Cryoconservation et évaluation bioénergétique des cellules mononucléées du sang périphérique humain

Résumé

Les cellules mononucléées isolées du sang périphérique peuvent être utilisées pour l’analyse des fonctions et des troubles immunitaires, des maladies métaboliques ou des fonctions mitochondriales. Dans ce travail, nous décrivons une méthode standardisée pour la préparation de PBMC à partir de sang total et la cryoconservation ultérieure. La cryoconservation rend ce temps et ce lieu indépendants.

Résumé

Les fonctions physiologiques des cellules eucaryotes reposent sur l’énergie principalement fournie par les mitochondries. Le dysfonctionnement mitochondrial est lié aux maladies métaboliques et au vieillissement. La phosphorylation oxydative joue un rôle décisif, car elle est cruciale pour le maintien de l’homéostasie énergétique. Les PBMC ont été identifiés comme un échantillon peu invasif pour mesurer la fonction mitochondriale et il a été démontré qu’ils reflètent les conditions de la maladie. Cependant, la mesure de la fonction bioénergétique mitochondriale peut être limitée par plusieurs facteurs dans des échantillons humains. Les limites sont la quantité d’échantillons prélevés, le temps d’échantillonnage, qui s’étale souvent sur plusieurs jours, et les emplacements. La cryoconservation des échantillons prélevés peut assurer une collecte et une mesure cohérentes des échantillons. Il faut veiller à ce que les paramètres mesurés soient comparables entre les cellules cryoconservées et les cellules fraîchement préparées. Ici, nous décrivons des méthodes d’isolement et de cryoconservation des PBMC à partir d’échantillons de sang humain afin d’analyser la fonction bioénergétique des mitochondries dans ces cellules. Les PBMC cryoconservés selon le protocole décrit ici ne montrent que des différences mineures dans le nombre et la viabilité des cellules, les niveaux d’adénosine triphosphate et l’activité mesurée de la chaîne respiratoire par rapport aux cellules fraîchement récoltées. Seulement 8 à 24 mL de sang humain sont nécessaires pour les préparations décrites, ce qui permet de prélever des échantillons lors d’études cliniques de manière multicentralisée et de déterminer leur bioénergétique sur place.

Introduction

Les cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC) sont utilisées pour diverses applications dans de nombreux domaines scientifiques, y compris l’étude de questions immunologiques et bioénergétiques, telles que celles liées aux processus de vieillissement ou aux maladies dégénératives ^1,2. Les PBMC ont une composition hétérogène et se composent de lymphocytes (lymphocytes B, lymphocytes T et cellules NK), de monocytes et de cellules dendritiques. Les cellules présentent parfois de grandes différences et variations individuelles au sein d’un sujet, de sorte que des procédures standardisées pour la manipulation de ces cellules sont nécessaires. Des paramètres importants tels que la viabilité et la pureté de l’isolant sont les exigences de base pour sa manipulation et sont en outre influencés par des facteurs environnementaux tels que le moment de la collecte, le niveau de mélatonine, si le sujet est à jeun, etc. ^3,4.

Sur la base d’études sur la bioénergétique des PBMCs, nous décrivons ici une méthode d’isolement, de cryoconservation et de culture des PBMCs qui convient également à d’autres méthodes. Alors que la biopsie musculaire est considérée comme l’étalon-or pour le métabolisme énergétique mitochondrial⁵, l’examen des cellules sanguines est une procédure rapide et peu invasive. En plus de cela, de plus en plus d’études suggèrent que les changements dans la fonction mitochondriale dans le vieillissement et la maladie d’Alzheimer (MA) se produisent non seulement dans le cerveau mais aussi dans la périphérie 6,7,8,9,10. La méthode permet également d’étudier d’autres affections et maladies, notamment le diabète sucré et l’obésité 11,12,13. Les modèles d’expression génique chez les patients atteints de sclérose en plaques peuvent être analysés, ou la fonction immunitaire et les influences sur celle-ci en général 14,15,16.

Les PBMC s’appuient généralement sur la phosphorylation oxydative (OXPHOS) pour générer de l’adénosine triphosphate (ATP)^17,18. Par conséquent, les PBMC couvrent un large éventail d’applications en tant que substituts. Dans des rapports précédents, le métabolisme énergétique des PBMC a été utilisé pour traiter des dysfonctionnements d’organes, tels que l’insuffisance cardiaque précoce¹⁹, le choc septique²⁰ ou les différences associées au sexe⁴ dans la fonction mitochondriale. Une méthode généralisée de cryoconservation, d’isolement et de culture des PBMC présenterait des avantages dans la comparabilité des résultats obtenus dans différents instituts. Il y a beaucoup de variations dans les protocoles pour chaque étape^21,22, le but de cette méthode est de fournir une ligne directrice pour les mesures bioénergétiques dans les PBMC.

Dans cet article, nous décrivons une méthode de mesure des paramètres bioénergétiques dans les PBMC. Nous expliquons les méthodes d’isolement, de cryoconservation et de mesure de la bioénergétique des PBMC à partir du sang humain. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer les paramètres bioénergétiques chez les patients et les évaluer dans un contexte clinique. Pour appliquer ces mesures, les chercheurs ont besoin d’avoir accès à une population de patients à partir de laquelle des échantillons de sang frais peuvent être obtenus.

Protocole

Tous les protocoles décrits dans ce manuscrit pour la collecte, l’isolement et l’analyse du sang ont été examinés et approuvés par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Giessen, en Allemagne. Le consentement des patients à inclure leurs échantillons dans l’étude a été obtenu. Toutes les étapes d’isolement et de culture cellulaire sont effectuées sous une enceinte de sécurité biologique.

1. Ponction veineuse

1. Préparez tout l’équipement nécessaire à la collecte de sang, y compris le vaporisateur de désinfection, l’écouvillon stérile, la canule de prélèvement sanguin avec tube de 80 mm et multi-adaptateur, le garrot / brassard de tensiomètre, la monovette 9 ml de lithium-héparine.
   REMARQUE : L’EDTA en tant qu’anticoagulant est également efficace.
2. Prélevez du sang dans la veine du bras la plus appropriée, généralement la veine médiane cubiti ou la veine céphalique.
3. Appliquer un garrot/brassard de tensiomètre avec une légère pression, autour de 80 mm/Hg.
4. Désinfectez les gants et le site de ponction avec un spray désinfectant contenant de l’alcool. Laissez le site de ponction désinfecté sécher à l’air libre.
5. Les veines font saillie en raison de la pression du brassard de pression. Insérez l’aiguille (diamètre de la canule (extérieur) 21G / 0,8 mm, longueur 19 mm) à un angle de 15°-20° de la veine en essayant d’éviter le traumatisme et en minimisant le sondage.
6. Prélever du sang avec le système approprié, 4 tubes contenant 9 mL de sang (plus de 7 à 8 tubes sont difficiles à isoler correctement pour un expérimentateur).
7. Après le prélèvement sanguin, placez les tubes de prélèvement dans l’obscurité pendant 5 min pour assurer une anticoagulation uniforme.

2. Isolement PBMC

1. Préparez toutes les solutions nécessaires comme décrit ci-dessous.
2. Amener la solution saline équilibrée de Dulbecco (DPBS ; concentration 1x) et le milieu d’isolement lymphocytaire (1,077 g/mL) à température ambiante (20-25 °C).
3. Préparer le sérum de veau fœtal (FBS) à température ambiante et conserver un tube conique stérile de 50 mL avec FBS sur de la glace. Pour chaque échantillon de sang, 2 mL de FBS sont nécessaires.
4. Conserver le récipient de congélation à 4 °C et prérefroidir les cryotubes à 4 °C.
5. Milieu de culture cellulaire chaud à 37 °C, le milieu se compose de RPMI 1640 avec 50 mL de FBS et de pénicilline 50 U/mL de streptomycine 50 U/mL. Cette solution peut être conservée à 3 °C jusqu’à 2 mois.
6. Ajouter 8 mL de DPBS dans des tubes coniques stériles de 50 mL. Ajouter 15 mL de milieu d’isolement lymphocytaire dans un tube conique stérile de 50 mL (le milieu est sensible à la lumière, ajoutez-le avant de commencer l’isolement).
7. Ajouter 8 mL de sang à 8 mL de DPBS et mélanger soigneusement avec une pipette Pasteur en plastique de 3 mL.
8. Superposer délicatement le mélange sang/DPBS à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique de 3 ml sur le milieu d’isolement lymphocytaire. Pour appliquer la première couche sur le milieu, inclinez le tube de 20° à 30°, ce qui réduira la pénétration du mélange sang-PBS dans la couche moyenne.
9. Superposez soigneusement le mélange sang-PBS sur la paroi latérale du tube sur le milieu d’isolement lymphocytaire. Utilisez une vitesse constante pour maintenir le flux sanguin constant.
10. À l’étape suivante, amenez lentement le tube en position verticale, le sang restant est soigneusement superposé sur la paroi latérale du tube sur la couche de sang.
11. Centrifuger pendant 10 min à 1000 x g à température ambiante dans une centrifugeuse avec rotor à godets oscillants avec freins désactivés. Après centrifugation, le mélange sang/PBMC est séparé en quatre couches. La couche supérieure est constituée de plasma et de plaquettes, la deuxième couche est la couche PBMC, suivie d’une couche moyenne d’isolement des lymphocytes et, enfin, d’érythrocytes et de granulocytes dans la couche inférieure. Les différentes couches sont illustrées à la figure 1.
12. Prélever les 2/^{3 de} la couche plasmatique à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique.
13. À l’aide d’une pipette de 1 mL, prélever les PBMC sur la couche de milieu d’isolement lymphocytaire en prenant soin de ne pas mettre de milieu dans l’échantillon.
14. Placez la pointe à 1 mm au-dessus de la couche PBMC. La couche PBMC ne doit pas être perforée, sinon le milieu s’écoulera sur les cellules. L’aspiration de la pipette tire les PBMC jusqu’à ce point, de sorte qu’ils peuvent être collectés plusieurs fois à ce stade.
    REMARQUE : Pour maximiser le nombre de PBMC collectés, à la fin de la procédure, recherchez le reste sur la surface et essayez de collecter les cellules là aussi. Pour stabiliser la procédure, le tube peut être placé sur une surface.
15. Transférez les PBMC étape par étape dans un nouveau tube de 50 ml jusqu’à ce que la couche soit complètement récoltée. Ajouter le DPBS jusqu’à 25 mL, laver le milieu d’isolement lymphocytaire et les autres résidus.
16. Centrifuger pendant 10 min à 100 x g à température ambiante avec les freins activés. Retirez le surnageant à l’aide d’une pompe à vide ou similaire, veillez à ne pas endommager la pastille de cellule.
17. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de DPBS et ajouter le DPBS jusqu’à la marque de 25 mL. Répétez le lavage une fois de plus, puis remettez-le en suspension dans un milieu approprié pour les étapes suivantes.

Figure 1 : Représentation schématique d’une centrifugation à gradient de densité pour illustrer les différentes couches. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Cryoconservation

1. Refroidir un récipient de congélation à 4 °C, laisser refroidir le FBS sur de la glace.
2. Remettre en suspension la pastille PBMC dans 1 mL de FBS à l’aide d’une pipette de 1 mL, le FBS doit être à température ambiante.
3. Mélangez le DMSO avec le FBS pré-refroidi sur de la glace 1 :5, concentration finale 20% de DMSO, puis remettez le mélange FBS : DMSO sur la glace. Préparez toujours la solution fraîche.
4. Transférez la suspension cellulaire PBMC dans du FBS dans des cryotubes de 2 ml bien étiquetés. Utilisez un cryotube par tube de prélèvement. Ajustez le nombre de cellules entre 1 x 10⁷ et 5 x 10⁷ par mL. Utilisez un compteur de cellules automatisé pour déterminer le nombre de cellules et leur viabilité.
5. Ajouter 1 mL de mélange FBS : DMSO goutte à goutte avec une pipette de 1 mL, environ 1 à 2 gouttes par s, dans le tube. L’ajout goutte à goutte permet d’obtenir un mélange continu et constant.
6. Placez les tubes dans le récipient de congélation prérefroidi. Placez le récipient de congélation dans un congélateur à -80 °C pendant 24 h. Le récipient de congélation assure un refroidissement contrôlé de -1 °C par minute.
7. Sortez les tubes du congélateur à -80 °C. Après avoir été retirés du congélateur, conservez les tubes en phase gazeuse d’azote liquide. Documentez l’emplacement de chaque échantillon.

4. Décongélation

1. Préparer toutes les solutions nécessaires : Milieu de culture cellulaire RPMI 1640 avec 50 mL de FBS et pénicilline 50 U/mL, streptomycine 50 U/mL. Cette solution peut être conservée à 3°C jusqu’à 2 mois.
2. Préchauffer le milieu de culture cellulaire à 37 °C. Ajouter 3 mL de milieu de culture cellulaire préchauffé dans des tubes coniques stériles de 50 mL.
3. Retirer l’échantillon du réservoir d’azote liquide. Décongeler les échantillons au bain-marie à 37 °C pendant env. 3,5 min, les retirer du bain-marie dès que la dernière glace a fondu. Un morceau de glace de la taille d’une tête d’épingle doit toujours être visible dans le tube.
   REMARQUE : Le DMSO est nocif pour le travail des PBMC aussi rapidement que possible.
4. Retirez le mélange cellule :FBS :DMSO avec une pipette de 1 ml du cryotube. Mélanger les échantillons PBMC avec le milieu de culture cellulaire dans les tubes de 50 ml préparés. Lavez les tubes avec 5 ml de milieu de culture en trois étapes de 2 ml, 2 ml et 1 ml.
5. Transférez le milieu dans les tubes. Ceci est effectué pour transférer d’éventuels résidus cellulaires. Centrifuger pendant 10 min à 100 x g à température ambiante.
6. Jeter le surnageant et ajouter 1 mL de milieu approprié à l’utilisation prévue. Les cellules sont prêtes pour les expériences ultérieures.
   REMARQUE : Cependant, dans le cas de tests fonctionnels sur des cellules fraîches ou congelées, une période de repos dans un incubateur (généralement pendant la nuit) est souvent recommandée après l’isolement des lymphocytes à base de milieu ou la décongélation des cellules.

5. Culture cellulaire

1. Après isolement ou décongélation des cellules de culture, une nuit à 37 °C dans de l’air à 5 % de CO₂/95 %.
2. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu RPMI complété par 10 % de FBS, péniciline 50 U/mL, streptomycine 50 U/mL. Pour une utilisation ultérieure, il existe de nombreuses possibilités, traiter les cellules au besoin pour les tests.
3. Pour le stockage général, utilisez des plaques de culture cellulaire stériles à 6 puits et des cellules de récolte après la période de repos. Transférez 1 mL de suspension cellulaire à l’aide d’une pipette de 1 mL dans un puits et ajoutez 4 mL de milieu de culture cellulaire.
   REMARQUE : La quantité de PBMC isolée varie considérablement d’un individu à l’autre, un puits avec 5 mL de milieu de culture cellulaire est suffisant pour chaque 8 mL de sang isolé. Cependant, lors de l’isolement des PBMC des couches leucocytes, la quantité de PBMC est significativement plus élevée que dans les échantillons de sang total et les cellules doivent donc être divisées en plusieurs puits.
4. Laisser reposer les cellules 24 h dans une atmosphère humidifiée complétée par 5 % de CO₂ à 37 °C. Cette incubation est réalisée pour les cellules fraîchement isolées, ainsi que pour les cellules cryoconservées.

6. Test de l’ATP

1. Remettre en suspension les PBMC décongelés dans 1 mL de milieu RPMI supplémenté en FBS à 10 %, pénicilline 50 U/mL, streptomycine 50 U/mL.
2. Prélevez un échantillon et déterminez le nombre de cellules, puis effectuez une discrimination vivante-morte avec du bleu de trypan. Prélever 10 μL des cellules remises en suspension et mélanger avec un milieu de culture cellulaire de 90 μL. Ensuite, prenez 10 μL et mélangez avec 10 μL de bleu de trypan. Placez les cellules soit dans une chambre de comptage de cellules, soit dans un compteur automatique de cellules et déterminez le nombre de cellules vivantes/mortes.
3. Plaquer 100 μL de cellules à une densité de 1 x 10⁵ cellules/100 μL par puits dans une plaque de polystyrène blanc à 96 puits.
4. Laisser reposer les cellules pendant 24 h dans une atmosphère humidifiée complétée par 5 % de CO₂ à 37 °C.
5. Déterminer les concentrations d’ATP à l’aide d’un test d’ATP.
   1. Utilisez l’émission de lumière qui se produit lorsque l’ATP est combiné avec la luciférine. La lumière émise peut être évaluée à l’aide d’un lecteur de plaques. Retirez les plaques pour que l’incubateur refroidisse à température ambiante pendant 15 minutes. Lysez les cellules et laissez-les pendant 5 min. Appliquez ensuite un réactif de surveillance sur les cellules et mesurez selon les instructions du fabricant. Une norme interne est utilisée pour déterminer le niveau d’ATP.

7. Respirométrie à haute résolution

1. Allumez l’oxygraphe haute résolution et laissez-le se réchauffer pendant 30 minutes.
2. Traiter les cellules selon un protocole décrit à la figure 1. Préparez tous les stocks nécessaires comme indiqué dans le tableau 1.
3. Pipeter 2,1 mL de tampon respiratoire (tableau 1) dans les deux chambres d’oxygraphe à haute résolution et agiter le tampon en continu à l’aide d’une barre d’agitation magnétique présente dans les chambres (750 tr/min) à 37 °C pendant 30 min jusqu’à l’obtention d’un signal de flux d’oxygène stable du capteur d’oxygène polarographique.
   REMARQUE : Dans les chambres de l’oxygraphe, la consommation d’oxygène en temps réel (flux) et la saturation en oxygène de la chambre sont mesurées à l’aide d’électrodes d’oxygène polarographiques. L’étalonnage de l’arrière-plan doit être effectué pour éviter les bruits de fond et garantir des résultats fiables.
4. Effectuer un étalonnage de l’air du capteur d’oxygène polarographique selon les protocoles du fabricant²³.
5. Remettre en suspension les PBMC isolés dans 1 mL de milieu respiratoire mitochondrial (MIR05, la composition est indiquée dans le tableau 1) et diluer à 8 x 10⁶ cellules/mL.
6. Après l’étalonnage de l’air, aspirer le milieu respiratoire de la chambre de l’oxygraphe et ajouter 2,1 mL de suspension cellulaire dans chaque cambrure du respiromètre. S’il est nécessaire de réoxygéner les chambres pendant la mesure (voir Ouvrir au point h de la figure 2), la saturation en oxygène des chambres ne doit pas descendre en dessous de 100 μM.
7. Fermez les chambres en insérant les bouchons, les chambres sont conçues pour contenir un volume de 2,0 mL. Aspirer la suspension cellulaire émergente.
8. Mélanger en continu la suspension cellulaire à 37 °C avec un agitateur magnétique (750 tr/min) situé dans la chambre. Attendez environ 20 min jusqu’à l’obtention d’un signal stable. Déterminer la respiration endogène ((a) dans la figure 2).
9. Pour déterminer les différentes activités complexes de la chaîne respiratoire, injecter les substrats et les inhibiteurs de la respiration mitochondriale à travers les orifices d’injection en titane des bouchons. Utilisez la concentration finale suivante dans la chambre.
10. Pour perturber les membranes cellulaires, ajouter 5 μL de digitonine de 8,1 mM, à travers l’orifice d’injection en titane du bouchon de la chambre, pour éliminer les substrats naïfs (b) de la figure 2 tandis que les membranes mitochondriales restent intactes.
11. Ajouter des substrats de 2 M de glutamate et 800 mM de malate à travers l’orifice d’injection du bouchon de la chambre et enregistrer la respiration jusqu’à ce qu’un signal stable soit obtenu. Le signal se stabilise au bout de 2 à 4 minutes.
    REMARQUE : Il est également possible d’utiliser des substrats supplémentaires comme le pyruvate.
12. Ajouter 8 μL d’adénosine diphosphate (ADP) de 500 mM à travers l’orifice d’injection du bouchon de la chambre et enregistrer la respiration jusqu’à l’obtention d’un signal stable. Le signal se stabilise après 2 à 4 min (d) dans la figure 2.
13. Ajouter 20 μL de succinate 1 M à travers l’orifice d’injection du bouchon de la chambre et enregistrer la respiration jusqu’à l’obtention d’un signal stable. Le signal se stabilise après 2 à 4 min (e) dans la figure 2.
14. Titrer 1 M de cyanure de carbonyle p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (PCFC) par étapes à raison de 0,5 μL jusqu’au point où il n’y a plus d’augmentation. Attendez 2 à 4 minutes jusqu’à ce que le signal se stabilise (f) dans la Figure 2. Lorsqu’il n’y a plus d’augmentation de la respiration, passez à l’étape suivante.
    ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous manipulez le FCCP car il présente des risques pour la santé humaine.
15. Ajouter 5 μL de roténone à 0,1 mM à travers l’orifice d’injection du bouchon de la chambre et enregistrer la respiration jusqu’à l’obtention d’un signal stable. Le signal se stabilise après 2 à 4 min (g) dans la figure 2.
    ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous manipulez de la roténone car elle présente des risques pour la santé humaine.
16. Ajouter 1 μL d’oligomycine à 4 mg/mL par l’orifice d’injection du bouchon de la chambre et enregistrer la respiration jusqu’à l’obtention d’un signal stable. Le signal se stabilise après 2 à 4 min (h) dans la figure 2.
    ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous manipulez de l’oligomycine car il s’agit d’un poison qui présente des risques pour la santé humaine.
17. Ajouter 1 μL d’antimycine A à 5 mM par l’orifice d’injection du bouchon de la chambre et enregistrer la respiration jusqu’à l’obtention d’un signal stable. Le signal se stabilise après 2 à 4 min (i) dans la figure 2.
    ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous manipulez de l’antimycine A car il s’agit d’un poison qui présente des risques pour la santé humaine.
18. Lors de l’évaluation de l’essai pour exclure la consommation d’oxygène des enzymes non impliquées dans la phosphorylation oxydative, soustraire les valeurs d’antimycine A de toutes les autres valeurs mesurées.
19. Ajouter 200 mM DE DICHLORHYDRATE DE TÉTRAMÉTHYL-P-PHÉNYLÈNEDIAMINE (TMPD ; donneur d’électrons) et 800 mM d’ascorbate pour maintenir le TMPD dans un état réduit. Injectez les substrats à travers l’orifice d’injection du bouchon de la chambre et enregistrez la respiration jusqu’à ce qu’un signal stable soit obtenu. Le signal se stabilise après 2 à 4 min (j) dans la figure 2.
20. Le TMPD est sujet à l’auto-oxydation, il faut donc soustraire la consommation d’oxygène résultante de la valeur mesurée au complexe IV.
21. Ajoutez_{NaN 3} ≥ 100 mM à travers l’orifice d’injection du bouchon de la chambre et enregistrez la respiration jusqu’à ce qu’un signal stable soit atteint. Le signal se stabilise après 2 à 4 minutes pour inhiber l’activité IV complexe, il ne reste que l’auto-oxydation TMPD.
    ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous manipulez de l’azoture de sodium car il s’agit d’un poison qui présente des risques pour la santé humaine.

Figure 2 : Évolution schématique du flux d’O2. Le déroulement schématique du flux d’oxygène est représenté. La courbe est divisée en différentes phases après l’ajout d’inhibiteurs et de substrats de a-k. a : respiration endogène ; b : cellules perméabilisées ; c : respiration complexe I découplée ; d : respiration couplée complexe I ; e : OXPHOS ; f : activité maximale non couplée de l’IC et de l’IC ; g : respiration non couplée du complexe II ; h : respiration par fuite ; i : respiration résiduelle ; j : Respiration découplée CIV_(U) et auto-oxydation du TMPD ; k : auto-oxydation du TMPD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

8. Activité de la citrate synthase

1. Mesurez l’activité de la citrate synthase en tant que paramètre distinct et utilisez-le pour normaliser les mesures de l’oxygraphe à haute résolution.
2. Remettre en suspension le PBMC isolé dans 1 mL de milieu respiratoire mitochondrial (MIR05) et diluer à 8 x 10⁶ cellules/mL.
3. Congeler dans de l’azote liquide et conserver à −80 °C jusqu’à ce que des expériences soient menées ou pour mesurer des cellules fraîches.
4. Préparez toutes les solutions nécessaires : tampon HCl de triéthanolamine de 0,1 M pH 8,0, tampon de tris-HCl de 1,0 M pH = 8,1, Triton X-100 à 10 %, 10 mM d’oxacétate dans un tampon de triéthanolamine HCl à 0,1 M pH 8,0, DTNB de 1,01 mM dans un tampon de Tris-HCl à 1,0 M pH = 8,1, acétyl-CoA 12,2 mM dans H₂O distillé en double.
5. Préparer un milieu réactionnel (tableau 1) contenant du 5,5'-dithio-bis-(acide 2-nitrobézoïque) (DTNB ; 0,1 mM), de l’acétylcoenzyme A (0,31 mM), de l’EDTA (50 μM), de la triéthanolamine HCl (5 mM) et du Tris HCl (0,1 M).
6. Préparer le réactif de départ (tableau 1) avec 0,5 mM d’oxaloacétate dissous dans du H₂O distillé deux fois.
7. Décongelez les échantillons sur de la glace, car la citrate synthase est instable si elle est décongelée trop rapidement.
8. Ajouter 40 μL d’échantillons à une plaque de 96 puits sur de la glace avant d’ajouter 110 μL de milieu réactionnel à l’aide d’une multipipette.
9. Chauffer le milieu de réaction et l’échantillon dans un incubateur à 30 °C pendant 5 min. Réchauffer le réactif de départ au bain-marie à 30 °C pendant 5 min.
10. Ajouter 50 μL du réactif de départ à l’aide d’une multipipette dans chaque puits. Mesure de l’absorbance à 30 °C à une longueur d’onde de 412 nm pendant 20 min à l’aide d’un lecteur de plaques.

Résultats

Viabilité et nombre de cellules
Pour réussir l’isolement et la cryoconservation, le nombre et la viabilité des cellules doivent être aussi élevés que possible. Avant et après la cryoconservation, les cellules sont comptées et leur viabilité est déterminée pour assurer la santé et la qualité des cellules. La figure 3 est une illustration représentative des PBMC avant et après cryoconservation, le nombre de cellules et la viabilité ne diffèrent guère. Ce...

Discussion

Ce protocole permet d’isoler et de cryoconserver les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) du sang humain d’une manière adaptée aux analyses bioénergétiques. La méthode décrite offre la possibilité d’isoler les PBMC en douceur et en grande quantité, avec une viabilité élevée et suffisamment de cellules pour les mesures bioénergétiques. Il présente l’inconvénient que, même avec un minimum d’interruptions, de longs isolements se produisent, mais la cryoconservation ultérieure perm...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0)	Self-prepared	-
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer	Self-prepared	-
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1)	Self-prepared	-
1.01 mM DTBB	Self-prepared	-
10 % Triton X-100	Self-prepared	-
10 mM Oxalacetat	Self-prepared	-
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly	Sarstedt	156353_v
37% HCl	Carl Roth GmbH & Co. KG	-
70% Ethanol (EtOH)	Self-prepared	-
Acetyl-CoA	Pancreac Applichem	A3753
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Alcohol wipes			(70% isopropyl alcohol)
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
Aqua (bidest.)	With MilliQ Academic (self-made)	-
Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
ATP-Standard	Sigma-Aldrich	6016949
Biocoll Seperating Solution	Biochrom	6115
Biological safty cabinet MSC Advantage	Thermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell counter TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R	Thermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counter	Bio-Rad	1450016
Cryotube Cryo.S	Grainer Bio-One	126263-2DG
Digitonin	Sigma-Aldrich	37008
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Merck	102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTips	Gilson	F164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x)	Gibco (Thermo Scientific)	15217168
Ethanol (EtOH 100%)	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9065.3
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665
Frezer (-80°C)	Thermo Fisher Scientific Inc.
Glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
Holder/adapter
Incubator Midi 40 CO2	Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringe	Hamilton
Malate	Sigma-Aldrich	M-1000
MIR05	Self-prepared	-
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc.	10110051
Multireader CLARIOstar	BMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plus	Thermo Fisher Scientific Inc.
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876
Oxalacetate	Sigma-Aldrich	-
Oxygraph-2k	Orobororus Instruments
Penicillin-Streptomycin	PAA	15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL	VWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)	Gibco (Thermo Scientific)	11530586
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Saccharose	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9286.2
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD)	Sigma-Aldrich	T3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methane	Sigma-Aldrich	108382
Triton X-100	Sigma-Aldrich	108643
Trypanblau	Biochrom	T6146
Vacuum pump	Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96	Perkin Elmer	6005181
Water bath WNB22	Memmert GmbH & Co. KG