導

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図1: 外科的技術の段階的な画像 。 (A)露出した右頸動脈解剖学の描写:CCAおよびICAおよびECAへの分岐、ならびにECA(OAおよびSTA)の小さな枝が同定される。(B)ECAを周囲の組織から動員し、切断する前に2本の縫合糸で結紮する。第3の結紮は、それを閉塞することなく分岐部の近くに緩やかに配置する必要がある。(C)ICAおよびCCAは、ECAを慎重に切開したときに過度の出血を防ぐために、一時的に(ライゲーションまたはクリップのいずれかで)閉塞される。(D)フィラメントをECAに挿入し、CCAに前進させる。予め配置された結紮は、輸血が起こらないように慎重に締め付けなければならないが、フィラメントの前進は可能である。(E) ICAとCCAが再び開かれ、ECAの切り株を頭蓋方向に調整する必要がある。フィラメントを約9mm前方に押し込むと、ACA-MCA分岐部に到達し、フィラメントをさらに約3mm押し込んで容器に穴を開けます。(f)フィラメントは、CCAの経時的な再ライゲーションを確保した後に引き抜かれる。ECAの予め配置されたライゲーションは迅速に閉塞され、CCAは再灌流を可能にするために再び開かれる。略語:ACA=前大脳動脈、CCA=総頚動脈、ECA=外頸動脈、MCA=中大脳動脈、ICA=内頚動脈、OA=後頭動脈、PPA=翼状口蓋動脈、STA=上甲状腺動脈。スケール バー = 2 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 顎から胸骨の上端(1.5cm)まで、滅菌メスで首の皮膚を開き、周囲の結合組織から唾液腺を鈍く分離する。
  2. 気管の片側(この場合は右側)に沿って筋肉群を分離し、栄養のある血管と細静脈で覆われた総頸動脈(CCA)鞘を露出させる。CCAと迷走神経は互いに近接して位置している。
  3. CCAを解離させ、フリーのまま8-0事前に結紮せずにCCAの周りの絹縫合糸。迷走神経は損傷しやすいため、保護に注意してください(図1A)。
  4. CCA、ICA、およびECAの三重分岐は、拡張症の後3分の1の下方に沿って見える。ECAの遠位端を解剖し、血管をできるだけ遠位距離の2倍に結紮する。
  5. 2回ライゲーションされたセグメントの中間点でECAを切断し、血管切り株を作成する。
  6. ECA切り株の周囲にフィラメント用のライゲーションを1つ予め配置し、フィラメント挿入が成功するまで閉じないでください。
  7. 縫合糸またはマイクロクリップを使用して、ICAとCCAを一時的に閉塞します(図1B)。
  8. 微小血管はさみを用いてECAに小さな切開(ECA直径の約半分)を行う。5-0(または4-0)のプロレンフィラメントをECAに挿入し、CCAに進めます。
  9. ICAとCCAのマイクロクリップを緩めながら、ECAの合字を少し閉じます(図1C)。
  10. フィラメントを静かに引き戻し、ECA切り株を頭蓋方向に調整し、分岐部を通ってフィラメントをICAに侵入させます(図1D)。
  11. フィラメント先端を内側に、気管正中線に対して〜30°、水平面に対して〜30°の角度でポイントします。フィラメントをICA内で前方に押し込みます。ACA-MCA分岐部に到達した後、抵抗(〜9mm)に遭遇する。
  12. フィラメントをさらに3mm前進させ、右ACAを穿孔する。速やかにフィラメントをECA切り株に引き抜き、くも膜下腔への血流を可能にする。
  13. フィラメントをこの位置に約10秒間保持します(図1E)。筋肉の振戦、同側縮瞳、息を呑むこと、心臓のリズムの変化、尿失禁の存在は、手術の成功の証拠を裏付けることができます。
  14. 過剰な失血を避けるためにCCAを一時的に閉じます。フィラメントを即座に引き出し、あらかじめ配置された縫合糸でECAを結紮する。CCAを再度開き、くも膜下腔への血液の再灌流およびさらなる滲出を可能にする(図1F)。
  15. 出血漏れを確認した後、術後の皮膚感染を防ぐために創傷周囲の皮膚を消毒し、非吸収性の4-0ポリエステル繊維縫合糸で創傷を縫合する。
  16. 意識が回復するまで、マウスをサーマルボックスに入れます。動物が完全に目覚めるまで待って、胸骨の臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したことを確認してください。完全に回復するまで動物を他のマウスの会社に戻さないでください。
  17. 術後の疼痛緩和のために200-300mg / kg体重パラセタモールを投与する。
  18. 手術後、毎日マウスをチェックしてください。

3. MRI測定

  1. 手術後24時間後、げっ歯類スキャナー(材料表)と専用のマウス頭部共振器を用いてMRIを行い、ここでは20mmの送受信直交体積共振器を使用した。
  2. マウスを加熱循環水毛布の上に置き、〜37°Cの一定の体温を確保します。 O2/N2O混合物(30%/70%)中の2.5%イソフルランで麻酔を誘導し、連続換気モニタリング下でフェイスマスクを介して1.5〜2%イソフルランで維持する。
  3. まず、高速リファレンススキャンを実行して、3つの直交スライスパッケージ(トライパイロットマルチ、繰り返し時間TR/エコー時間TE = 200ms/3ms、1平均、フリップ角FA = 30°、視野FOV = 28 mm x 28 mm、マトリックスMTX = 256 x 256、スライス厚さ1 mm、合計集録時間TA = 30 s)を集録します。
  4. 次に、イメージングに高解像度のT2加重2Dターボスピンエコーシーケンスを使用します(イメージングパラメータTR/TE = 5505 ms/36 ms、RERE係数8、6平均、脳全体を覆うスライス厚さ0.35 mmの46個の連続したアキシャルスライス、FOV = 25.6 mm x 25.6 mm、MTX = 256 x 256、TA = 13分)。
  5. 結果が不明瞭な場合は、T2wスキャンと同じ等距離で追加の呼吸トリガT2*加重勾配エコーシーケンスを使用します(2D FLASH、TR / TE = 600 ms/6.3 ms、FA = 30°、平均1、厚さ0.35 mmの20軸スライス、呼吸数に応じてT2w、TA = 5-10分と同じFOVおよびMTX)。
  6. データをDICOM画像形式に転送し、血栓のSAHグレーディングと体積測定にImageJソフトウェアを使用します。定量に関する詳細は、補足資料にステップバイステップガイドとして記載されています(補足図1)。

結果

死亡率
この研究のために、8〜12週齢の合計92匹の雄C57Bl/6JマウスをSAH手術に供した。これらにおいて、我々は11.9%(n = 12)の全体的な死亡率を観察した。死亡率は手術後最初の6〜24時間以内にのみ発生し、周術期死亡率およびSAH出血自体が最も可能性の高い寄与因子であることを示唆している。

SAH出血グレード
合計50匹のマウスが術後24時間でMR...

ディスカッション

要約すると、血管内フィラメント穿孔操作によって誘導される標準化されたSAHマウスモデルは、軽度の浸潤、短い手術時間、および許容可能な死亡率で提示される。MRIは術後24時間で行われ、正しい出血部位および他の関連する頭蓋内病変の排除を確実にする。さらに、異なるSAH出血グレードを分類し、出血量を測定し、出血グレードに基づいてさらなるサブグループ分析を可能にした。

...

開示事項

利益相反の禁止

謝辞

SLは中国奨学金評議会の支援を受けました。KTはベルリン保健研究所のBIH-MD奨学金とゾンネンフェルト財団の支援を受けた。RXは、ベルリンのシャリテ大学とベルリン衛生研究所が資金提供するBIH-Charité Clinician Scientist Programの支援を受けています。我々は、ドイツ研究財団(DFG)及びシャリテのオープンアクセス出版基金(ベルリン大学)からの支援を認める。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Eye creamBayer815529836Bepanthen
Images analysis softwareImageJBundled with Java 1.8.0_172
Ligation suture (5-0)SMISilk black USP
Light source for microscopeZeissCL 6000 LED
KetamineCP-pharma797-037100 mg/mL
MRIBrukerPharmascan 70/16 7 Tesla
MRI images acquired softwareBrukerBruker Paravision 5.1
Paracetamol (40 mg/mL)bene Arzneimittel4993736
Prolene filament (5-0)ErhiconEH7255
RazorWellaHS61
Surgical instrument (Fine Scissors)FST14060-09
Surgical instrument (forceps#1)AESCULAPFM001R
Surgical instrument (forceps#2)AESCULAPFD2855R
Surgical instrument (forceps#3)HammacherHCS 082-12
Surgical instrument (Needle holder)FST91201-13
Surgical instrument (Vannas Spring Scissors)FST15000-08
Surgical microscopeZeissStemi 2000 C
Ventilation monitoringStony BrookSmall Animal Monitoring & Gating System
Wounding suture(4-0)ErhiconCB84D
XylavetCP-pharma797-06220 mg/mL

参考文献

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