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要約

このプロトコルは、侵入植物の根におけるアーバスキュラー菌根菌(AMF)のコロニー形成率を決定するためのシンプルで使いやすいアプローチを提供します。

要約

アーバスキュラー菌根菌(AMF)は、生態系に広く分布する土壌菌類であり、ほとんどの陸生植物の根と共生関係(菌根)を形成することができます。植物は菌根の会合を通じてAMFに炭素源を供給し、AMF菌糸は根による栄養吸収の範囲を拡大し、植物の栄養素の取り込みを促進することができます。AMFにはさまざまな種があり、AMFの異なる種と異なる植物との間の共生関係は異なります。侵入植物は、根の滲出液を通じてAMF種をより優れた共生能力で豊かにし、成長を促進し、それによって侵入植物の根でのコロニー形成を増加させることができます。同時に、侵入植物はAMFと在来植物との共生関係を乱し、地元の植物群集に影響を与える可能性があり、これは植物の侵入を成功させるためのメカニズムの1つです。侵入植物と在来植物の根におけるAMFの定着率は、侵入植物の侵入過程におけるAMFの役割を間接的に反映しています。この方法では、収集した植物の根を直接処理するか、または後のバッチ処理のために固定剤に保存することができます。根の脱色、酸性化、染色、および脱染処理により、根系内のAMFの菌糸、胞子、およびアーバスキュラー構造をはっきりと観察できます。この方法は、侵入植物の根系におけるAMFのコロニー形成率を観察および計算するために、基本的な実験室で完了することができます。

概要

菌根菌は自然の生態系に蔓延しており、ほとんどの植物の根と共生関係を確立し、菌根1を形成します。植物は脂肪酸や糖などの光合成固定炭素化合物を提供して菌根菌の増殖をサポートし、菌類は宿主植物にリンや窒素などのミネラル栄養素を供給することで相互に反応し、それによって植物の成長を促進するため、これらの関連性は相互に有益です2。植物の根で形成された菌根型に基づいて、菌根菌は、外生菌根(ECM)菌、エリコイド菌根(ERM)菌、蘭菌根(ORM)菌、およびアーバスキュラー菌根(AM)菌1の4つの主要なタイプに分類できます。その中で、アーバスキュラー菌根菌(AMF)は最も広く分布しており、植物種の80%以上と菌根の関連を形成することができます3,4。

AMFは、土壌栄養循環5、植物栄養吸収6の改善、および植物の競争と繁殖の調節において重要な役割を果たします。それらは、侵入植物種の侵入の過程で重要な役割を果たします7,8。AMFは、Mucoromycota9門に分類され、250種10以上を網羅しています。AMFの異なる種と異なる植物との間の特定の共生関係は異なる場合があります。侵入植物種は、AMFの多様性を変化させ、成長および植民地化中の競争上の優位性に貢献するより優れた共生能力でAMF種の濃縮を促進する可能性を秘めています8,11,12,13。AMFの動態と外来植物種との相互作用を理解することは、植物の侵入とその生態学的影響の根底にあるメカニズムを理解するために不可欠です。

AMF種の定性的研究には、通常、主に2つの方法があります。1つは、湿式ふるい分けショ糖遠心分離などの方法を使用して土壌からAMF胞子を収集し、続いて胞子をその形態に基づいて分類および定量化するなどの形態学的同定です14。もう1つの方法は、AMF遺伝子の保存領域を増幅し、同定のためにそれらを配列決定する分子技術を含む15。ただし、これらの方法では、多くの場合、広範な形態学的同定の経験またはより高い財源が必要です。一方、AMFのコロニー形成率の定量的研究は、AMFの種や組成の変化を特定することはできませんが、AMFと植物の共生関係を包括的に評価することができます。このような研究は、基礎研究とその後の接種実験の検証作業の双方に欠かせません。

AMFのコロニー形成は、共存する植物種間の資源の分布を決定する上で重要な役割を果たします7。これは、AMFと宿主植物の根との間の共生関係の確立と強さを反映しています。同じ生息地では、侵入植物種は、在来植物と比較して高い定着率を示すことがよくあります16,17。このAMFのコロニー形成の強化は、Ambrosia artemisiifolia18、Solidago canadensis19、Sapium sebiferum20、Ageratina adenophora21、Sphagneticola trilobata22、Flaveria bidentis7などの侵入種への侵入の成功に貢献しています.外来植物の根におけるAMFの定着率を理解することは、これらの種の侵入成功の根底にある土壌微生物メカニズムを解明するための基礎となる基礎となる。侵入植物の根におけるAMFの定着率を調べることで、植物と微生物の相互作用の生態学的影響が明らかになり、植物の侵入を促進するメカニズムの理解に貢献します。

AMFのコロニー形成率の測定には、根の保存、清澄化、酸性化、染色、脱染色、顕微鏡検査などのいくつかのステップを含む染色顕微鏡技術が含まれます(補足図1)。過去数十年にわたり、研究者たちはAMFのさまざまな観察方法を模索し、さまざまな染色技術を開発してきました。初期段階では、トリパンブルー染色が広く使用されていました23,24。ただし、この方法にはトリパンブルーの毒性による制限があります。一方、酸性フクシン染色は、明るい色を提供し、信頼性が高く安定した染色結果を示す一般的に使用される方法です25。さらに、染色液は再利用できるため、費用対効果が向上します。コロニー形成率は、グリッドライン交差法を使用して決定され、他のアプローチと比較してより客観的な統計結果を提供します26。この方法は、そのシンプルさ、低コスト、および最小限の機器要件を特徴としているため、基本的な実験室環境での実施が可能です。これは、AMFのコロニー形成率を評価するための実用的でアクセス可能なアプローチを提供し、AMFと植物の根との間の共生関係の理解に貢献します。

プロトコル

私たちは、侵入植物 F.bidentis1 つと在来植物 Setaria viridis1つを使用して実験を行いました。どちらの植物も、中国河北省にある中国農業科学院(CAAS)の廊坊科学研究パイロット基地の実験圃場で栽培されました。各植物種は、各プロットのサイズが2 m x 3 mで、プロット間のギャップが1メートルの別々のプロットに個別に植えられました。植物は自然に成長するのを任せ、約2か月後に根のサンプルを採取しました。

1.根の準備と保存

  1. プロットごとに、生育条件が類似している3つの植物をランダムに選択します。シャベルで植物の周りの土をほぐし、植物をやさしく引き抜きます。根から土を振り落とした後、根系全体を切って実験室に持って行きます。収集した根のサンプルを流水で十分にすすぎ、同じプロット内の3つの植物の根を混合して1つの複製を形成します。
    注:運用プロセスの説明を容易にするために、このプロトコルは1つの生物学的複製の指示を提供します。実験結果の信頼性を確保するために、実際の操作では、実験デザインに従って少なくとも3つの生物学的複製からサンプルを収集することをお勧めします。
  2. 濾紙を使用して、きれいにした根から余分な水分を取り除き、自然乾燥させます。
  3. はさみを使用して損傷した根を切り取り、無傷の細い根を切り取り、保管のために保存するか、次の手順に進みます。2日以内に次のステップに進む場合は、4°Cの冷蔵庫で保管してください。 後で使用するためにルートサンプルを保存するには、ホルマリン-アセト-アルコール溶液(FAA、5 mL 38% ホルマリン + 5 mL + 90 mL 70% アルコール)などの固定溶液で保存します。
    注:FAA固定剤は必須ではありません。サンプルの数が少なく、収集後短期間で根を染色してカウントできる場合は、FAAの固定ステップをスキップして、根から土壌を洗い流した直後に進めてください。FAA固定剤を使用する場合は、ホルムアルデヒドが存在するため、換気の良い場所で操作が行われることを確認してください。

2. 根の染色

  1. 保存した根を保存溶液から取り出し、根をきれいにすすぎます。根を100mLのビーカーに入れ、約50mLの10%KOH(10 g KOH + 100 mLの水)溶液を加え、すべての根が溶液に完全に浸されていることを確認します。ビーカーを90°Cで30分間加熱します。
    注意: 根の成熟度に基づいて加熱時間を調整します。このステップにより、根から色素が取り除かれ、顕微鏡観察のために透明になります。
  2. ビーカーからKOH溶液を注ぎ、根のサンプルを水道水3x-6xで穏やかにすすいで、残っているKOHを取り除きます。余分な水を注ぎます。
    注意: 残留物があると次のステップで不完全な酸性化を引き起こし、酸フクシンの染色効果に影響を与える可能性があるため、ビーカーと使用するすべてのツールがKOH残留物を完全に除去されていることを確認してください。
  3. ビーカーに2%HCl溶液を加え、液体が根を完全に覆うようにします。根を室温の酸性溶液に10分間浸します。
  4. ビーカーからHCl溶液を捨て、約50 mLの0.01%酸性フクシン溶液(874 mLの乳酸、63 mLのグリセロール、63 mLの蒸留水、0.1 gの酸性フクシン)を加えます。根を90°Cで20〜60分間染色します。染色後、酸性フクシン溶液を回収し、将来の染色に再利用できます。
    手記： 染色時間は根の年齢や状態によって異なる場合があり、若くて柔らかい根は室温で一晩染色する必要がある可能性があります。

3. 脱染と顕微鏡検査

  1. 染色した根を約50mLの乳酸(85%)溶液に入れて、根細胞から酸性フクシンを取り除きます。分離処理により、AMF組織は赤く染色されますが、根細胞は無着色または淡赤色のままになります。中央の円柱が赤く見える場合があります。
  2. 200倍顕微鏡で根組織と真菌組織を観察し、明確な識別可能性を確認してから、脱染を止めます。AMFの構造と根細胞を明確に区別できれば、脱染色プロセスを完了することができます。
    注: ルートの成熟度に基づいて、保存時間を調整します。その過程で、カボチャの準備のためにいくつかの根を選択し、顕微鏡で観察します。
  3. 乳酸溶液から根を取り除き、約50mLのグリセロール(99%)溶液に移します。AMF構造細胞と根細胞の酸性フクシンは分離しなくなり、その後の顕微鏡検査に使用できます。
  4. スライドガラスの上にグリセロールを一滴垂らします。反復ごとに、30〜50個の根をランダムに選択し、各根から長さ1cmの根のセグメントを切り取ります。それらをグリセロールを含むスライドガラス上に、スライドの短辺と平行に配置し、互いに平行に配置します(補足図1)。各スライドに 10 個のルートセクションを配置し、各反復ごとに 3 〜 5 回の反復を行います。
    注:この手順では、各反復のテクニカル反復数を参照して、観測に使用されるルートセグメントの数について説明します。各サンプルで観察される根のセグメントの数は、植物種と根の形態に基づいて合理的に配置する必要があります。細い根の場合、サンプルごとに長さ1cmの30〜50個の根のセグメントを観察するだけで十分です。しかし、トウモロコシのような大きな根の場合は、観察数を適切に増やす必要があります。統計結果の信頼性を確保するために、各処理は少なくとも3つの生物学的複製を持つべきであり、各生物学的複製は前述の方法に従って操作されるべきである。
  5. カバースリップで覆います。カバースリップを置いた後は、根のこすれや変形を防ぐために、サンプルを水平方向にずらさないでください。これにより、菌糸の形態の正常な状態を干渉なく観察でき、コロニー形成率の計算の精度が維持されます。
  6. 200倍顕微鏡を使用して、クロスカウント法を採用し、概略図を参照してコロニー形成率を決定します(補足図2)。
    1. 顕微鏡の接眼レンズに十字線付きのマイクロメータを取り付けます。視野をルートの一方の端に移動し、十字線の 1 つをルートに平行に位置合わせします。もう一方の線が菌糸、アーバスキュール、または小胞と交差するかどうかを観察します。
    2. 視野をルート方向に沿ってもう一方の端に移動し、顕微鏡ステージの座標に基づいて毎回同じ距離を移動します。各視野の交点をバイナリアプローチ(0または1)を使用して記録します。もう一方の十字線が AMF 菌糸、アーバスキュール、または小胞と交差する場合、テーブルの対応するセルに 1 として記録されます。それ以外の場合は、0 として記録されます。AMF 構造体のいずれとも交差がない場合、負の領域に 1 として記録されます。各ルートセグメントについて10の視野を観測すると、スライドごとに合計100の観測結果が得られ、植物サンプルごとに300〜500の観測結果が得られます。

4. 植民地化率の計算

  1. 各スライドの 10 個の根に記録された菌糸 (H)、アーバスキュール (A)、小胞 (V)、および非菌根 (N) との交差数 ( 表 1 を参照) に基づいて、コロニー形成率を次のように計算します。

    菌糸のコロニー形成率=(A H / AT)×100%
    アーバスキュラーのコロニー形成率=(AA / A T)×100%
    水疱コロニー形成率=(AV / A T)×100%
    総定着率 = [(AT - AN) / AT] × 100%

    どこ：
    AH: 菌糸との交点の数
    AA:アーバスキュールとの交差点の数
    AV:小胞との交点の数
    A T: 交差点の総数
    A N: 非菌根根との交点の数

    これらの計算により、各構造 (菌糸、アーバスキュール、小胞) のコロニー形成率と、すべての構造のコロニー形成率の合計である全体的なコロニー形成率が得られます。
処遇滑る交差点の数
－菌糸アーバスキュール小 胞トータル
サンプル1スライド 1AN1A H1AA1AV1A T1
スライド 2AN2A H2AA2A V2A T2
スライド3AN3AH3AA3A V3A T3
トータルA NアHAAAVA T

表1:アーバスキュラー菌根菌のコロニー形成率の統計表。 略語:A H =菌糸との交差の数。AA = アーバスキュールとの交差点の数。AV = 小胞との交点の数。AT = 交差点の総数。AN = 非菌根根との交点の数。

結果

この方法を用いた侵入植物根の染色結果を 図1に示します。AMFの構造(菌糸、アーバスキュール、胞子、小胞)は赤く染色され、根皮質細胞は脱染色後に淡赤色に染色され、中央の円柱は赤色に染色されます。この染色結果は、AMFが主に植物の皮質に存在するため、真菌の構造を区別するのに十分です。染色結果から、アーバスキュール(A)、根治?...

ディスカッション

侵入植物とAMFの間の相互作用は複雑で多様です。これらの相互作用を研究することは、侵入植物の成功とその生態学的影響を理解するために重要です。それらは、植物の侵入能力、土壌生態系の構造と機能、および在来植物の競争力に影響を与える可能性があります。コロニー形成率は、侵入植物とAMFとの関係を研究するための重要な指標として機能します。共生関...

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、中国の国家重点研究開発プログラム(2021YFD1400100、2021YFC2600400、2022YFC2601100)と中国国家科学基金会(42207162)から資金提供を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
70% AlcoholShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdR433197
Acetic acid solutionShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA116166
Acid fuchsinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA104917
Formaldehyde solution, FormalinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdF111941
GlycerolShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdG116203
Hydrochloric acid, HClShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdH399657
Lactic acidShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdL432769
Manual System Microscope BX43Olympus (China) co., Ltd
Potassium hydroxide, KOHShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdP112284

参考文献

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