전단력에 의한 앙상블 힘 분광법

요약

앙상블 힘 분광법(EFS)은 생물물리학 및 생물감지 분야에서 생체 분자 구조의 앙상블 세트의 기계적 풀림 및 실시간 감지를 위한 강력한 기술입니다.

초록

형광 및 기계화학적 원리에 기반한 단일 분자 기술은 생물학적 감지에서 우수한 감도를 제공합니다. 그러나 높은 처리량 기능이 없기 때문에 이러한 기술의 적용은 생물 물리학에서 제한적입니다. 앙상블 힘 분광법(EFS)은 개별 분자의 기계화학적 연구를 분자 앙상블의 연구로 변환하여 방대한 분자 구조 세트의 조사에서 높은 처리량을 입증했습니다. 이 프로토콜에서 DNA 2차 구조(i-모티프)는 최대 77796/s의 전단 속도로 균질화기 팁의 회전자와 고정자 사이의 전단 흐름에서 펼쳐졌습니다. 유속과 분자 크기가 i-모티프가 경험하는 전단력에 미치는 영향이 입증되었습니다. EFS 기술은 또한 DNA i- 모티프와 리간드 사이의 결합 친화도를 밝혀 냈습니다. 또한, 우리는 전단력(즉, 기계-클릭 화학)에 의해 작동될 수 있는 클릭 화학 반응을 시연했습니다. 이러한 결과는 분자 구조의 형태를 제어하기 위해 전단력을 사용하는 효과를 입증합니다.

서문

단일 분자 힘 분광법¹(SMFS)에서 개별 분자 구조의 기계적 특성은 원자력 현미경, 광학 핀셋 및 자기 핀셋 ^2,3,4와 같은 정교한 도구에 의해 연구되었습니다. 힘 생성/검출 설정에서 분자의 동일한 방향성 요구 사항 또는 자기 핀셋 및 소형 원심분리기 힘 현미경(MCF)5,6,7,8의 작은 시야로 인해 제한되므로 SMFS를 사용하여 제한된 수의 분자만 동시에 조사할 수 있습니다. SMFS의 낮은 처리량은 많은 분자 세트의 개입을 필요로하는 분자 인식 분야에서의 광범위한 적용을 방해합니다.

전단 흐름은 거대한 분자 세트에 힘을 가하는 잠재적 솔루션을 제공합니다⁹. 채널 내부의 액체 흐름에서, 채널 표면에 가까울수록, 유량(¹⁰)은 느려진다. 이러한 유속 구배는 경계 표면에 평행한 전단 응력을 유발합니다. 분자가 이 전단 흐름에 배치될 때, 전단력이 장축(¹¹)에 가해짐에 따라, 분자는 그 장축이 유동 방향과 정렬되도록 스스로 방향을 바꾼다. 이러한 방향 변경의 결과로 동일한 유형(핸들의 크기 및 길이)의 모든 분자가 동일한 전단력을 경험하면서 동일한 방향으로 정렬될 것으로 예상됩니다.

이 작업은 DNA i- 모티프에 의해 예시 된 바와 같이 거대한 분자 구조 세트에 전단력을 가하기 위해 이러한 전단 흐름을 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에서는 균질화기 팁에서 회전자와 고정자 사이에 전단 흐름이 생성됩니다. 본 연구는 접힌 DNA i- 모티프 구조가 9724-97245 ^s-1의 전단 속도에 의해 펼쳐질 수 있음을 발견했다. 게다가, L2H2-4OTD 리간드와 i-모티프 사이에 36μM의 해리 상수가 발견되었다. 이 값은 겔 시프트 분석¹²에 의해 측정된 31 μM의 값과 일치한다. 또한, 현재 기술은 클릭 반응을 촉매하기 위해 킬레이트화된 구리(I)를 노출시킬 수 있는 i-모티프를 전개하는데 사용된다. 따라서 이 프로토콜을 사용하면 합리적인 시간(30분 미만)에 저비용 악기를 사용하여 대규모 i-motif 구조 세트를 펼칠 수 있습니다. 전단력 기술이 힘 분광법의 처리량을 크게 증가시킨다는 점을 감안할 때 이 기술을 앙상블 힘 분광법(EFS)이라고 합니다. 이 프로토콜은 이 전단력 기반 EFS의 적용을 용이하게 하기 위한 실험 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 완충액과 화학 시약은 표 재료에 나열되어 있습니다.

1. 전단력 현미경의 제조

참고: 전단력 현미경은 반응 장치(균질화기)와 검출 장치(형광 현미경)의 두 부분으로 구성됩니다. 접안 렌즈의 배율은 10 배이고 대물 렌즈 (공기)의 배율은 4 배입니다.

1. 균질화기와 현미경을 장착 테이블에 조립합니다. 고글을 착용하고 형광 현미경을 켠 다음 균질화를 조정하여 적절한 파장(여기서는 488nm가 사용됨)의 여기 광선이 균질화기의 분산 팁 중심을 통과하는지 확인합니다.
2. 높이가 5cm이고 단면적이 1.5cm2 x 1.5cm2인 평평한 바닥 반응 챔버를 준비합니다. 배경을 줄이려면 선택한 챔버 재료가 유리와 같이 형광을 발하지 않는지 확인하십시오 (일부 플라스틱에는 형광이 있음).
3. 원하는 전단력을 제공할 수 있는 적절한 균질화기 분산 팁을 선택하십시오.
   참고: 전단 속도는 다음 방정식에 따라 고정 회전 속도¹¹ 에서 회전자와 고정자 사이의 거리에 따라 달라집니다.
   
   여기서 μ 는 20 °C에서 물의 동적 점도입니다. D 는 고정자의 내경입니다. d 는 로터의 외경이고 V 는 전단 속도(rpm/s)입니다.
4. 형광 현미경의 샘플 스테이지에 반응 챔버를 고정한 다음 균질화기의 분산 팁을 고정하도록 챔버를 조정합니다(그림 1). 분산 팁이 반응 챔버의 바닥 표면보다 약간 위(~1mm)에 있는지 확인하십시오.
5. 균질화기와 챔버의 수직 위치를 함께 조정하여 현미경의 초점이 분산 팁의 표면에 있는지 확인하십시오. 그런 다음 분산 팁의 수평 위치를 조정하여 회전자와 고정자 사이에 감지 영역(시야)이 설정되었는지 확인합니다(그림 1).
6. 실험에 사용된 형광 염료에 따라 형광 채널을 켭니다.
7. 고속 전단 실험 전에 탈이온수(DI)를 사용하여 낮은 전단 속도(예: 2,000rpm)로 전단을 테스트하여 분산 팁이 반응 챔버를 건드리지 않고 적절하게 작동할 수 있는지 확인합니다.

2. 리간드가 있거나 없는 i-모티프 전개

1. Hu et ^al.11에 기재된 바와 같이, DI 물에서 각각 그의 두 말단에 염료 및 소광제로 표지된 인간 텔로미어 i-모티프 DNA(물질 표)를 준비한다.
   참고: 서열을 포함하는 i-모티프: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA.
2. DNA를 pH 5.5 또는 pH 7.4에서 30 mM MES 완충액에서 5 μM으로 희석한다. DNA 용액에, 0-60 μM의 농도 범위에서 Abraham Punnoose et al.13에 따라 합성된 리간드 L2H2-4OTD를 첨가한다. 용액을 ¹⁰분 동안 부드럽게 혼합하여 빛이 없는 i-motif 구조를 접습니다.
3. 탈이온수로 채워진 반응 챔버의 배경 형광 강도를 전단 없이 형광 현미경을 사용하여 확인하고 최소화합니다. 배경 형광을 최소화하는 쉬운 방법은 반응 챔버를 DI 물로 세척하는 것입니다. 배경 형광 값은 나중에 데이터 분석에서 빼야 합니다.
   알림: 이 단계부터 미광은 피해야 합니다.
4. 소프트웨어를 사용하여 CCD 카메라의 매개 변수를 설정합니다. 권장 파라미터는 노출 시간 = 0.5초, CCD 감도 = 1600, 녹화 시간 = 20분입니다.
5. 긴 피펫을 사용하여 DNA 용액을 비어 있고 깨끗한 반응 챔버에 추가합니다. 반응 챔버를 블랙 박스로 덮으십시오. 그런 다음 균질기를 시작하여 데이터를 기록하기 위해 CCD 카메라를 켠 상태에서 20분 동안 9,724s-1에서 97,245s-1(균질화기와 관련된 소프트웨어를 사용하여 선택됨) 범위의 선택된 전단 속도로 전단을 수행합니다.
6. 실험 후, 챔버를 제거하고 DI 물로 세척한다.

3. 전단력 작동 클릭 반응

1. DI 물에서 i-모티프 DNA를 준비합니다. 150μM CuCl 및 300μM 아스코르브산이 보충된 300μL 트리스 완충액(pH 7.4)에 10μM i-모티프 DNA를 10분 동안 배양하여 i-모티프 구조를 접습니다(모든 농도는 용액 중 최종 농도임).
   참고: CuCl은 클릭 반응의 촉매입니다. 아스 코르 빈산은 구리 (I) 산화를 방지합니다.
2. 한외여과 장치로 용액을 14,300 x g의 원심력으로 초여과한다. 각 여과 후 300μM 아스코르브산이 보충된 30mM 트리스 완충액(pH 7.4)으로 용액을 ~500μL까지 보충합니다.
3. 여과를 3 회 반복하십시오.
4. 잔류 용액을 수집하고 20μM 칼플루오르 488 아지드, 20μM HPG 및 10μM TBTA와 함께 300μM 아스코르브산이 보충된 30mM 트리스(pH 7.4)를 추가하여 300μL의 최종 부피를 만듭니다. 시약이 추가되면 용액을 암실로 옮깁니다.
   알림: 이 단계 후에는 표시등을 피해야 합니다.
5. 전단 실험 전에 현미경을 사용하여 DI 물로 채워진 반응 챔버의 배경 형광 강도를 확인하고 최소화합니다. 배경 형광을 최소화하는 쉬운 방법은 반응 챔버를 DI 물로 세척하는 것입니다.
6. DNA 용액을 긴 피펫으로 빈 반응 챔버에 넣은 다음 CCD 카메라를 켠 상태에서 20분 동안 63,209s-1의 전단 속도로 균질화기 전단을 시작합니다.
7. 실험 후, 챔버를 제거하고 DI 물로 세척한다.

결과

그림 1은 EFS에서 앙상블 분자의 기계적 풀림 및 실시간 감지를 간략하게 설명합니다. 도 1B에서, i-모티프 DNA의 형광 강도는 pH 5.5 MES 완충액에서 9,724 s-1 내지 97,245 ^s-1 범위의 전단 속도에 따라 증가하는 것으로 관찰되었다. 대조군으로서, 동일한 i-모티프 DNA를 pH 7.4 MES 완충액에서 63,209 ^s-1의 속도로 전단했을 때 형광...

토론

이 원고에 설명 된 프로토콜을 사용하면 전단력에 의한 생체 분자 구조의 앙상블 세트의 전개를 실시간으로 조사 할 수 있습니다. 여기에 제시된 결과는 DNA i- 모티프 구조가 전단력에 의해 펼쳐질 수 있음을 강조합니다. 리간드 결합 i-모티프의 풀림과 전단력 작동 클릭 반응은 이 앙상블 힘 분광법의 개념 증명 응용 분야였습니다.

그림 1 은 기기 설정을...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3K MWCO Amicon	Millipore Sigma	ufc900324
Ascorbic acid	VWR	VWRC0143-100G
Calfluor 488 azide	Click Chemistry Tools	1369-1
CuCl	Thermo	ACRO270525000
Dispersion tip	Switzerland	PT-DA07/2EC-B101
DNA oligos	IDT
Dye	IDT	/5Cy5/
Fluorescence microscope	Janpan	Nikon TE2000-U
Homogenizer	Switzerland	PT 3100D
HPG	Santa Cruz Biotechnology	cs-295271
KCl	VWR	VWRC26760.295
MES	VWR	VWRCE169-500G
Quencher	IDT	/3IAbRQSp/
TBTA	Tokyo Chemical Industry	T2993
Tris	VWR	VWRCE133-100G