Crioconservazione e valutazione bioenergetica delle cellule mononucleate del sangue periferico umano

Riepilogo

Le cellule mononucleate isolate del sangue periferico possono essere utilizzate per l'analisi delle funzioni e dei disturbi immunitari, delle malattie metaboliche o delle funzioni mitocondriali. In questo lavoro, descriviamo un metodo standardizzato per la preparazione di PBMC da sangue intero e la successiva crioconservazione. La crioconservazione rende questo tempo e questo luogo indipendenti.

Abstract

Le funzioni fisiologiche delle cellule eucariotiche si basano sull'energia fornita principalmente dai mitocondri. La disfunzione mitocondriale è legata alle malattie metaboliche e all'invecchiamento. La fosforilazione ossidativa gioca un ruolo decisivo, in quanto è fondamentale per il mantenimento dell'omeostasi energetica. Le PBMC sono state identificate come un campione minimamente invasivo per misurare la funzione mitocondriale e hanno dimostrato di riflettere le condizioni della malattia. Tuttavia, la misurazione della funzione bioenergetica mitocondriale può essere limitata da diversi fattori nei campioni umani. I limiti sono la quantità di campioni prelevati, il tempo di campionamento, che spesso è distribuito su più giorni, e le posizioni. La crioconservazione dei campioni raccolti può garantire una raccolta e una misurazione coerenti dei campioni. È necessario prestare attenzione per garantire che i parametri misurati siano comparabili tra le cellule crioconservate e quelle appena preparate. Qui, descriviamo i metodi per isolare e crioconservare le PBMC da campioni di sangue umano per analizzare la funzione bioenergetica dei mitocondri in queste cellule. Le PBMC crioconservate secondo il protocollo qui descritto mostrano solo lievi differenze nel numero di cellule e nella vitalità, nei livelli di adenosina trifosfato e nell'attività della catena respiratoria misurata rispetto alle cellule appena raccolte. Per i preparati descritti sono necessari solo 8-24 ml di sangue umano, il che consente di raccogliere campioni durante gli studi clinici in modo multicentralizzato e di determinarne la bioenergetica in loco.

Introduzione

Le cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) sono utilizzate per varie applicazioni in molti campi scientifici, tra cui lo studio di problematiche immunologiche e bioenergetiche, come quelle legate ai processi di invecchiamento o alle malattie degenerative ^1,2. Le PBMC hanno una composizione eterogenea e sono costituite da linfociti (cellule B, cellule T e cellule NK), monociti e cellule dendritiche. Le cellule a volte mostrano grandi differenze e variazioni individuali all'interno di un soggetto, quindi sono necessarie procedure standardizzate per la gestione di queste cellule. Parametri importa....

Protocollo

Tutti i protocolli descritti in questo manoscritto per la raccolta, l'isolamento e l'analisi del sangue sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Review Board dell'Università di Giessen, in Germania. È stato ottenuto il consenso dei pazienti per includere i loro campioni nello studio. Tutte le fasi per l'isolamento e la coltura cellulare vengono eseguite in una cabina di sicurezza biologica.

1. Puntura venosa

1. Preparare tutta l'attrezzatura necessaria per la raccolta del sangue, tra cui spray disinfettante, tampone sterile, cannula per la raccolta del sangue con tubo da 80 mm e adattatore multiplo, laccio....

Discussione

Questo protocollo fornisce un mezzo per isolare e crioconservare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue umano in modo adatto alle analisi bioenergetiche. Il metodo descritto offre la possibilità di isolare le PBMC in modo delicato e in grandi quantità, con un'elevata vitalità e un numero sufficiente di cellule per le misurazioni bioenergetiche. Ha lo svantaggio che anche con interruzioni minime, si verificano lunghi isolamenti, ma la successiva crioconservazione consente una misurazione della .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0)	Self-prepared	-
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer	Self-prepared	-
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1)	Self-prepared	-
1.01 mM DTBB	Self-prepared	-
10 % Triton X-100	Self-prepared	-
10 mM Oxalacetat	Self-prepared	-
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly	Sarstedt	156353_v
37% HCl	Carl Roth GmbH & Co. KG	-
70% Ethanol (EtOH)	Self-prepared	-
Acetyl-CoA	Pancreac Applichem	A3753
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Alcohol wipes			(70% isopropyl alcohol)
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
Aqua (bidest.)	With MilliQ Academic (self-made)	-
Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
ATP-Standard	Sigma-Aldrich	6016949
Biocoll Seperating Solution	Biochrom	6115
Biological safty cabinet MSC Advantage	Thermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell counter TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R	Thermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counter	Bio-Rad	1450016
Cryotube Cryo.S	Grainer Bio-One	126263-2DG
Digitonin	Sigma-Aldrich	37008
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Merck	102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTips	Gilson	F164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x)	Gibco (Thermo Scientific)	15217168
Ethanol (EtOH 100%)	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9065.3
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665
Frezer (-80°C)	Thermo Fisher Scientific Inc.
Glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
Holder/adapter
Incubator Midi 40 CO2	Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringe	Hamilton
Malate	Sigma-Aldrich	M-1000
MIR05	Self-prepared	-
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc.	10110051
Multireader CLARIOstar	BMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plus	Thermo Fisher Scientific Inc.
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876
Oxalacetate	Sigma-Aldrich	-
Oxygraph-2k	Orobororus Instruments
Penicillin-Streptomycin	PAA	15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL	VWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)	Gibco (Thermo Scientific)	11530586
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Saccharose	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9286.2
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD)	Sigma-Aldrich	T3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methane	Sigma-Aldrich	108382
Triton X-100	Sigma-Aldrich	108643
Trypanblau	Biochrom	T6146
Vacuum pump	Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96	Perkin Elmer	6005181
Water bath WNB22	Memmert GmbH & Co. KG