Модель эндоваскулярной перфорации субарахноидального кровоизлияния в сочетании с магнитно-резонансной томографией (МРТ)

Резюме

Здесь мы представляем стандартизированную модель мыши SAH, индуцированную перфорацией эндоваскулярной нити, в сочетании с магнитно-резонансной томографией (МРТ) через 24 ч после операции для обеспечения правильного места кровотечения и исключения других соответствующих внутричерепных патологий.

Аннотация

Модель перфорации эндоваскулярной нити для имитации субарахноидального кровоизлияния (SAH) является широко используемой моделью, однако этот метод может вызвать высокий уровень смертности, а также неконтролируемый объем SAH и другие внутричерепные осложнения, такие как инсульт или внутричерепное кровоизлияние. В этом протоколе представлена стандартизированная модель мыши SAH, индуцированная перфорацией эндоваскулярной нити, в сочетании с магнитно-резонансной томографией (МРТ) через 24 ч после операции для обеспечения правильного места кровотечения и исключения других соответствующих внутричерепных патологий. Вкратце, мышей C57BL/6J анестезируют внутрибрюшинной инъекцией кетамина/ксилазина (70 мг/16 мг/кг массы тела) и помещают в лежачее положение. После разреза средней линии шеи обнажаются общая сонная артерия (CCA) и каротидная бифуркация, и нерассасывающийся монофиламентный полипропиленовый шов 5-0 вводится ретроградным способом в наружную сонную артерию (ECA) и продвигается в общую сонную артерию. Затем нить инвагинируется во внутреннюю сонную артерию (ICA) и выдвигается вперед для перфорации передней мозговой артерии (ACA). После восстановления после операции мыши проходят МРТ 7,0 Т через 24 ч. Объем кровотечения может быть количественно определен и оценен с помощью послеоперационной МРТ, что позволяет создать надежную экспериментальную группу SAH с возможностью выполнения дальнейших анализов подгрупп на основе количества крови.

Введение

Субарахноидальное кровоизлияние (SAH) вызвано разрывом внутричерепной аневризмы и представляет собой опасную для жизни чрезвычайную ситуацию, связанную со значительной заболеваемостью и смертностью, что составляет около 5% инсультов ^1,2. Пациенты с САГ с выраженными головными болями, неврологической дисфункцией и прогрессирующим нарушением сознания³. Около 30% пациентов с САГ умирают в течение первых 30 дней после первоначального кровотечения⁴. Клинически 50% пациентов испытывают отсроченную черепно-мозговую травму (DBI) после ранней черепно-мозговой травмы. ДБИ характеризуется отсроченной ишемией головного мозга и отсроченным неврологическим дефицитом. Современные исследования показали, что синергетические эффекты нескольких различных факторов приводят к потере неврологической функции, включая разрушение гематоэнцефалического барьера, сокращение мелких артерий, микроциркуляторную дисфункцию и тромбоз ^5,6.

Одним из уникальных аспектов SAH является то, что патогенез возникает из экстрапаренхимального расположения, но затем приводит к пагубным каскадам внутри паренхимы: патология начинается с накопления крови в субарахноидальном пространстве, вызывая множество внутрипаренхимальных эффектов, таких как нейровоспаление, апоптоз нейронных и эндотелиальных клеток, кортикальная распространяющаяся деполяризация и образование отека мозга^{7, См. 8}.

Клинические исследования ограничены несколькими факторами, что делает животную модель критическим элементом в последовательной и точной имитации патомеханистических изменений заболевания. Были предложены различные протоколы модели SAH, например, аутологичная инъекция крови в cisterna magna (ACM). Также модифицирован метод с двойной инъекцией аутологичной крови в цистерну магна и зрительный хиазм цистерны (БТР) соответственно ^9,10. В то время как аутологичная инъекция в кровь является простым способом имитации патологического процесса спазма сосудов и воспалительных реакций после субарахноидального кровоизлияния, последующее повышение внутричерепного давления (ВЧД) происходит относительно медленно, и никаких заметных изменений проницаемости гематоэнцефалического барьера индуцируется^11,12. Другой метод, периартериальное размещение крови, обычно используемый в больших моделях SAH (например, обезьяны и собаки), включает размещение антикоагулянтной аутологичной крови или сопоставимых продуктов крови вокруг сосуда. Изменения диаметра артерии можно наблюдать с помощью микроскопа, служащего индикатором церебрального спазма сосудов после SAH¹³.

Barry et al. впервые описали модель эндоваскулярной перфорации в 1979 году, в которой базилярная артерия обнажается после удаления черепа; затем артерию прокалывают вольфрамовыми микроэлектродами с использованием микроскопической стереотаксической техники¹⁴. В 1995 году Бедерсон и Велкен модифицировали модель Зеа-Лонга церебральной ишемии и установили эндоваскулярную перфорацию, которая постоянно улучшалась с ^15,16. Этот метод основан на том, что мыши и люди имеют схожую внутричерепную сосудистую сеть, известную как круг Уиллиса.

Для послеоперационной оценки и классификации SAH в мышиной модели были предложены различные подходы. Sugawara et al. разработали шкалу оценок, которая широко используется с 2008 года¹⁷. Этот метод оценивает тяжесть САГ на основе морфологических изменений. Однако для этого метода морфология мозговой ткани мыши должна быть исследована под непосредственным зрением, и поэтому мышь должна быть принесена в жертву для оценки. Кроме того, было установлено несколько методов определения тяжести САГ in vivo. Подходы варьируются от простой неврологической оценки до мониторинга внутричерепного давления (ICP) и различных методов радиологической визуализации. Кроме того, оценка МРТ была показана как новый, неинвазивный инструмент для оценки тяжести SAH, коррелирующий с неврологическим баллом^18,19.

Здесь представлен протокол для модели SAH, вызванной эндоваскулярной перфорацией, в сочетании с послеоперационной МРТ. В попытке создать систему для объективизации количества кровотечений в условиях in vivo , мы также разработали систему для классификации SAH и количественной оценки общего объема крови на основе МРТ с высоким разрешением 7,0 Т с высоким разрешением T2. Такой подход обеспечивает правильную индукцию САГ и исключение других патологий, таких как инсульт, гидроцефалия или внутримозговое кровоизлияние (ICH) и осложнения.

протокол

Эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Landesamt fuer Gesundheit und Soziales (LaGeSo), Берлин, Германия (G0063/18). В этом исследовании использовали самцов мышей C57Bl/6J (8-12 недель) весом 25 ± 0,286 г (средняя ± т.е. м.).

1. Подготовка животных

1. Индуцировать анестезию путем введения кетамина (70 мг/кг) и ксилазина (16 мг/кг) внутрибрюшинно. Поддерживать нормальную температуру тела, способствуя быстрому введению глубокой анестезии. Проверьте адекватную седацию с болевым стимулом, таким как защемление пальца ноги, и проверьте отсутствие реакции.
2. Тщательно сбрите волосы шеи мыши бритвой, очистите их 70% этанолом с последующим бетадином / хлоргексидином и нанесите 1% лидокаина на поверхность кожи для местного контроля боли.
3. Поместите мышь в положение лежа на спине. Используйте ленту для фиксации конечностей и хвоста, осторожно растягивая кожу шеи на противоположную сторону операции. Одновременно немного приподнимите шею.
4. Используйте офтальмологическую мазь (например, 5% декспантенол) для предотвращения обезвоживания глаз во время операции.

2. Индукция SAH

Рисунок 1: Пошаговые изображения хирургической техники. (А) Изображение обнаженной анатомии правой сонной артерии: идентифицированы ОАС и ее бифуркация в ИКА и ЭКА, а также небольшие ветви ЭКА (ОА и СТА). (B) ЭКА мобилизуется из окружающих тканей и перевязывается двумя швами перед ее разрезанием. Третья перевязка должна быть размещена свободно рядом с бифуркацией, не закупоривая ее. (C) ICA и CCA временно закупориваются (либо с перевязкой, либо клипсами) для предотвращения чрезмерного кровотечения при тщательном надрезе ЭКА. D) нить накала вставляется в ЭКА и переносится в ОАС. Предварительно организованная перевязка должна быть тщательно затянута, чтобы не возникало выпота крови, но продвижение нити остается возможным. (E) МКА и ОАС вновь открываются, а пень ЭКА необходимо отрегулировать в сторону черепа. Проталкивая нить ~ 9 мм вперед в ICA, бифуркация ACA-MCA будет достигнута, и сосуд затем перфорируется путем проталкивания нити накала ~ 3 мм дальше. (F) Нить накала изымается после обеспечения временной религации ОАС. Предварительно организованная лигирование ЭКА быстро закупоривается, и ОАС вновь открывается, чтобы разрешить реперфузию. Сокращения: ACA = передняя мозговая артерия, CCA = общая сонная артерия, ECA = наружная сонная артерия, MCA = средняя мозговая артерия, ICA = внутренняя сонная артерия, OA = затылочная артерия, PPA = крылогопалатиновая артерия, STA = верхняя щитовидная артерия. Шкала = 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Откройте кожу шеи стерильным скальпелем, от подбородка до верхнего края грудины (1,5 см), и тупо отделите слюнные железы от окружающей их соединительной ткани.
2. Отделите группу мышц вдоль одной стороны [в данном случае правой стороны] трахеи, обнажив оболочку общей сонной артерии (ОАС), покрытую питательными кровеносными сосудами и венулами. ОАС и блуждающий нерв расположены в непосредственной близости друг от друга.
3. Диссоциировать ВСС и оставить свободным 8-0 шелковый шов вокруг КЦА без его перевязки заранее. Обратите внимание на защиту блуждающего нерва, так как он легко повреждается (рисунок 1А).
4. Тройная бифуркация CCA, ICA и ECA видна вдоль нижней задней трети диастаза. Рассекните дистальный конец ЭКА и сажайте сосуд в два раза дальше, насколько это возможно.
5. Отсоедините ЭКА в средней точке дважды перевязанного сегмента, создав культю сосуда.
6. Предварительно организуйте одну перевязку нити накала вокруг культи ЭКА, не закрывайте ее до успешного введения нити накаливания.
7. Используйте шов или микрозажим для временного закрытия ICA и CCA (рисунок 1B).
8. Сделайте небольшой разрез (примерно половину диаметра ЭКА) в ЭКА с помощью микрососудистых ножниц. Вставьте проленовую нить 5-0 (альтернативно 4-0) в ЭКА и перенесите ее в ОАС.
9. Слегка закройте лигатуру на ЭКА, ослабив микрозажим на ICA и CCA (рисунок 1C).
10. Осторожно оттяните нить накаливания и отрегулируйте культю ECA в черепном направлении, инвагинируя нить через бифуркацию в ICA (рисунок 1D).
11. Направьте наконечник нити медиально под углом ~30° к средней линии трахеи и ~30° к горизонтальной плоскости. Вытолкните нить накаливания вперед внутри ICA. После достижения бифуркации ACA-MCA встречается сопротивление (~9 мм).
12. Продвиньте нить на 3 мм дальше, перфорируя правый ACA. Быстро выводят нить на культю ЭКА, позволяя крови течь в субарахноидальное пространство.
13. Держите нить накала в этом положении около 10 с (рисунок 1Е). Наличие мышечного тремора, ипсилатерального миоза, задыхания, измененного сердечного ритма и недержания мочи может быть подтверждающим свидетельством успешной операции.
14. Временно закройте ККА, чтобы избежать избыточной кровопотери. Вытащите нить мгновенно и обжарьте ЭКА заранее подготовленным швом. Вновь открыть ОАС и разрешить реперфузию и дальнейший выпот крови в субарахноидальное пространство (рисунок 1F).
15. После проверки на утечку кровотечения продезинфицируйте кожу, окружающую рану, чтобы предотвратить послеоперационные инфекции кожи, и зашить рану нерассасывающимся швом из полиэфирного волокна 4-0.
16. Поместите мышь в термобокс до тех пор, пока сознание не восстановится. Подождите, пока животное полностью проснется, и убедитесь, что оно восстановило достаточное сознание для поддержания грудинного покоя. Не возвращайте животных в компанию других мышей до полного выздоровления.
17. Вводят 200-300 мг/кг парацетамола с массой тела для послеоперационного обезболивания.
18. Проверяйте мышей ежедневно после операции.

3. Измерение МРТ

1. Через 24 часа после операции выполните МРТ с помощью сканера грызунов (Таблица материалов) и специального резонатора головы мыши - здесь использовался 20-миллиметровый квадратурный объемный резонатор передачи/приема.
2. Поместите мышь на подогретое одеяло для циркуляции воды, чтобы обеспечить постоянную температуру тела ~ 37 °C. Индуцировать анестезию 2,5% изофлурана в смеси O2/N2O (30%/70%) и поддерживать 1,5-2% изофлурана через лицевую маску под непрерывным контролем вентиляции.
3. Сначала выполните быстрое эталонное сканирование, получив 3 ортогональных пакета срезов (Tri-Pilot-Multi, FLASH со временем повторения TR/echo TE = 200 мс/3 мс, 1 среднее, угол сальто FA = 30°, поле зрения FOV = 28 мм x 28 мм, матрица MTX = 256 x 256, толщина среза 1 мм, общее время захвата TA = 30 с).
4. Затем для визуализации используйте для визуализации 2D-взвешенную T2-взвешенную 2D-спин-эхо-последовательность (параметры визуализации TR/TE = 5505 мс/36 мс, коэффициент RARE 8, 6 средних значений, 46 смежных осевых срезов толщиной среза 0,35 мм для покрытия всего мозга, FOV = 25,6 мм x 25,6 мм, MTX = 256 x 256, TA = 13 мин).
5. Если результат неясен, используйте дополнительную градиентную эхо-последовательность, вызванную дыханием T2*, с той же изодантностью, что и при сканировании T2w (2D FLASH, TR/TE = 600 мс/6,3 мс, FA = 30°, 1 среднее, 20 осевых срезов толщиной 0,35 мм, FOV и MTX идентичны T2w, TA = 5-10 мин в зависимости от скорости дыхания).
6. Перенесите данные в формат изображения DICOM и используйте программное обеспечение ImageJ для классификации SAH и объемной обработки сгустков крови. Подробная информация о количественной оценке приведена в качестве пошагового руководства в дополнительном материале (дополнительный рисунок 1).

Результаты

Смертность
Для этого исследования в общей сложности 92 самца мышей C57Bl/6J в возрасте от 8 до 12 недель были подвергнуты операции SAH; в них мы наблюдали общий уровень смертности 11,9% (n = 12). Смертность наблюдалась исключительно в течение первых 6-24 ч после операции, предполагая периопе...

Обсуждение

Таким образом, стандартизированная модель мыши SAH, индуцированная операцией перфорации эндоваскулярной нити, представлена с незначительной инвазией, коротким оперативным временем и приемлемыми показателями смертности. МРТ проводится 24 ч после операции для обеспечения правильного м?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eye cream	Bayer	815529836	Bepanthen
Images analysis software	ImageJ		Bundled with Java 1.8.0_172
Ligation suture (5-0)	SMI		Silk black USP
Light source for microscope	Zeiss	CL 6000 LED
Ketamine	CP-pharma	797-037	100 mg/mL
MRI	Bruker	Pharmascan 70/16	7 Tesla
MRI images acquired software	Bruker		Bruker Paravision 5.1
Paracetamol (40 mg/mL)	bene Arzneimittel	4993736
Prolene filament (5-0)	Erhicon	EH7255
Razor	Wella	HS61
Surgical instrument (Fine Scissors)	FST	14060-09
Surgical instrument (forceps#1)	AESCULAP	FM001R
Surgical instrument (forceps#2)	AESCULAP	FD2855R
Surgical instrument (forceps#3)	Hammacher	HCS 082-12
Surgical instrument (Needle holder)	FST	91201-13
Surgical instrument (Vannas Spring Scissors)	FST	15000-08
Surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000 C
Ventilation monitoring	Stony Brook		Small Animal Monitoring & Gating System
Wounding suture(4-0)	Erhicon	CB84D
Xylavet	CP-pharma	797-062	20 mg/mL