Cryoconservation et évaluation bioénergétique des cellules mononucléées du sang périphérique humain

Résumé

Les cellules mononucléées isolées du sang périphérique peuvent être utilisées pour l’analyse des fonctions et des troubles immunitaires, des maladies métaboliques ou des fonctions mitochondriales. Dans ce travail, nous décrivons une méthode standardisée pour la préparation de PBMC à partir de sang total et la cryoconservation ultérieure. La cryoconservation rend ce temps et ce lieu indépendants.

Résumé

Les fonctions physiologiques des cellules eucaryotes reposent sur l’énergie principalement fournie par les mitochondries. Le dysfonctionnement mitochondrial est lié aux maladies métaboliques et au vieillissement. La phosphorylation oxydative joue un rôle décisif, car elle est cruciale pour le maintien de l’homéostasie énergétique. Les PBMC ont été identifiés comme un échantillon peu invasif pour mesurer la fonction mitochondriale et il a été démontré qu’ils reflètent les conditions de la maladie. Cependant, la mesure de la fonction bioénergétique mitochondriale peut être limitée par plusieurs facteurs dans des échantillons humains. Les limites sont la quantité d’échantillons prélevés, le temps d’échantillonnage, qui s’étale souvent sur plusieurs jours, et les emplacements. La cryoconservation des échantillons prélevés peut assurer une collecte et une mesure cohérentes des échantillons. Il faut veiller à ce que les paramètres mesurés soient comparables entre les cellules cryoconservées et les cellules fraîchement préparées. Ici, nous décrivons des méthodes d’isolement et de cryoconservation des PBMC à partir d’échantillons de sang humain afin d’analyser la fonction bioénergétique des mitochondries dans ces cellules. Les PBMC cryoconservés selon le protocole décrit ici ne montrent que des différences mineures dans le nombre et la viabilité des cellules, les niveaux d’adénosine triphosphate et l’activité mesurée de la chaîne respiratoire par rapport aux cellules fraîchement récoltées. Seulement 8 à 24 mL de sang humain sont nécessaires pour les préparations décrites, ce qui permet de prélever des échantillons lors d’études cliniques de manière multicentralisée et de déterminer leur bioénergétique sur place.

Introduction

Les cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC) sont utilisées pour diverses applications dans de nombreux domaines scientifiques, y compris l’étude de questions immunologiques et bioénergétiques, telles que celles liées aux processus de vieillissement ou aux maladies dégénératives ^1,2. Les PBMC ont une composition hétérogène et se composent de lymphocytes (lymphocytes B, lymphocytes T et cellules NK), de monocytes et de cellules dendritiques. Les cellules présentent parfois de grandes différences et variations individuelles au sein d’un sujet, de sorte que des procédures standardisées pour la man....

Protocole

Tous les protocoles décrits dans ce manuscrit pour la collecte, l’isolement et l’analyse du sang ont été examinés et approuvés par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Giessen, en Allemagne. Le consentement des patients à inclure leurs échantillons dans l’étude a été obtenu. Toutes les étapes d’isolement et de culture cellulaire sont effectuées sous une enceinte de sécurité biologique.

1. Ponction veineuse

1. Préparez tout l’équipement nécessaire à la collecte de sang, y compris le vaporisateur de désinfection, l’écouvillon stérile, la canule de prélèvement sanguin avec tube de 80 mm et multi-adaptate....

Discussion

Ce protocole permet d’isoler et de cryoconserver les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) du sang humain d’une manière adaptée aux analyses bioénergétiques. La méthode décrite offre la possibilité d’isoler les PBMC en douceur et en grande quantité, avec une viabilité élevée et suffisamment de cellules pour les mesures bioénergétiques. Il présente l’inconvénient que, même avec un minimum d’interruptions, de longs isolements se produisent, mais la cryoconservation ultérieure perm.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0)	Self-prepared	-
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer	Self-prepared	-
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1)	Self-prepared	-
1.01 mM DTBB	Self-prepared	-
10 % Triton X-100	Self-prepared	-
10 mM Oxalacetat	Self-prepared	-
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly	Sarstedt	156353_v
37% HCl	Carl Roth GmbH & Co. KG	-
70% Ethanol (EtOH)	Self-prepared	-
Acetyl-CoA	Pancreac Applichem	A3753
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Alcohol wipes			(70% isopropyl alcohol)
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
Aqua (bidest.)	With MilliQ Academic (self-made)	-
Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
ATP-Standard	Sigma-Aldrich	6016949
Biocoll Seperating Solution	Biochrom	6115
Biological safty cabinet MSC Advantage	Thermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell counter TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R	Thermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counter	Bio-Rad	1450016
Cryotube Cryo.S	Grainer Bio-One	126263-2DG
Digitonin	Sigma-Aldrich	37008
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Merck	102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTips	Gilson	F164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x)	Gibco (Thermo Scientific)	15217168
Ethanol (EtOH 100%)	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9065.3
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665
Frezer (-80°C)	Thermo Fisher Scientific Inc.
Glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
Holder/adapter
Incubator Midi 40 CO2	Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringe	Hamilton
Malate	Sigma-Aldrich	M-1000
MIR05	Self-prepared	-
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc.	10110051
Multireader CLARIOstar	BMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plus	Thermo Fisher Scientific Inc.
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876
Oxalacetate	Sigma-Aldrich	-
Oxygraph-2k	Orobororus Instruments
Penicillin-Streptomycin	PAA	15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL	VWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)	Gibco (Thermo Scientific)	11530586
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Saccharose	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9286.2
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD)	Sigma-Aldrich	T3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methane	Sigma-Aldrich	108382
Triton X-100	Sigma-Aldrich	108643
Trypanblau	Biochrom	T6146
Vacuum pump	Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96	Perkin Elmer	6005181
Water bath WNB22	Memmert GmbH & Co. KG