인간 말초 혈액 단핵 세포의 냉동 보존 및 생체 에너지 평가

요약

분리된 말초 혈액 단핵 세포는 면역 기능 및 장애, 대사 질환 또는 미토콘드리아 기능의 분석에 사용할 수 있습니다. 이 연구에서는 전혈에서 PBMC를 준비하고 후속 냉동 보존을 위한 표준화된 방법을 설명합니다. 냉동 보존은 이 시간과 장소를 독립적으로 만듭니다.

초록

진핵 세포의 생리적 기능은 주로 미토콘드리아가 제공하는 에너지에 의존합니다. 미토콘드리아 기능 장애는 대사 질환 및 노화와 관련이 있습니다. 산화적 인산화는 에너지 항상성 유지에 중요하기 때문에 결정적인 역할을 합니다. PBMC는 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 최소 침습 샘플로 확인되었으며 질병 상태를 반영하는 것으로 나타났습니다. 그러나 미토콘드리아 생체 에너지 기능의 측정은 인간 샘플의 여러 요인에 의해 제한될 수 있습니다. 제한 사항은 채취한 샘플의 양, 종종 며칠에 걸쳐 분산되는 샘플링 시간 및 위치입니다. 수집된 샘플의 냉동 보존은 샘플의 일관된 수집 및 측정을 보장할 수 있습니다. 측정된 매개변수가 냉동 보존된 세포와 새로 준비된 세포 간에 비교할 수 있도록 주의해야 합니다. 여기에서는 이러한 세포에서 미토콘드리아의 생체 에너지 기능을 분석하기 위해 인간 혈액 샘플에서 PBMC를 분리하고 냉동 보존하는 방법을 설명합니다. 여기에 설명된 프로토콜에 따라 동결 보존된 PBMC는 갓 수확한 세포와 비교하여 세포 수 및 생존력, 아데노신 삼인산 수치 및 측정된 호흡 사슬 활성에서 약간의 차이만 보여줍니다. 설명된 제제에는 8-24mL의 인간 혈액만 필요하므로 임상 연구 중에 다중앙에서 샘플을 수집하고 현장에서 생체 에너지를 측정할 수 있습니다.

서문

인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 노화 과정이나 퇴행성 질환과 관련된 면역 및 생체 에너지 문제 연구를 포함하여 많은 과학 분야의 다양한 응용 분야에 사용됩니다 ^1,2. PBMC는 구성이 이질적이며 림프구(B 세포, T 세포 및 NK 세포), 단핵구 및 수지상 세포로 구성됩니다. 세포는 때때로 피험자 내에서 큰 개인차와 편차를 보이기 때문에 이러한 세포를 다루기 위한 표준화된 절차가 필요합니다. 분리물의 생존력 및 순도와 같은 중요한 매개변수는 취급을 위한 기본 요구 사항이며 수집 시간, 멜라토닌 수치, 피험자의 공복 여부 등과 같은 환경 요인의 영향을 추가로 받습니다 ^3,4.

PBMC의 생체 에너지학에 대한 연구를 바탕으로 여기서는 다른 방법에도 적합한 PBMC의 분리, 동결 보존 및 배양 방법을 설명합니다. 근육 생검은 미토콘드리아 에너지 대사의 황금 표준으로 간주되지만⁵ 혈액 세포 검사는 빠르고 최소 침습적인 절차입니다. 이 외에도 점점 더 많은 연구에서 노화와 알츠하이머병(AD)의....

프로토콜

이 원고에 설명된 혈액 수집, 분리 및 분석에 대한 모든 프로토콜은 독일 기센 대학의 기관 검토 위원회에서 검토 및 승인했습니다. 연구에 샘플을 포함하는 것에 대한 환자의 동의를 얻었습니다. 분리 및 세포 배양을 위한 모든 단계는 생물 안전 작업대에서 수행됩니다.

1. 정맥 천자

1. 소독 스프레이, 멸균 면봉, 80mm 튜브 및 다중 어댑터가 있는 채혈 캐뉼라, 지혈대/혈압 커프, 모노베트 9mL 리튬-헤파린을 포함하여 채혈에 필요한 모든 장비를 준비합니다.
   참고: 항응고제로서의 EDTA도 효과적입니다.
2. 가장 적절한 팔 정맥, 일반적으로 vena mediana cubiti 또는 vena cephalica에서 혈액을 채취합니다.
3. 약 80mm/Hg의 가벼운 압력으로 지혈대/혈압 커프를 적용합니다.
4. 장갑을 소독하고 알코올이 함유 된 소독 스프레이로 부위를 뚫습니다. 소독된 펑크 부위를 자연 건조시키십시오.
5. 압력 커프의 압력으로 인해 정맥이 돌출됩니다. 외상을 피하고 프로빙을 최소화하기 위해 바늘(캐뉼라 직경(바깥쪽) 21G/0.8mm, 길이 19mm)을 정맥의 15°-20° 각도로 삽입합니다.
6. 9mL의 혈액이 ....

토론

이 프로토콜은 생체 에너지 분석에 적합한 방식으로 인간 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하고 동결 보존하는 수단을 제공합니다. 설명된 방법은 PBMC를 부드럽게 대량으로 분리할 수 있는 가능성을 제공하며, 높은 생존율과 생체 에너지 측정을 위한 충분한 세포를 제공합니다. 최소한의 중단에도 긴 분리가 발생하지만 후속 동결 보존을 통해 생체 에너지학의 시간 독립적인 측정이 가능.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0)	Self-prepared	-
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer	Self-prepared	-
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1)	Self-prepared	-
1.01 mM DTBB	Self-prepared	-
10 % Triton X-100	Self-prepared	-
10 mM Oxalacetat	Self-prepared	-
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly	Sarstedt	156353_v
37% HCl	Carl Roth GmbH & Co. KG	-
70% Ethanol (EtOH)	Self-prepared	-
Acetyl-CoA	Pancreac Applichem	A3753
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Alcohol wipes			(70% isopropyl alcohol)
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
Aqua (bidest.)	With MilliQ Academic (self-made)	-
Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
ATP-Standard	Sigma-Aldrich	6016949
Biocoll Seperating Solution	Biochrom	6115
Biological safty cabinet MSC Advantage	Thermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell counter TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R	Thermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counter	Bio-Rad	1450016
Cryotube Cryo.S	Grainer Bio-One	126263-2DG
Digitonin	Sigma-Aldrich	37008
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Merck	102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTips	Gilson	F164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x)	Gibco (Thermo Scientific)	15217168
Ethanol (EtOH 100%)	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9065.3
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665
Frezer (-80°C)	Thermo Fisher Scientific Inc.
Glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
Holder/adapter
Incubator Midi 40 CO2	Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringe	Hamilton
Malate	Sigma-Aldrich	M-1000
MIR05	Self-prepared	-
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc.	10110051
Multireader CLARIOstar	BMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plus	Thermo Fisher Scientific Inc.
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876
Oxalacetate	Sigma-Aldrich	-
Oxygraph-2k	Orobororus Instruments
Penicillin-Streptomycin	PAA	15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL	VWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)	Gibco (Thermo Scientific)	11530586
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Saccharose	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9286.2
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD)	Sigma-Aldrich	T3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methane	Sigma-Aldrich	108382
Triton X-100	Sigma-Aldrich	108643
Trypanblau	Biochrom	T6146
Vacuum pump	Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96	Perkin Elmer	6005181
Water bath WNB22	Memmert GmbH & Co. KG