せん断力によるアンサンブル力分光法

要約

アンサンブル力分光法(EFS)は、生物物理学およびバイオセンシング分野における生体分子構造のアンサンブルセットの機械的アンフォールディングおよびリアルタイムセンシングのための堅牢な技術です。

要約

蛍光とメカノケミカルの原理に基づく単一分子技術は、生物学的センシングにおいて優れた感度を提供します。しかしながら、高スループット能力の欠如のために、これらの技術の適用は生物物理学において制限されている。アンサンブルフォース分光法(EFS)は、個々の分子のメカノケミカル研究を分子アンサンブルの研究に変換することにより、大量の分子構造の調査において高いスループットを実証しています。このプロトコルでは、DNA二次構造(i-motif)をホモジナイザーチップのローターとステーターの間のせん断流で最大77796/sのせん断速度で展開しました。i-motifが受けるせん断力に対する流量と分子サイズの影響が実証されました。EFS法はまた、DNA iモチーフとリガンドの間の結合親和性を明らかにした。さらに、せん断力によって作動できるクリック化学反応(メカノクリック化学)を実証しました。これらの結果は、せん断力を利用して分子構造の立体構造を制御することの有効性を確立しています。

概要

単一分子力分光法¹(SMFS)では、原子間力顕微鏡、光ピンセット、磁気ピンセット^2,3,4などの高度な機器によって、個々の分子構造の機械的特性が研究されてきました。力の生成/検出セットアップにおける分子の同じ指向性要件、または磁気ピンセットと小型遠心力顕微鏡(MCF)⁵、⁶、⁷、⁸の小さな視野によって制限されるため^、SMFSを使用して同時に調査できる分子の数は限られています。SMFSのスループットが低いため、多数の分子の関与を必要とする分子認識分野での幅広い用途が妨げられています。

せん断流は、分子の大規模なセットに力を加えるための潜在的な解決策を提供します⁹。流路内部の液体流では、流路表面に近いほど、流量¹⁰は遅くなる。このような流速勾配は、境界面に平行なせん断応力を引き起こします。分子がこのせ....

プロトコル

注:このプロトコルで使用されるすべてのバッファーと化学試薬は、 表の材料に記載されています。

1. せん断力顕微鏡の作製

注:せん断力顕微鏡には、反応ユニット(ホモジナイザー)と検出ユニット(蛍光顕微鏡)の2つの部分があります。接眼レンズの倍率は10倍、対物レンズ(空気)の倍率は4倍です。

1. ホモジナイザーと顕微鏡を取り付けテーブルに組み立てます。ゴーグルを着用して蛍光顕微鏡の電源を入れ、ホモジナイザーを調整して、適切な波長(ここでは488nmを使用)の励起光ビームがホモジナイザーの分散先端の中心を通過することを確認します。
2. 高さ5 cm、断面1.5 cm 2 x 1.5 cm²の平底反応チャンバーを準備します。バックグラウンドを減らすには、選択したチャンバー材料(ガラスなど)が蛍光を発しないことを確認してください(一部のプラスチックには蛍光があります)。
3. 所望のせん断力を提供できる適切なホモジナイザー分散チップを選択してください。
   注意: せん断速度は、次の式に従って、固定回転速度¹¹ での回転子と固定子の間の距離に依存します。
   

結果

図1は、EFSにおけるアンサンブル分子の機械的アンフォールディングとリアルタイムセンシングの概要を示しています。図1Bでは、i-motif DNAの蛍光強度は、pH 5.5 MESバッファー中で9,724 s−1から97,245 s⁻¹の範囲のせん断速度とともに増加することが観察された。対照として、同じi-motif DNAをpH 7.4 MES緩衝液中で63,209 s⁻¹

ディスカッション

この原稿に記載されているプロトコルは、せん断力による生体分子構造のアンサンブルセットの展開のリアルタイム調査を可能にします。ここで提示された結果は、DNA i-モチーフ構造がせん断力によって展開できることを強調しています。リガンド結合iモチーフの展開とせん断力作動クリック反応は、このアンサンブル力分光法の概念実証アプリケーションでした。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3K MWCO Amicon	Millipore Sigma	ufc900324
Ascorbic acid	VWR	VWRC0143-100G
Calfluor 488 azide	Click Chemistry Tools	1369-1
CuCl	Thermo	ACRO270525000
Dispersion tip	Switzerland	PT-DA07/2EC-B101
DNA oligos	IDT
Dye	IDT	/5Cy5/
Fluorescence microscope	Janpan	Nikon TE2000-U
Homogenizer	Switzerland	PT 3100D
HPG	Santa Cruz Biotechnology	cs-295271
KCl	VWR	VWRC26760.295
MES	VWR	VWRCE169-500G
Quencher	IDT	/3IAbRQSp/
TBTA	Tokyo Chemical Industry	T2993
Tris	VWR	VWRCE133-100G