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Resumo

Este protocolo fornece uma abordagem simples e fácil de usar para determinar a taxa de colonização de fungos micorrízicos arbusculares (FMA) nas raízes de plantas invasoras.

Resumo

Os fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) são fungos de solo amplamente distribuídos nos ecossistemas e podem formar associações simbióticas (micorrizas) com as raízes da maioria das plantas terrestres. As plantas fornecem fontes de carbono para os FMAs por meio de associações micorrízicas, enquanto as hifas dos FMAs podem expandir a faixa de absorção de nutrientes pelas raízes e promover a absorção de nutrientes pelas plantas. Existem muitas espécies diferentes de FMA, e as relações simbióticas entre diferentes espécies de FMA e diferentes plantas variam. As plantas invasoras podem enriquecer as espécies de FMA com melhores capacidades simbióticas por meio de exsudatos radiculares, promovendo seu crescimento e, assim, aumentando sua colonização em raízes de plantas invasoras. Ao mesmo tempo, as plantas invasoras também podem interromper a relação simbiótica entre os FMA e as plantas nativas, afetando a comunidade vegetal local, que é um dos mecanismos para o sucesso da invasão de plantas. A taxa de colonização de FMA nas raízes de plantas invasoras e nativas reflete indiretamente o papel do FMA no processo de invasão de plantas invasoras. Neste método, as raízes das plantas coletadas podem ser processadas diretamente ou salvas em um fixador para posterior processamento em lote. Através do tratamento de descoloração, acidificação, coloração e descoloração das raízes, as hifas, esporos e estruturas arbusculares dos FMA no sistema radicular podem ser claramente observados. Este método pode ser concluído em um laboratório básico para observar e calcular a taxa de colonização de FMA nos sistemas radiculares de plantas invasoras.

Introdução

Os fungos micorrízicos são prevalentes em ecossistemas naturais e estabelecem relações simbióticas com as raízes da maioria das plantas, formando micorrizas1. Essas associações são mutuamente benéficas, pois as plantas fornecem compostos de carbono fixados fotossinteticamente, como ácidos graxos e açúcares, para apoiar o crescimento de fungos micorrízicos, enquanto os fungos retribuem fornecendo nutrientes minerais como fósforo e nitrogênio para as plantas hospedeiras, promovendo assim o crescimento das plantas2. Com base em seus tipos micorrízicos formados com raízes de plantas, os fungos micorrízicos podem ser divididos em quatro tipos principais: fungos ectomicorrízicos (ECM), fungos micorrízicos ericóides (ERM), fungos micorrízicos de orquídeas (ORM) e fungos micorrízicos arbusculares (AM)1. Dentre eles, os fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) têm a distribuição mais ampla e podem formar associações micorrízicas com mais de 80% das espécies de plantas 3,4.

Os FMA desempenham um papel crucial no aumento da ciclagem de nutrientes do solo5, melhorando a absorção de nutrientes pelas plantas6 e regulando a competição e a sucessão das plantas. Eles desempenham um papel importante no processo de invasão de espécies de plantas invasoras 7,8. Os FMAs, classificados no filo Mucoromycota9, englobam mais de 250 espécies10. As relações simbióticas específicas entre diferentes espécies de FMA e diferentes plantas podem variar. As espécies de plantas invasoras têm o potencial de alterar a diversidade de FMAs e promover o enriquecimento de espécies de FMAs com melhores capacidades simbióticas que contribuem para sua vantagem competitiva durante o crescimento e a colonização 8,11,12,13. Compreender a dinâmica dos FMA e suas interações com espécies de plantas invasoras é essencial para compreender os mecanismos subjacentes às invasões de plantas e seus impactos ecológicos.

Estudos qualitativos de espécies de FMA geralmente envolvem dois métodos principais. Uma é a identificação morfológica, como a coleta de esporos de FMA do solo usando métodos como peneiramento úmido e centrifugação de sacarose, seguida de classificação e quantificação dos esporos com base em sua morfologia14. O outro método envolve técnicas moleculares, amplificando regiões conservadas de genes de FMA e sequenciando-as para identificação15. No entanto, esses métodos geralmente requerem extensa experiência em identificação morfológica ou recursos financeiros mais altos. Por outro lado, estudos quantitativos das taxas de colonização de FMA, embora incapazes de determinar mudanças nas espécies e composição de FMA, ainda fornecem uma avaliação abrangente da relação simbiótica entre FMA e plantas. Tais estudos são indispensáveis tanto na pesquisa básica quanto no trabalho de validação subsequente para experimentos de inoculação.

A colonização de FMA desempenha um papel crucial na determinação da distribuição de recursos entre espécies de plantas coexistentes7. Reflete o estabelecimento e a força da relação simbiótica entre os FMA e as raízes das plantas hospedeiras. No mesmo habitat, as espécies de plantas invasoras geralmente exibem taxas de colonização mais altas em comparação com as plantas nativas16,17. Essa colonização aprimorada de FMA contribui para a invasão bem-sucedida de espécies invasoras, como Ambrosia artemisiifolia18, Solidago canadensis19, Sapium sebiferum20, Ageratina adenophora21, Sphagneticola trilobata22 e Flaveria bidentis7. Compreender a taxa de colonização de FMA nas raízes de plantas invasoras fornece uma base para desvendar os mecanismos microbianos do solo subjacentes à invasão bem-sucedida dessas espécies. Investigar a taxa de colonização de FMA em raízes de plantas invasoras lança luz sobre as implicações ecológicas das interações planta-micróbio e contribui para nossa compreensão dos mecanismos que impulsionam as invasões de plantas.

A determinação da taxa de colonização por FMA envolve uma técnica de microscopia de coloração, que inclui várias etapas: preservação radicular, clarificação, acidificação, coloração, descoloração e exame microscópico (Figura 1 suplementar). Nas últimas décadas, os pesquisadores exploraram vários métodos de observação para FMA e desenvolveram várias técnicas de coloração. Nos estágios iniciais, a coloração com azul de tripano foi amplamente utilizada 23,24. No entanto, este método tem limitações devido à toxicidade do azul de tripano. A coloração com fucsina ácida, por outro lado, é um método comumente usado que fornece cores brilhantes e mostra resultados de coloração confiáveis e estáveis25. Além disso, a solução de coloração pode ser reutilizada, tornando-a mais econômica. A taxa de colonização é determinada usando o método de interseção da linha de grade, que fornece resultados estatísticos mais objetivos em comparação com outras abordagens26. Este método é caracterizado por sua simplicidade, baixo custo e requisitos mínimos de equipamento, tornando-o viável para ser realizado em ambientes laboratoriais básicos. Ele oferece uma abordagem prática e acessível para avaliar a taxa de colonização de FMA e contribui para nossa compreensão das associações simbióticas entre FMA e raízes de plantas.

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Protocolo

Conduzimos experimentos usando uma planta invasora F. bidentis e uma planta nativa Setaria viridis. Ambas as plantas foram cultivadas em parcelas experimentais na Base Piloto de Pesquisa Científica de Langfang da Academia Chinesa de Ciências Agrícolas (CAAS), Hebei, China. Cada espécie de planta foi plantada individualmente em parcelas separadas, com cada parcela medindo 2 m x 3 m e um intervalo de 1 metro entre as parcelas. As plantas foram deixadas para crescer naturalmente e, após aproximadamente dois meses, amostras de raízes foram coletadas.

1. Preparação e preservação da raiz

  1. Para cada parcela, selecione aleatoriamente três plantas com condições de crescimento semelhantes. Afrouxe o solo ao redor das plantas com uma pá e puxe as plantas com cuidado. Depois de sacudir o solo das raízes, corte todo o sistema radicular e leve ao laboratório. Esfregue as amostras de raízes coletadas completamente em água corrente e misture as raízes de três plantas dentro da mesma parcela para formar uma réplica.
    NOTA: Para facilitar a descrição do processo operacional, este protocolo fornece instruções para uma réplica biológica. Para garantir a confiabilidade dos resultados experimentais, recomenda-se coletar amostras de pelo menos três réplicas biológicas de acordo com o planejamento experimental durante as operações reais.
  2. Use um papel de filtro para remover o excesso de umidade das raízes limpas e deixe-as secar ao ar.
  3. Use uma tesoura para aparar raízes danificadas, cortar raízes finas intactas e preservá-las para armazenamento ou prossiga para a próxima etapa. Se prosseguir com a próxima etapa dentro de 2 dias, armazene-os na geladeira a 4 °C. Para preservar as amostras de raízes para uso posterior, armazene-as em uma solução fixadora, como solução de formalina-aceto-álcool (FAA, 5 mL de formalina a 38% + 5 mL de ácido acético + 90 mL de álcool a 70%).
    NOTA: O fixador FAA NÃO é obrigatório. Se houver apenas um pequeno número de amostras e puder manchar e contar as raízes em um curto período após a coleta, pule a etapa de fixação da FAA e prossiga diretamente após a lavagem do solo das raízes. Ao usar o fixador FAA, certifique-se de que a operação seja realizada em uma área bem ventilada devido à presença de formaldeído.

2. Coloração das raízes

  1. Remova as raízes preservadas da solução de armazenamento e lave as raízes. Coloque as raízes em um béquer de 100 mL e adicione cerca de 50 mL de solução de KOH a 10% (10 g de KOH + 100 mL de água), certificando-se de que todas as raízes estejam completamente imersas na solução. Aquecer o copo a 90 °C durante 30 min.
    NOTA: Ajuste o tempo de aquecimento com base na maturidade das raízes. Esta etapa remove os pigmentos das raízes, tornando-as transparentes para observação microscópica.
  2. Despeje a solução de KOH do béquer e enxágue a amostra de raiz suavemente com água da torneira 3x-6x para remover qualquer KOH restante. Despeje o excesso de água.
    NOTA: Certifique-se de que o béquer e todas as ferramentas utilizadas estão completamente limpos de resíduos de KOH, pois quaisquer restos podem resultar em acidificação incompleta na próxima etapa, afetando assim a eficácia da coloração da fucsina ácida.
  3. Adicione uma solução de HCl a 2% ao copo, garantindo que o líquido cubra completamente as raízes. Deixe as raízes de molho na solução ácida em temperatura ambiente por 10 min.
  4. Descarte a solução de HCl do béquer e adicione cerca de 50 mL de solução de fucsina ácida a 0,01% (874 mL de ácido lático, 63 mL de glicerol, 63 mL de água destilada, 0,1 g de fucsina ácida). Pintar as raízes a 90 °C durante 20-60 min. Após a coloração, a solução de fucsina ácida pode ser recuperada e reutilizada para coloração futura.
    NOTA: O tempo de coloração pode variar dependendo da idade e condição das raízes, com raízes mais jovens e tenras potencialmente exigindo coloração durante a noite em temperatura ambiente.

3. Descoloração e microscopia

  1. Coloque as raízes coradas em cerca de 50 mL de solução de ácido lático (85%) para remover a fucsina ácida das células radiculares. O tratamento de separação resultará na coloração de vermelho dos tecidos do FMA, enquanto as células da raiz permanecem sem cor ou com cor vermelha clara. O cilindro central pode aparecer em vermelho.
  2. Observe os tecidos radiculares e fúngicos sob um microscópio de 200x para garantir uma distinção clara antes de interromper a descoloração. Quando a estrutura do FMA e as células radiculares puderam ser claramente distinguidas, o processo de descoloração pôde ser concluído.
    NOTA: Ajuste o tempo de descoloração com base na maturidade da raiz. Durante o processo, selecione algumas raízes para a preparação da abóbora para observar ao microscópio.
  3. Remova as raízes da solução de ácido lático e transfira-as para cerca de 50 mL de solução de glicerol (99%). A fucsina ácida na estrutura do FMA e nas células radiculares não se separará mais e poderá ser usada para exame microscópico subsequente.
  4. Coloque uma gota de glicerol em uma lâmina de vidro. Para cada replicação, selecione aleatoriamente 30-50 raízes, corte segmentos de raiz de 1 cm de comprimento de cada raiz. Disponha-os em lâminas de vidro com glicerol, paralelas ao lado mais curto da lâmina, e coloque-as paralelas umas às outras (Figura Suplementar 1). Coloque 10 seções de raiz em cada lâmina, resultando em 3 a 5 réplicas para cada réplica.
    NOTA: Esta etapa descreve o número de segmentos raiz usados para observação, referindo-se ao número de réplicas técnicas para cada réplica. O número de segmentos radiculares observados para cada amostra deve ser razoavelmente organizado com base na espécie vegetal e na morfologia radicular. Para raízes finas, é suficiente observar 30-50 segmentos de raízes, cada um com 1 cm de comprimento, por amostra. No entanto, para raízes maiores, como as do milho, é necessário aumentar o número de observações de forma adequada. Para garantir a confiabilidade dos resultados estatísticos, cada tratamento deve ter pelo menos 3 réplicas biológicas, e cada réplica biológica deve ser operada seguindo o método acima mencionado.
  5. Cubra com uma lamínula. Depois de colocar a lamínula, evite deslocar horizontalmente as amostras para evitar qualquer fricção ou deformação das raízes. Isso garante que o estado normal da morfologia das hifas possa ser observado sem interferência, mantendo assim a precisão dos cálculos da taxa de colonização.
  6. Usando um microscópio de 200x, empregue o método de contagem cruzada para determinar a taxa de colonização com referência ao diagrama esquemático (Figura Suplementar 2).
    1. Instale um micrômetro com mira na ocular do microscópio. Mova o campo de visão para uma extremidade da raiz e alinhe uma das miras paralelamente à raiz. Observe se a outra linha se cruza com as hifas, arbúsculos ou vesículas.
    2. Mova o campo de visão ao longo da direção da raiz para a outra extremidade, movendo a mesma distância todas as vezes com base nas coordenadas da platina do microscópio. Registre as interseções em cada campo de visão usando uma abordagem binária (0 ou 1). Se a outra mira se cruzar com hifas, arbúsculos ou vesículas de FMA, ela será registrada como 1 na célula correspondente da tabela. Caso contrário, ele será registrado como 0. Se não houver interseções com nenhuma das estruturas do AMF, ele será registrado como 1 na área negativa. Observe 10 campos de visão para cada segmento radicular, para um total de 100 observações são obtidas por lâmina, resultando em 300 a 500 observações por amostra de planta.

4. Cálculo da taxa de colonização

  1. Com base no número registrado de interseções com hifas (H), arbúsculos (A) e vesículas (V) e não micorrízicas (N) nas 10 raízes de cada lâmina (conforme mostrado na Tabela 1), calcule as taxas de colonização da seguinte forma:

    Taxa de colonização de hifas = (AH / AT) × 100%
    Taxa de colonização arbuscular = (AA / AT) × 100%
    Taxa de colonização vesicular = (AV / AT) × 100%
    Taxa de colonização total = [(AT - AN) / AT] × 100%

    Onde:
    AH: Número de interseções com hifas
    AA: Número de interseções com arbúsculos
    AV: Número de interseções com vesículas
    AT: Número total de interseções
    AN: Número de interseções com raízes não micorrízicas

    Esses cálculos fornecem as taxas de colonização para cada estrutura (hifas, arbúsculos e vesículas) e a taxa geral de colonização, que é a soma das taxas de colonização de todas as estruturas.
TratamentoDeslizarNúmero de cruzamentos
NegativoHifasArbúsculosVesículasTotal
Amostra 1Slide 1AN1AH1AA1AV1AT1
Slide 2AN2AH2AA2AV2AT2
Slide 3AN3AH3AA3AV3UmT3
TotalUmNAHUMAUmVUmT

Tabela 1: Tabela estatística das taxas de colonização de fungos micorrízicos arbusculares. Abreviaturas: AH = Número de interseções com hifas; AA = Número de interseções com arbúsculos; AV = Número de interseções com vesículas; AT = Número total de interseções; AN = Número de interseções com raízes não micorrízicas.

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Resultados

Os resultados da coloração das raízes das plantas invasoras usando este método são mostrados na Figura 1. As estruturas (hifas, arbúsculos, esporos e vesículas) do AMF são coradas de vermelho, as células do córtex radicular são coradas de vermelho claro após a descoloração e o cilindro central é corado de vermelho. Este resultado de coloração é suficiente para distinguir as estruturas fúngicas, pois o AMF existe principalmente no córtex d...

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Discussão

As interações entre plantas invasoras e FMA são complexas e diversas. Estudar essas interações é crucial para entender o sucesso das plantas invasoras e seus efeitos ecológicos. Eles podem influenciar a capacidade invasora das plantas, a estrutura e a função dos ecossistemas do solo e a competitividade das plantas nativas. A taxa de colonização serve como um indicador importante para estudar a relação entre plantas invasoras e FMA. Ele fornece uma medida quantitativa para es...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Programa Nacional de P&D da China (2021YFD1400100, 2021YFC2600400 e 2022YFC2601100) e pela National Science Foundation of China (42207162).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
70% AlcoholShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdR433197
Acetic acid solutionShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA116166
Acid fuchsinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA104917
Formaldehyde solution, FormalinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdF111941
GlycerolShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdG116203
Hydrochloric acid, HClShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdH399657
Lactic acidShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdL432769
Manual System Microscope BX43Olympus (China) co., Ltd
Potassium hydroxide, KOHShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdP112284

Referências

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