ヒト末梢血単核細胞の凍結保存と生体エネルギー評価

要約

単離された末梢血単核細胞は、免疫機能や免疫障害、代謝性疾患、またはミトコンドリア機能の解析に使用できます。この研究では、全血からのPBMCの調製とその後の凍結保存のための標準化された方法について説明します。凍結保存は、この時間と場所を独立させます。

要約

真核細胞の生理機能は、主にミトコンドリアが提供するエネルギーに依存しています。ミトコンドリアの機能不全は、代謝性疾患や老化に関連しています。酸化的リン酸化は、エネルギー的な恒常性の維持に不可欠であるため、決定的な役割を果たします。PBMCは、ミトコンドリア機能を測定するための低侵襲サンプルとして同定されており、疾患状態を反映することが示されています。しかし、ミトコンドリアの生体エネルギー機能の測定は、ヒトサンプル中のいくつかの要因によって制限される可能性があります。制限は、採取するサンプルの量、サンプリング時間 (多くの場合、数日間に分散)、および場所です。採取したサンプルを凍結保存することで、サンプルの一貫した収集と測定が可能になります。測定されたパラメータが、凍結保存された細胞と新たに調製された細胞の間で同等であることを確認するように注意する必要があります。ここでは、ヒト血液サンプルからPBMCを単離・凍結保存し、これらの細胞におけるミトコンドリアの生体エネルギー機能を解析する方法について述べる。ここに記載されているプロトコールに従って凍結保存されたPBMCは、新たに採取した細胞と比較して、細胞数と生存率、アデノシン三リン酸レベル、および測定された呼吸鎖活性にわずかな違いしか示しません。記載された調製物に必要なヒト血液はわずか8〜24mLであり、臨床試験中にサンプルを多中心的に収集し、その場で生体エネルギーを決定することを可能にします。

概要

ヒト末梢血単核球(PBMC)は、老化プロセスや変性疾患に関連する問題など、免疫学的および生体エネルギー学的問題の研究を含む、多くの科学分野でさまざまな用途に使用されています^1,2。PBMCは組成が不均一で、リンパ球(B細胞、T細胞、NK細胞)、単球、樹状細胞で構成されています。細胞は被験者内で大きな個体差やばらつきを示すことがあるため、これらの細胞を処理するための標準化された手順が必要です。単離の生存率や純度などの重要なパラメータは、その取り扱いの基本的な要件であり、収集時間、メラトニンレベル、被験者が絶食しているかどうかなどの環境要因によってさらに影響を受けます^3,4。

ここでは、PBMCの生体エネルギーに関する研究に基づいて、他の方法にも適したPBMCの単離、凍結保存、培養方法について説明します。筋生検はミトコンドリアのエネルギー代謝のゴールドスタンダードと考えられています^が5、血球の検査は迅速で低侵襲な手順です。これに加えて、老化やアルツハイマー病(AD)におけるミトコンドリア機能の変化は、脳だけでなく末梢にも起こることを示唆する研究がますます増えています^....

プロトコル

採血、分離、分析に関するこの原稿に記載されているすべてのプロトコルは、ドイツのギーセン大学の治験審査委員会によってレビューおよび承認されています。研究にサンプルを含めることについて、患者の同意が得られました。単離と細胞培養のすべてのステップは、生物学的安全キャビネットの下で行われます。

1.静脈穿刺

1. 消毒スプレー、滅菌綿棒、80mmチューブとマルチアダプター付き採血カニューレ、止血帯/血圧カフ、モノベット9mLリチウムヘパリンなど、採血に必要なすべての機器を準備します。
   注:抗凝固剤としてのEDTAも効果的です。
2. 最も適切な腕の静脈、通常は正中大静脈または頭静脈から血液を採取します。
3. 止血帯/血圧カフを約80 mm / Hgの軽い圧力で適用します。
4. 手袋や穿刺部位をアルコール入りの消毒スプレーで消毒してください。消毒した穿刺部位を風乾させます。
5. 圧迫カフの圧力により静脈が突き出ています。針(カニューレ直径(外側)21G / 0.8 mm、長さ19 mm)を静脈の15°〜20°の角度で挿入し、外傷を回避し、プロービングを最小限に抑えます。
6. 適切なシステムで血液を採取し、9 mLの血液を含む4本のチューブを使用します(7〜8本を超えるチューブは、1人の実験者が適切に分離するのに問題があります)。
7. 採血後....

ディスカッション

このプロトコルは生体エネルギー分析のために適した方法で人間の血から末梢血の単核細胞(PBMC)を隔離し、cryopreserveする手段を提供する。記載されている方法は、PBMCを穏やかかつ大量に分離する可能性を提供し、高い生存率と生体エネルギー測定のための十分な細胞を備えています。中断が最小限であっても、長時間の単離が発生するという欠点がありますが、その後の凍結保存により、生.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0)	Self-prepared	-
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer	Self-prepared	-
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1)	Self-prepared	-
1.01 mM DTBB	Self-prepared	-
10 % Triton X-100	Self-prepared	-
10 mM Oxalacetat	Self-prepared	-
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly	Sarstedt	156353_v
37% HCl	Carl Roth GmbH & Co. KG	-
70% Ethanol (EtOH)	Self-prepared	-
Acetyl-CoA	Pancreac Applichem	A3753
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Alcohol wipes			(70% isopropyl alcohol)
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
Aqua (bidest.)	With MilliQ Academic (self-made)	-
Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
ATP-Standard	Sigma-Aldrich	6016949
Biocoll Seperating Solution	Biochrom	6115
Biological safty cabinet MSC Advantage	Thermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell counter TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R	Thermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counter	Bio-Rad	1450016
Cryotube Cryo.S	Grainer Bio-One	126263-2DG
Digitonin	Sigma-Aldrich	37008
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Merck	102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTips	Gilson	F164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x)	Gibco (Thermo Scientific)	15217168
Ethanol (EtOH 100%)	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9065.3
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665
Frezer (-80°C)	Thermo Fisher Scientific Inc.
Glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
Holder/adapter
Incubator Midi 40 CO2	Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringe	Hamilton
Malate	Sigma-Aldrich	M-1000
MIR05	Self-prepared	-
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc.	10110051
Multireader CLARIOstar	BMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plus	Thermo Fisher Scientific Inc.
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876
Oxalacetate	Sigma-Aldrich	-
Oxygraph-2k	Orobororus Instruments
Penicillin-Streptomycin	PAA	15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL	VWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)	Gibco (Thermo Scientific)	11530586
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Saccharose	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9286.2
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD)	Sigma-Aldrich	T3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methane	Sigma-Aldrich	108382
Triton X-100	Sigma-Aldrich	108643
Trypanblau	Biochrom	T6146
Vacuum pump	Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96	Perkin Elmer	6005181
Water bath WNB22	Memmert GmbH & Co. KG