Kryokonservierung und bioenergetische Bewertung von mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes

Zusammenfassung

Isolierte mononukleäre Zellen des peripheren Blutes können für die Analyse von Immunfunktionen und -störungen, Stoffwechselerkrankungen oder mitochondrialen Funktionen verwendet werden. In dieser Arbeit beschreiben wir eine standardisierte Methode zur Herstellung von PBMCs aus Vollblut und der anschließenden Kryokonservierung. Die Kryokonservierung macht diese Zeit und diesen Ort unabhängig.

Zusammenfassung

Die physiologischen Funktionen eukaryotischer Zellen beruhen auf Energie, die hauptsächlich von den Mitochondrien bereitgestellt wird. Mitochondriale Dysfunktion ist mit Stoffwechselerkrankungen und Alterung verbunden. Die oxidative Phosphorylierung spielt dabei eine entscheidende Rolle, da sie für die Aufrechterhaltung der energetischen Homöostase entscheidend ist. PBMCs wurden als minimalinvasive Probe zur Messung der mitochondrialen Funktion identifiziert und spiegeln nachweislich Krankheitszustände wider. Die Messung der mitochondrialen bioenergetischen Funktion kann jedoch durch mehrere Faktoren in menschlichen Proben eingeschränkt sein. Einschränkungen sind die Anzahl der entnommenen Proben, die Probenahmezeit, die oft über mehrere Tage verteilt ist, und die Standorte. Die Kryokonservierung der entnommenen Proben kann eine konsistente Entnahme und Messung der Proben gewährleisten. Es sollte darauf geachtet werden, dass die gemessenen Parameter zwischen kryokonservierten und frisch präparierten Zellen vergleichbar sind. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Kryokonservierung von PBMCs aus menschlichen Blutproben, um die bioenergetische Funktion der Mitochondrien in diesen Zellen zu analysieren. PBMC, die nach dem hier beschriebenen Protokoll kryokonserviert wurden, zeigen im Vergleich zu frisch geernteten Zellen nur geringfügige Unterschiede in der Zellzahl und Lebensfähigkeit, dem Adenosintriphosphatspiegel und der gemessenen Atmungskettenaktivität. Für die beschriebenen Präparate werden nur 8-24 mL menschliches Blut benötigt, wodurch es möglich ist, Proben während klinischer Studien multizentral zu entnehmen und deren Bioenergetik vor Ort zu bestimmen.

Einleitung

Humane periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) werden für verschiedene Anwendungen in vielen wissenschaftlichen Bereichen verwendet, einschließlich der Untersuchung immunologischer und bioenergetischer Probleme, z. B. im Zusammenhang mit Alterungsprozessen oder degenerativen Erkrankungen ^1,2. PBMCs sind heterogen aufgebaut und bestehen aus Lymphozyten (B-Zellen, T-Zellen und NK-Zellen), Monozyten und dendritischen Zellen. Die Zellen weisen zum Teil große individuelle Unterschiede und Variationen innerhalb eines Probanden auf, so dass standardisierte Verfahren für den Umgang mit diesen Zellen erforderlich sin....

Protokoll

Alle in diesem Manuskript beschriebenen Protokolle für die Blutentnahme, -isolierung und -analyse wurden vom Institutional Review Board der Universität Gießen geprüft und genehmigt. Das Einverständnis der Patienten, ihre Proben in die Studie aufzunehmen, wurde eingeholt. Alle Schritte zur Isolierung und Zellkultur werden unter einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt.

1. Venenpunktion

1. Bereiten Sie alle für die Blutentnahme erforderlichen Geräte vor, einschließlich Desinfektionsspray, steriler Tupfer, Blutentnahmekanüle mit 80-mm-Schlauch und Multiadapter, Tourniquet/Blutdruckmanschette, Monovette 9 ml L....

Diskussion

Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit zur Isolierung und Kryokonservierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) aus menschlichem Blut in einer Weise, die für bioenergetische Analysen geeignet ist. Die beschriebene Methode bietet die Möglichkeit, PBMCs schonend und in großen Mengen zu isolieren, mit hoher Viabilität und ausreichend Zellen für bioenergetische Messungen. Sie hat den Nachteil, dass es schon bei minimalen Unterbrechungen zu langen Isolationen kommt, die anschließende Kryokonservie.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0)	Self-prepared	-
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer	Self-prepared	-
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1)	Self-prepared	-
1.01 mM DTBB	Self-prepared	-
10 % Triton X-100	Self-prepared	-
10 mM Oxalacetat	Self-prepared	-
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly	Sarstedt	156353_v
37% HCl	Carl Roth GmbH & Co. KG	-
70% Ethanol (EtOH)	Self-prepared	-
Acetyl-CoA	Pancreac Applichem	A3753
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Alcohol wipes			(70% isopropyl alcohol)
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
Aqua (bidest.)	With MilliQ Academic (self-made)	-
Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
ATP-Standard	Sigma-Aldrich	6016949
Biocoll Seperating Solution	Biochrom	6115
Biological safty cabinet MSC Advantage	Thermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell counter TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R	Thermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counter	Bio-Rad	1450016
Cryotube Cryo.S	Grainer Bio-One	126263-2DG
Digitonin	Sigma-Aldrich	37008
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Merck	102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTips	Gilson	F164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x)	Gibco (Thermo Scientific)	15217168
Ethanol (EtOH 100%)	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9065.3
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665
Frezer (-80°C)	Thermo Fisher Scientific Inc.
Glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
Holder/adapter
Incubator Midi 40 CO2	Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringe	Hamilton
Malate	Sigma-Aldrich	M-1000
MIR05	Self-prepared	-
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc.	10110051
Multireader CLARIOstar	BMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plus	Thermo Fisher Scientific Inc.
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876
Oxalacetate	Sigma-Aldrich	-
Oxygraph-2k	Orobororus Instruments
Penicillin-Streptomycin	PAA	15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL	VWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)	Gibco (Thermo Scientific)	11530586
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Saccharose	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9286.2
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD)	Sigma-Aldrich	T3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methane	Sigma-Aldrich	108382
Triton X-100	Sigma-Aldrich	108643
Trypanblau	Biochrom	T6146
Vacuum pump	Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96	Perkin Elmer	6005181
Water bath WNB22	Memmert GmbH & Co. KG